CN112461983B - 一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,属于生物检测领域。该方法采用高效液相色谱法‑电喷雾离子化串联质谱法(LC‑MS/MS)来检测双氯芬酸钠在皮肤样品中的浓度,其中皮肤样品经碱液浸泡后,采用乙腈作为沉淀溶剂;液相条件中流动相由0.1%的甲酸水和乙腈组成,梯度洗脱;甲苯磺丁脲作为双氯芬酸钠皮肤样品测定的内标。本发明所建立的巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的LC‑MS/MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2015年版以及NMPA 2014年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,属于生 物检测领域。
背景技术
双氯芬酸钠(Disclofenac sodium)为苯乙酸类衍生物,化学名称为2-[(2,6- 二氯苯基)氨基]苯乙酸钠,是最常用的非甾体抗炎药(NSAIDs)之一。由于其 胃肠道的不良反应限制了口服剂型的应用,非全身性给药途径成为给药的研究热 点。双氯芬酸依泊胺凝胶为主要用于肌肉、软组织和关节炎症治疗的外用制剂, 国外已上市,国内尚在研发中。双氯芬酸钠依泊胺凝胶局部给药后,在体内以双 氯芬酸钠的形式存在,其疗效与给药部位组织浓度有关。人与猪的皮肤组织结构 和生理学特点极为相似,巴马小型猪是评价经皮吸收药物的最优模型。猪皮肤样 本相对于其他组织样本,韧性大,较难匀浆,因此建立快速、易操作、专属性强 的测定巴马小型猪皮肤中双氯芬酸钠浓度的方法是十分必要的。
目前关于猪皮肤中双氯芬酸钠浓度的测定方法,国内尚未见文献报道;国外 仅有一篇文献(Skin permeability and pharmacokinetics of diclofenac epolamineadministered by dermal patch in Yorkshire-Landrace pigs,Journal of PainResearch, 2012:5 401-408)进行了报道,文献中皮肤样本处理方法为液-液萃取法:取皮肤 样本,加入适量的0.1mol/L NaOH溶液,于60℃烘箱中放置24h,匀浆后,加 入适量的0.1mol/L HCl溶液及内标,乙酸乙酯作为提取溶剂,提取后蒸干,用 0.1ml的50%二甲亚砜复溶。液相系统条件:5mmol/L甲酸铵溶液-甲醇(95︰5) (含0.01%甲酸)为流动相A,甲醇为流动相B,流动相A︰流动相B洗脱比例 为45︰55,等度洗脱。此文献方法灵敏度虽高,但样本处理方法较为繁琐,采 用液-液萃取法,乙酸乙酯作为提取溶剂,容易挥发,且具有低毒性;蒸干步骤 时间长,且操作中易引起交叉污染;流动相组成复杂。
对于双氯芬酸钠依泊胺凝胶局部给药后,皮肤中双氯芬酸钠的浓度相对较 高,因此在保证一定灵敏度的基础上,为推动国产自制双氯芬酸依泊胺凝胶的研 制以及上市,急需建立一种样品处理简单、分析时间短、方法特异性强的检测方 法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的 方法。
本发明的测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其包括采用高 效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱法即LC-MS/MS法来检测巴马小型猪皮肤 生物样品中双氯芬酸钠的浓度。
所述的测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法中皮肤样品称重 后,按比例加入0.1mol/L NaOH溶液,于60℃烘箱中放置一段时间后,放冷至 室温,匀浆;样品测定前预处理采用有机溶剂沉淀法;乙腈作为沉淀溶剂;液相 条件中流动相由0.1%甲酸水和乙腈组成,梯度洗脱;甲苯磺丁脲作为双氯芬酸 钠皮肤样品测定的内标。
本发明所述的巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其具体包括如 下步骤:
(1)皮肤样品处理:取皮肤样品称重后,按1︰4比例加入0.1mol/L NaOH 溶液,于60℃烘箱中放置24h后,放冷至室温,匀浆,作为待测液;
(2)测定前预处理:取20μL待测液,加入180μL内标乙腈溶液,涡旋2 min,4℃,13000r/min离心6min,取上清液,进样1μL进行LC-MS/MS分析。
