CN108445129A

CN108445129A - 生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法

Info

Publication number: CN108445129A
Application number: CN201810175931.3A
Authority: CN
Inventors: 刘希望; 杨亚军; 李剑勇; 郭玉凡; 路晓荣; 孔晓君; 李世宏; 焦增华; 秦哲
Original assignee: Zhengzhou Bary Animal Pharmaceutical Co ltd; Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Zhengzhou Bary Animal Pharmaceutical Co ltd; Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2018-08-24

Abstract

本发明提供生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法，将待测生鲜牛奶样品和系列浓度标准溶液分别进行提取，提取以乙腈和乙酸铵为提取试剂，将提取所得溶液净化后，使用流动相进行洗脱，进行液相色谱‑串联质谱检测，根据待测生鲜牛奶样品和系列浓度标准溶液的测定结果，定性或定量测定待测生鲜牛奶中的残留双氯芬酸钠；待测生鲜牛奶样品是在待测生鲜牛奶中加入同位素内标得到的；系列浓度标准溶液是在空白生鲜牛奶中加入双氯芬酸钠系列标准工作溶液和同位素内标得到的。本发明的内标为双氯芬酸钠(乙酰苯环¹³C)同位素标记物，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足定性、定量检测生鲜牛奶中双氯芬酸钠残留量的要求，方法简单，结果准确可靠。

Description

生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法

技术领域

本发明属于药物残留检测技术领域，具体涉及生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法。

背景技术

双氯芬酸钠(diclofenac sodium，CAS 15307-79-6)作为苯乙酸类衍生物，系非甾体解热镇痛抗炎药，在欧盟已被批准用于猪和牛，国内也已批准用于猪，即将批准用于牛，推荐剂量为2.5mg/kg，肌内注射，推荐治疗周期为1～3d。欧盟规定(2009)双氯芬酸钠在牛奶中的残留标识物为双氯芬酸，残留限量(MRLs)为0.1μg/kg。为了有效地检测牛奶中该药物的残留量，急需开发一个准确、高效和简便的分析方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确、高效和简便的生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法。

本发明提供生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法，将待测生鲜牛奶样品和系列浓度标准溶液分别进行提取，所述提取以乙腈和乙酸铵为提取试剂，将提取所得溶液净化后，使用流动相进行洗脱，进行液相色谱-串联质谱检测，根据待测生鲜牛奶样品和系列浓度标准溶液的测定结果，定性或定量测定待测生鲜牛奶中的残留双氯芬酸钠；

所述待测生鲜牛奶样品是在待测生鲜牛奶中加入同位素内标得到的；

所述系列浓度标准溶液是在空白生鲜牛奶中加入双氯芬酸钠系列标准工作溶液和同位素内标得到的。

作为优选，所述同位素内标为双氯芬酸钠13C同位素标记物。

作为优选，所述乙腈和乙酸铵的加入量为：每10.0±0.5g生鲜牛奶中加入10mL乙腈及1g乙酸铵。

作为优选，色谱分离时，流动相为乙腈-水-甲酸，等度洗脱，流速0.4ml/min，柱温35℃，进样量20μl；所述乙腈-水-甲酸的体积比为55：45：0.1。

作为优选，所述串联质谱检测的条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管电压为+4000V，电子倍增器电压增加值为+300V，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min，进行多重离子反应监测。

本发明使用双氯芬酸钠(乙酰苯环¹³C)同位素标记物内标，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足生鲜牛奶中双氯芬酸钠的定性、定量检测要求；样品前处理简单，检测结果准确可靠。生鲜牛奶中双氯芬酸钠的添加量分别为0.03μg/kg和0.05μg/kg，双氯芬酸钠定量离子的信噪比SNR分别大于3和5(按照峰高对峰高计)，表明方法的检测限和定量限分别可至0.03μg/kg和0.05μg/kg。生鲜牛奶中添加不同量的双氯芬酸钠，方法的平均回收率均在85％～110％的范围内，批内和批间的变异系数均小于15％。具体可参见实施例中的实验分析。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为生鲜牛奶中双氯芬酸钠(0.1μg/kg，即MRL)的检测色谱图；其中a为总离子流色谱图，保留时间为2.30min的色谱峰即为待测化合物；b中保留时间为2.29min的色谱峰为双氯芬酸钠的定量离子，c中保留时间为2.30min的色谱峰为内标双氯芬酸钠(乙酰苯环¹³C)同位素标记物的定量离子。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