(3)双氯芬酸钠采用高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱法的高通量测 定方法:取上述待测液1μL进行LC-MS/MS分析,其中液相系统条件为流动相: A相为0.1%甲酸水,B相为乙腈,梯度洗脱:0~0.5min 10%B,0.5~1.5min 10%→90%B,1.5~2.0min90%B,2.0~2.1min 90%→10%B;色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱(2.1×50mm,2.6μm);流速:0.4mL/min;柱温:45℃; 进样室温度:15℃;进样量:1.μL;样品检测时间:4min。
质谱系统条件为:AB SCIEX5500三重四级杆串联质谱系统;离子源:ESI 源;负离子模式;气帘气压力:35psi;碰撞气:8psi;离子化电压:5500psi; 离子源温度:550℃;喷雾气:55psi;辅助加热气:55psi;多重反应监测(MRM) 模式。
(4)双氯芬酸钠标准曲线的测定:取巴马小型猪空白皮肤匀浆液,加入双 氯芬酸钠标准系列溶液,配制成相当于双氯芬酸钠浓度为50,100,400,1000,2500,4000,5000ng/mL的皮肤标准样品,按步骤(2)所述的测定方法操作, 记录色谱图;以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标, 用加权最小二乘法(权重为1/x2)进行回归分析,确定双氯芬酸钠的皮肤样品标 准曲线及其定量限;所述的内标物为甲苯磺丁脲;
(5)巴马小型猪皮肤给药双氯芬酸钠依泊胺凝胶药代动力学试验:采用两 只巴马小型猪(♀,1只用于参比制剂,1只用于受试制剂),肌肉注射舒泰麻醉 后,用异氟烷维持麻醉,背部皮肤给药双氯芬酸依泊胺凝胶,分别于给药一段时 间后取皮肤样本,按照步骤(1)中的皮肤样品处理、步骤(2)测定前预处理和 步骤(3)中的高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱法(LC-MS/MS)的高通 量测定方法以及步骤(4)中所获得双氯芬酸钠标准曲线计算确定不同取样时间 的皮肤中双氯芬酸钠的浓度,并利用Phoenix WinNonlin8.1软件确定双氯芬酸钠 的体内药代动力学参数。
巴马小型猪皮肤样品的匀浆是巴马小型猪皮肤样品处理过程的关键。猪皮肤 样本相对于其他组织样本,韧性大,较难匀浆,本发明中皮肤样本加入适量的碱 液浸泡后,易于匀浆。在保证皮肤样本易于匀浆的同时,还要保证方法的灵敏度, 碱液的加入量过多,会造成皮肤样本中双氯芬酸钠浓度的稀释,因此皮肤样本与 碱液加入量的比例至关重要,本发明采用皮肤样本与0.1mol/L NaOH溶液按1 ︰4比例浸泡,既易于皮肤样本的匀浆,又保证了方法的灵敏度。
皮肤样品匀浆液的测定前预处理是保证LC-MS/MS法灵敏度的关键过程。 常见的处理方法包括蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液萃取法。本方法采用操作 相对简单,耗时又少的蛋白沉淀法去除皮肤样品匀浆液基质干扰;采用乙腈作为 沉淀溶剂,峰形好且能保证灵敏度,因此本发明采用乙腈为沉淀溶剂。
液相条件中流动相由0.1%甲酸水和乙腈组成,梯度洗脱,流动相组成简单; 采用C18 50mm短柱进行分析,单个样品的分析时间仅为4min,大大增加了分 析通量,提高了分析速度,有利于大批量样品的快速分析。
母离子/子离子离子对的选择是建立本发明中检测方法的关键。样品直接以 恒定流速由微量注射泵流入质谱仪时,负离子模式一级全扫描可见明显的[M-H]-母离子峰,m/z为296.10,二级碎片离子峰度最大的为m/z为252.10。改变CE 和DP的大小可明显影响峰强度,通过优化,确定本方法最优的CE为15v,DP 为90v。
内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要,理想的内标应为同位素标 记物或结构类似物。申请人在工作开展中发现,甲苯磺丁脲的LC-MS/MS检出 条件与双氯芬酸钠类似,并且预实验发现两者在此条件下出峰时间相近、无相互 干扰,峰形均好,因此本方法确定将甲苯磺丁脲作为双氯芬酸钠生物样品测定的 内标。
本发明所建立的测定巴马小型猪皮肤生物样品中的双氯芬酸钠的方法在准 确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药 典2015年版以及NMPA 2014年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指 导原则》对生物样品的分析要求。
附图说明
图1巴马小型猪空白皮肤色谱图(不同个体的巴马小型猪)
图2巴马小型猪空白皮肤中加入双氯芬酸钠及内标处理后检测得到的色谱 图(双氯芬酸钠峰)
图3巴马小型猪空白皮肤中加入双氯芬酸钠及内标处理后检测得到的色谱 图(甲苯磺丁脲峰)