一、色谱分离和质谱检测条件

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈(3.0mm×50mm，1.8μm)；流动相为乙腈-水-甲酸(体积比为55：45：0.1)，等度洗脱，流速0.4ml/min，柱温35℃，进样量20μl，运行时间6min，两次进样之间的平衡时间为3min。

采用串联三重四极杆质谱作为检测器，离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管电压为+4000V，电子倍增器电压增加值(Delta EMV)为+300V，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min(N₂)，进行多重离子反应监测(MRM)，具体参数见表1。

表1MRM参数及特征离子对

注：*，为定量离子。

二、生鲜牛奶样品中双氯芬酸钠的提取与净化

1.提取

称取均质后的生鲜牛奶10.0±0.5g于50mL离心管中，加入100μL内标溶液即双氯芬酸钠(乙酰苯环¹³C)同位素标记物标准工作溶液(50ng/mL)，高速涡旋1min，静置10min后，加入10mL乙腈及1g乙酸铵，高速涡旋2min，4℃条件下4500g离心20min，收集上清液。

2.净化

取步骤1得到的上清液转入15mL带盖聚丙烯离心管中，加入用乙腈饱和过的正己烷3mL，涡旋混匀1min，4℃条件下4500g离心10min，弃去上层正己烷和下层的水相；将乙腈提取液于50℃条件下浓缩至干，得到净化产物。

3.检测

在步骤2得到的净化产物中加入200μL流动相，涡旋振荡并水浴超声，使残渣完全溶解，经孔径为0.22μm的滤膜过滤后，得样品滤液，按照步骤一中的方法上机进行检测。生鲜牛奶中双氯芬酸钠的添加量为0.1μg/kg(即MRL)时的检测色谱图见图1。

图1为生鲜牛奶中双氯芬酸钠(0.1μg/kg，即MRL)的检测色谱图；其中a为总离子流色谱图，保留时间为2.30min的色谱峰即为待测化合物；b中保留时间为2.29min的色谱峰为双氯芬酸钠的定量离子，c中保留时间为2.30min的色谱峰为内标双氯芬酸钠(乙酰苯环13C)同位素标记物的定量离子。

三、检测限和定量限

实验1检测限

添加双氯芬酸钠含量为3ng/mL的标准溶液100μL于10g空白生鲜牛奶中，涡旋混匀，即双氯芬酸钠的添加量为0.03μg/kg，按照步骤二所述方法添加内标溶液并处理样品，按照步骤一中方法上机检测。共重复5次。

实验结果空白生鲜牛奶中的双氯芬酸钠添加量为0.03μg/kg时，按照前述方法提取、净化后测定，双氯芬酸钠定量离子的信噪比SNR均大于3(按照峰高对峰高计)，表明方法的检测限可至0.03μg/kg。

实验2定量限

添加双氯芬酸钠含量为5ng/mL的标准溶液100μL于10g空白生鲜牛奶中，涡旋混匀，即双氯芬酸钠的添加量为0.05μg/kg，按照步骤二所述方法添加内标溶液并处理样品，按照步骤一中方法上机检测。共重复5次。

实验结果空白生鲜牛奶中的双氯芬酸钠添加量为0.05μg/kg时，按照前述方法提取、净化后测定，双氯芬酸钠定量离子的信噪比SNR均大于5(按照峰高对峰高计)，表明方法的定量限可至0.05μg/kg。

四、标准曲线的建立

分别称取均质后的空白生鲜牛奶10.0±0.5g，于50mL离心管中，分别加入5、10、20、50、100、200和500ng/mL的双氯芬酸钠系列标准工作溶液100μL，使空白生鲜牛奶中双氯芬酸钠的添加量分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0μg/kg；再按照步骤二所述方法添加内标溶液并处理样品，按照步骤一中方法上机检测。

在本发明中，“空白生鲜牛奶”是指不含有双氯芬酸钠的生鲜牛奶。

以双氯芬酸钠特征离子质量色谱峰面积对双氯芬酸钠¹³C同位素标记物(内标)特征离子质量色谱峰面积的比值为纵坐标，空白生鲜牛奶加标后被测物双氯芬酸钠的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