图4巴马小型猪皮肤双氯芬酸钠的标准曲线图
具体实施方式
为了使本领域技术人员更清楚地了解本发明,申请人对本发明所述一种测定 巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法进一步描述如下,其中检测方法的 方法学考察以巴马小型猪皮肤样本为例,具体实施以巴马小型猪皮肤给药双氯芬 酸依泊胺凝胶药代动力学实验为例,但本领域技术人员应能知晓,所述的进一步 阐述和举例并不以任何方式限定本发明的专利保护范围。
实施例1 本发明检测方法的方法学考察
一、标准溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制
精密称定双氯芬酸钠适量,加50%甲醇溶解并定量稀释制成1mg/mL的标 准储备液。精密量取适量标准储备液,用80%乙腈梯度稀释,配制浓度分别为 0.05,0.1,0.4,10,25,40,50μg/mL的标准系列溶液。
(2)内标溶液的配制
精密称定甲苯磺丁脲适量,加乙腈溶解并定量稀释制成10mg/mL的甲苯磺 丁脲储备液。精密量取适量储备液,用乙腈逐步稀释得浓度为200ng/mL的内标 乙腈溶液。
(3)标准质控溶液的配制
精密称定双氯芬酸钠适量,加50%甲醇溶解并定量稀释制成1.0mg/mL的标 准质控储备液。精密量取适量标准质控储备液,用80%乙腈梯度稀释,配制浓度 分别为0.1,40,50μg/mL的标准系列溶液。
各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。
二、分析方法的确证
(1)方法的专属性
取6个不同来源巴马小型猪空白皮肤匀浆液各20μL,除用乙腈代替内标溶 液外,其余按“皮肤样品预处理”项下方法操作,获得空白基质色谱图,如图1 所示;将一定浓度的双氯芬酸钠对照品溶液和内标溶液加入空白皮肤匀浆液中, 依法操作,获得相应的色谱图,如图2-图3所示。其中双氯芬酸钠的保留时间 为2.17min,甲苯磺丁脲的保留时间为1.96min;结果表明,皮肤中内源性物质 不干扰测定。
(2)标准曲线和线性范围
取巴马小型猪空白皮肤匀浆液20μL,依次加入双氯芬酸钠标准系列溶液, 配制成相当于双氯芬酸钠浓度为50,100,400,1000,2500,4000,5000ng/mL 的模拟皮肤样品,按“皮肤样品预处理”项下操作。以待测物浓度为横坐标,待 测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权最小二乘法(权重为1/x2)进行回 归分析。典型皮肤样品标准曲线为Y=0.00822+0.00104X,r=0.9983;定量下限 (LLOQ)为50ng/mL。
(3)精密度和准确度
取巴马小型猪空白皮肤匀浆液20μL,按照“标准皮肤样品的配制”项下方 法,配制低(100ng/mL)、中(4000ng/mL)、高(5000ng/mL)三个浓度的质 量控制(QC)样品。按“皮肤样品预处理”项下操作,每一浓度进行6样本分 析,连续测定3天,随行标准曲线。根据当日标准曲线计算QC样品的浓度,结 果进行方差分析,求得方法的精密度RSD和准确度RE,双氯芬酸钠的日间RSD ≤9%,日内≤7%,RE在-10.3%~8.9%之间。
(4)基质效应
使用6个不同来源的巴马小型猪空白皮肤匀浆液,配制低(100ng/mL)、中(4000ng/mL)、高(5000ng/mL)三个浓度水平进行基质效应考察。
样品A:取巴马小型猪空白皮肤匀浆液40μL,加入360μL乙腈,涡旋2min, 4℃,13000r/min离心6min,作为提取后空白皮肤基质;取189μL以上上清 液,加入2μL双氯芬酸钠质控工作液(0.1,40,50μg/mL)和9μL甲苯磺丁脲 乙腈溶液(4μg/mL),涡旋2min,4℃,13000r/min,离心6min,进样1μL 进行LC-MS/MS分析。
样品B:取189μL纯化水,加入2μL双氯芬酸钠质控工作液(0.1,40,50 μg/mL)和9μL甲苯磺丁脲乙腈溶液(4μg/mL),涡旋2min,4℃,13000r/min, 离心6min,进样1μL进行LC-MS/MS分析。
通过计算样品A的峰面积(由空白基质提取后加入分析物和内标测得),与 样品B的相应峰面积(分析物和内标的纯溶液)比值,计算分析物和内标的基 质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子,计算经内标归一化 的基质因子,考察基质效应。
结果表明双氯芬酸钠低、中、高浓度的基质效应变异系数均小于15%。因此 本试验选择的色谱和质谱条件下,可忽略基质效应对双氯芬酸钠测定的影响。
(5)提取回收率
样品C:按照“标准皮肤样品的配制”项下配制高、中、低浓度水平的质控 样品,采用“皮肤样品预处理”的方法进行皮肤样品处理,进行LC-MS/MS分 析。
样品C测得的双氯芬酸钠峰面积与相应浓度的样品A测得的双氯芬酸钠峰 面积比即为双氯芬酸钠的提取回收率。
结果表明双氯芬酸钠低、中、高三个浓度的提取回收率均在77%,78%和 81%。
(6)样品稳定性
本专利考察了未处理的皮肤样品室温放置4h的稳定性,皮肤样品处理后进 样室(15℃)放置43h的稳定性,皮肤样品经过3次冷冻-解冻循环的稳定性, 未处理的皮肤样品长期冷冻放置49d的稳定性。每一项稳定性考察时,按“标 准曲线和线性范围”项下配制低、中、高三个浓度的QC样品,每一浓度进行6 样本分析,照“皮肤样品预处理”项下操作,测得样品浓度,计算相对误差(RE%)。 结果表明未处理的皮肤样品室温放置4h稳定,皮肤样品处理后进样室(15℃) 放置43h稳定,皮肤样品经过3次冷冻-解冻循环后稳定,未处理的皮肤样品长 期冷冻放置49d稳定。
(7)皮肤样品预处理
取皮肤样品称重后,按1︰4比例加入0.1mol/L NaOH溶液,于60℃烘箱中 放置24h后,放冷至室温,匀浆,作为待测液;取20μL待测液,加入180μL 内标乙腈溶液,涡旋2min,4℃,13000r/min离心6min,取上清液,进样1μL 进行LC-MS/MS分析。
实施例2 双氯芬酸依泊胺凝胶巴马小型猪药代动力学预实验方法
取体重约30kg的巴马小型猪2只,肌肉注射舒泰麻醉后,用异氟烷维持麻 醉,1只皮肤给药双氯芬酸钠依泊胺凝胶参比制剂,另1只皮肤给药双氯芬酸钠 依泊胺凝胶受试制剂,给药量均为3g,分别于0.5,2,4,7,9,11,24,32h 取皮肤样本,置于-20℃冰箱中待测定。
测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠采用高效液相色谱法-电喷雾离 子化串联质谱法(LC-MS/MS)的高通量测定方法。具体为:
1、实验材料和仪器
双氯芬酸钠(批号:100334-201803,含量:100.0%),中国食品药品检定研 究院提供;甲苯磺丁脲(批号:#H1401054,含量:≥99%),上海阿拉丁生化科 技股份有限公司;乙腈(色谱纯),赛默飞世尔科技有限公司;甲醇(色谱纯), 赛默飞世尔科技有限公司;甲酸(色谱纯),天津市科密欧化学试剂有限公司; 氢氧化钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;超纯水,Advantage A10 Milli-Q 超纯水仪制备;双氯芬酸钠依泊胺凝胶,参比制剂;双氯芬酸钠依泊胺凝胶,受 试制剂。
液相色谱系统:SCIEX Exion型液相色谱系统,美国SCIEX公司;MS/MS 系统:SCIEXExion LC-TQ5500三重四级杆串联质谱系统,美国SCIEX公司;AUW-120D型电子分析天平,梅特勒-托利多常州衡器有限公司;LE203E/02型 电子分析天平,梅特勒-托利多常州衡器有限公司;Sorvall 21R高速冷冻离心机, 美国赛默飞世尔科技公司生产;Vortex-3型漩涡混匀器,德国IKA公司生产;S10 型手提式高速分散器,宁波新芝生物科技股份有限公司;Milli-Q Advantage A10 超纯水仪,默克化学技术(上海)有限公司;GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Sartorius 2-20μL移液器,百得实验室仪器(苏 州)有限公司;Sartorius 10-100μL移液器,百得实验室仪器(苏州)有限公司; Thermo20-200μL移液器,济南兴诺科技发展有限公司;Sartorius 100-1000μL 移液器,百得实验室仪器(苏州)有限公司;Sartorius 500-5000μL移液器,百 得实验室仪器(苏州)有限公司。
2、液质条件及皮肤样本处理
液相条件:流动相:A相为0.1%甲酸水,B相为乙腈,梯度洗脱:0~0.5min 10%B,0.5~1.5min 10%→90%B,1.5~2.0min 90%B,2.0~2.1min 90%→10%B; 色谱柱为Thermo Thermo Accucore C18色谱柱(2.1×50mm,2.6μm);流速: 0.4mL/min;柱温:45℃;进样室温度:15℃;进样量:1.μL;样品检测时间: 4min。
质谱条件:AB SCIEX5500三重四级杆串联质谱系统;离子源:ESI源;负 离子模式;气帘气压力:35psi;碰撞气:8psi;离子化电压:5500psi;离子源 温度:550℃;喷雾气:55psi;辅助加热气:55psi;多重反应监测(MRM)模 式;检测离子:m/z 296.10→m/z 252.10(双氯芬酸,CE为15v,DP为90v), m/z 269.10→m/z 170.10(甲苯磺丁脲,CE为50v,DP为120v)。