共重复5次，绘制5条标准曲线。标准曲线、线性范围、相关系数见表2。结果表明生鲜牛奶中双氯芬酸钠在0.05～5μg/kg的浓度范围内线性关系良好。

表2标准曲线、线性范围及相关系数

五、添加回收检测实验

称取空白生鲜牛奶各10g，分别添加浓度为5、10、20、50和500ng/mL的双氯芬酸钠标准工作液各100μL，使得双氯芬酸钠在空白生鲜牛奶中的浓度分别为0.05(LOQ，0.5MRL)、0.1(MRL)、0.2(2MRL)、0.5和5.0ng/g；再按照步骤二所述方法添加内标溶液并处理样品；同时依据步骤四中的方法，绘制空白基质匹配的标准曲线，将实测数据(峰面积比)代入标准曲线计算被测物浓度。每一浓度分别重复5次。回收率的计算公式为：

回收率＝C_测÷C_添×100％

注：式中C_测为空白生鲜牛奶中双氯芬酸钠的检出浓度；C_添为空白生鲜牛奶中双氯芬酸钠的实际添加浓度。

实验结果空白生鲜牛奶中双氯芬酸钠的添加浓度分别为0.05(LOQ、0.5MRL)、0.1(MRL)、0.2(2MRL)、0.5和5.0μg/kg时，添加回收率测定结果见表3。

表3添加回收率试验结果

六、精密度测定

称取空白生鲜牛奶各10g，分别添加浓度为5、10、20、50和500ng/mL的双氯芬酸钠标准工作液各100μL，制得双氯芬酸钠在牛奶中的浓度分别为0.05(LOQ，0.5MRL)、0.1(MRL)、0.2(2MRL)、0.5和5.0ng/g的空白添加样品；每个浓度制备5个平行样。再按照步骤二所述方法添加内标溶液，并处理样品；同时依据步骤四中的方法，绘制空白基质匹配的标准曲线，将实测数据(峰面积比)代入标准曲线计算被测物浓度。

连续3天，每天重新制备上述不同浓度的空白添加样品，依据前述方法处理并检测，分别计算方法的日内和日间精密度，以RSD表示。

实验结果空白生鲜牛奶中双氯芬酸钠的添加浓度分别为0.05(LOQ、0.5MRL)、0.1(MRL)、0.2(2MRL)、0.5和5.0μg/kg时，日内和日间精密度试验结果见表4。

表4生鲜牛奶中双氯芬酸钠检测的日内和日间精密度试验结果

七、测定

1.定性测定

(1)制备系列浓度标准溶液

分别称取均质后的空白生鲜牛奶10.0±0.5g，于50mL离心管中，分别加入5、10、20、50、100、200和500ng/mL的双氯芬酸钠系列标准工作溶液100μL，使空白生鲜牛奶中双氯芬酸钠的添加量分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0μg/kg。

(2)将待测生鲜牛奶进行均质。

(3)将步骤(1)和步骤(2)所得产品均按照步骤二所述方法添加内标溶液并处理样品，按照步骤一中方法上机检测。

在仪器最佳工作条件下，被测组分选择1个母离子和2个特征子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±2.5％之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度，与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表5规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。

表5液相色谱-串联质谱定性时相对离子丰度最大允许偏差

2.定量测定

(1)制备系列浓度标准溶液

(2)将待测生鲜牛奶进行均质。

在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和相应的空白基质匹配的标准工作溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。

样品溶液中待测物的响应值均应在标准曲线测定的线性范围内，对于检测浓度超过标准曲线浓度范围的样品，以空白生鲜牛奶进行适当稀释后，再行添加内标，并进行相应的前处理及检测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.生鲜牛奶中残留双氯芬酸钠的检测方法，其特征在于：将待测生鲜牛奶样品和系列浓度标准溶液分别进行提取，所述提取以乙腈和乙酸铵为提取试剂，将提取所得溶液净化后，使用流动相进行洗脱，进行液相色谱-串联质谱检测，根据待测生鲜牛奶样品和系列浓度标准溶液的测定结果，定性或定量测定待测生鲜牛奶中的残留双氯芬酸钠；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述同位素内标为双氯芬酸钠¹³C同位素标记物。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述乙腈和乙酸铵的加入量为：每10.0±0.5g生鲜牛奶中加入10mL乙腈及1～2g乙酸铵。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：色谱分离时，流动相为乙腈-水-甲酸，等度洗脱，流速0.4ml/min，柱温35℃，进样量20μl；所述乙腈-水-甲酸的体积比为55：45：0.1。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述串联质谱检测的条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管电压为+4000V，电子倍增器电压增加值为+300V，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min，进行多重离子反应监测。