皮肤样本处理:皮肤称重后,按1:4比例加入0.1mol/L NaOH溶液,于60℃ 烘箱中放置24h后,放冷至室温,匀浆,作为待测液;取20μL待测液,加入 180μL内标乙腈溶液,涡旋2min,4℃,13000r/min离心6min,取上清液, 进样1μL进行LC-MS/MS分析。
3、实验结果
检测2只巴马小型猪(1只用于参比制剂,1只用于受试制剂)背部皮肤给 药后0.5h,2h,4h,7h,9h,11h,24h,32h的皮肤生物样本中双氯芬酸钠的浓 度,见表1。
表1.巴马小型猪皮肤给药后皮肤样本中双氯芬酸钠浓度
采用Phoenix WinNonlin8.1药代软件对所测数据进行分析,得到主要的药代 动力学参数,结果显示,皮肤给药双氯芬酸依泊胺凝胶后,参比制剂的Tmax为 24h,Cmax为2362.40ng/g,AUC(0-32h)为56004ng·h/g,受试制剂的Tmax为11h, Cmax为2065.13ng/g,AUC(0-32h)为46951ng·h/g,采用F=AUC(T)/AUC(R)×100% 初步计算受试制剂的F值(相对生物利用度)为84%。
总体上讲,本发明建立并验证了定量检测巴马小型猪皮肤样品中双氯芬酸钠 的LC-MS/MS方法,方法的特异性、重现性和准确性均符合药代动力学研究的 要求,其中该方法学的定量限为50ng/mL,最低检测浓度满足Cmax的1/10(中 国药典2015年版要求至少检测到Cmax的1/10),保证了双氯芬酸依泊胺凝胶皮 肤给药后皮肤中双氯芬酸钠浓度的测定,从而保证了提取的药动学参数精确可 靠。双氯芬酸依泊胺凝胶巴马小型猪药代动力学预实验初步得到了受试制剂的F 值为84%,可初步判断受试制剂和参比制剂在皮肤中的暴露量基本一致。本方法 的建立也进一步推动了国产自制双氯芬酸依泊胺凝胶的研制以及上市。
Claims (7)
1.一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
(1)皮肤样品处理:取皮肤样品称重后,按1︰4比例加入0.1mol/L NaOH溶液,于60℃烘箱中放置24h后,放冷至室温,匀浆,作为待测液;取待测液加入内标乙腈溶液,涡旋后离心,取上清液进行LC-MS/MS分析;所述的内标为甲苯磺丁脲;
(2)采用LC-MS/MS法检测双氯芬酸钠在皮肤样品中的浓度:
所用的液相系统条件为:流动相为0.1%甲酸水和乙腈,梯度洗脱;质谱系统采用ESI源,负离子扫描模式。
2.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,皮肤样品处理时取20μL待测液,加入180μL内标乙腈溶液,涡旋2min,4℃,13000r/min离心6min,取上清液,进样1μL进行LC-MS/MS分析。
3.如权利要求2所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,所述的内标乙腈溶液为200ng/mL的甲苯磺丁脲乙腈溶液。
4.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,LC-MS/MS法中液相系统条件为流动相:A相为0.1%甲酸水,B相为乙腈,梯度洗脱;0~0.5min 10%B,0.5~1.5min 10%→90%B,1.5~2.0min 90%B,2.0~2.1min 90%→10%B。
5.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,LC-MS/MS法中液相系统条件为色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱(2.1×50mm,2.6μm);流速:0.4mL/min;柱温:45℃;进样室温度:15℃;进样量:1.μL;进样时间:4min。
6.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,LC-MS/MS法中质谱系统条件为:AB SCIEX5500三重四级杆串联质谱系统;离子源:ESI源;负离子模式;气帘气压力:35psi;碰撞气:8psi;离子化电压:5500psi;离子源温度:550℃;喷雾气:55psi;辅助加热气:55psi;多重反应监测(MRM)模式。
7.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法,其特征在于,双氯芬酸钠的m/z母离子→子离子为296.10→252.10,CE(碰撞能)为15v,DP(去簇电压)为90v;甲苯磺丁脲的m/z母离子→子离子为269.10→170.10,CE为50v,DP为120v。
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