CN104807914A - 同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法旨在提供一种操作简便、准确、快速，能实现固体保健食品中17种非法添加化学物的同时分析，可用于辅助改善记忆类保健食品中非法添加化学药品的定性筛查和定量检测；其技术方案是这样的：该方法依次包括下述步骤：1)标准溶液的制备；2)标准工作曲线；3)样品前处理；4)净化；属于医药检测技术领域。

Description

同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法

技术领域

本发明涉及一种医药非法添加品的测定，具体地说，是涉及一种同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法，属于医药检测技术领域。

背景技术

目前我国已批准的保健食品的保健功能有减肥、缓解体力疲劳、辅助降血脂、辅助降血压、辅助降血糖、辅助改善记忆力等27种,近年来，随着社会竞争压力的不断增大和老年化社会的扩大，辅助改善记忆力类保健品正步入人们的学习、工作和生活中，常见功能有改善记忆力、补充大脑营养等。“辅助改善记忆”的保健功能主要通过补充大脑正常运行所必须的物质、增加大脑细胞对氧气的利用、提供能够促进脑部新陈代谢排出的物质等功效。然而不法商家为了使保健品起效快，以达到增加销售量目的，会在保健品中非法添加化学药物，但化学药物的副作用往往会严重影响人们的身体健康。

目前用于辅助改善记忆力类保健食品非法添加的筛查方法较少，同时检测多种非法添加药物的方法更是少之又少。因此，针对此类保健食品中潜在的、可能添加化学药物建立一种有效的、准确的检测方法，预防辅助改善记忆类保健食品进入市场后导致的不良事件发生，确保其安全性。本研究依据相关发明通过对17种促智类化学药品(多奈哌齐、石杉碱甲、依达拉奉、倍他司汀、烟酸占替诺、吡拉西坦、加兰他敏、咖啡因、茴拉西坦、氟马西尼、雌三醇、氟桂利嗪、萘普生、己烯雌酚、尼莫地平、阿米三嗪、双氯芬酸钠)建立高效液相色谱分析方法，应用于改善记忆力类保健食品中非法添加化学药物的筛查。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法，该方法操作简便、准确、快速测定固体保健食品中17种非法添加化学物的同时分析，可用于辅助改善记忆类保健食品中非法添加化学药品的定性筛查和定量检测。

本发明提供的的技术方案是这样的：

一种同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法，依次包括下述步骤：

1)标准溶液的制备

分别精密称取17种标准物质适量，加40％甲醇水溶液使成浓度为0.2mg/mL，检测17种化学药物单标色谱和混标色谱图；

2)标准工作曲线

取标准溶液适量加40％甲醇水溶液，分别配制成40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，作为标准工作曲线溶；

3)样品前处理

称取相当于一次口服剂量，置于100mL锥形瓶中，精密加入50mL 40％甲醇水溶液，称其重量，超声提取30分钟，冷却，用40％甲醇-水溶液补足重量，过滤，滤液待用；

4)净化

精密量取上述滤液2mL以约1mL/min流速通过C18-SPE柱，用3mL 40％甲醇-水洗脱，合并流出液与洗脱液，用0.22μm有机滤膜过滤即得待测样品；

其中，所述色谱条件为：

色谱柱：Thermo AccliaimTM Mixed-Mode WCX-1柱；流动相：A：水；B：100mmol/L磷酸二氢钠缓冲盐，pH 6.4；C:乙腈；梯度洗脱程序：0～10min，85％～45％A、10％B、5％～45％C；10～12min，45％A、10％B、45％C；12～15min，45％～31％A、10％～14％B、45％C；15～15.1min，31％～0％A、14％～50％B、50％C；15.1～17min，0％A、50％B、50％C；17～17.1min，0％～85％A、50％～10％B、50％～5％C；17.1～20min，85％A、10％B、5％C；在85％A、10％B、5％C下平衡3min。流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：2μl；检测波长：220nm为主要检测波长；254nm、280nm辅助定性。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案建立了使用同一种色谱条件同时测定辅助改善记忆类保健食品中可能添加的17种化学药物含量的高效液相方法，在20min内完成了对各化合物的分析测定，在保证分离度的情况下，实现了快速有效的高通量分析，可为监测辅助改善记忆类保健食品非法添加药物提供强有力的技术支持。

附图说明

图1是17种化学药物单标色谱图；

图2是17种化学药物混标对照色谱图；

图3是制剂样品的色谱图；

图4是试剂空白色谱图。

其中：1吡拉西坦；2萘普生；3咖啡因；4依达拉奉；5双氯酚酸钠；6茴拉西坦；7佛马西尼；8烟酸占替诺；9雌三醇；10石杉碱甲；11尼莫地平；12加兰他敏；13倍他司丁；14己烯雌酚；15阿米三嗪；16；多奈哌齐；17，佛桂利嗪；b固体制剂。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明的权利要求范围内所做的有限次的修改仍在本发明的权利要求范围内。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源

辅助改善记忆力类保健食品来源于市场销售样品。

1.1.2主要仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(二极管阵列检测器，美国Agilent)，XA205DU电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，Classic UVF超纯水器(英国ELGA公司)，P300H超声波清洗器(德国Elma公司)，Sigma 3K15高速离心机(德国赛多利斯公司)，C18-SPE柱(60mg/3mL,天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

多奈哌齐、石杉碱甲、依达拉奉、倍他司汀、烟酸占替诺、吡拉西坦、加兰他敏、咖啡因、茴拉西坦、氟马西尼、雌三醇、氟桂利嗪、萘普生、己烯雌酚、尼莫地平、阿米三嗪、双氯芬酸钠对照品均购于中国食品药品检定研究院，纯度均≥98.5％；甲醇和乙腈(液质级，B&J)，其它试剂均为分析纯。实验用水为经ELGA PURELAB Classic UVF净化系过滤的去离子水。

1.2方法

1.2.1标准溶液的制备

1.2.1.1标准溶液：分别精密称取17种标准物质适量，加40％甲醇水溶液使成浓度为0.2mg/mL；17种化学药物单标色谱图见图1，混标色谱图见图2。

1.2.1.2标准工作曲线：取标准溶液适量加40％甲醇水溶液，分别配制成40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，作为标准工作曲线溶液。

1.2.2样品前处理

称取相当于一次口服剂量，置于100mL锥形瓶中，精密加入50mL 40％甲醇水溶液，称其重量，超声提取30分钟，冷却，用40％甲醇-水溶液补足重量，过滤，滤液待用。

1.2.2.4净化：精密量取上述滤液2mL以约1mL/min流速通过C18-SPE柱(使用前分别以3mL甲醇，水活化)，用3mL 40％甲醇-水洗脱，合并流出液与洗脱液，用0.22μm有机滤膜过滤即得待测样品。样品色谱图及试剂空白色谱图见图3、图4。

1.2.3色谱条件

色谱柱：Thermo AccliaimTM Mixed-Mode WCX-1柱(150mm 2.1mm，3μm)；流动相：A：水；B：100mmol/L磷酸二氢钠缓冲盐，pH 6.4；C:乙腈；梯度洗脱程序：0～10min，85％～45％A、10％B、5％～45％C；10～12min，45％A、10％B、45％C；12～15min，45％～31％A、10％～14％B、45％C；15～15.1min，31％～0％A、14％～50％B、50％C；15.1～17min，0％A、50％B、50％C；17～17.1min，0％～85％A、50％～10％B、50％～5％C；17.1～20min，85％A、10％B、5％C；在85％A、10％B、5％C下平衡3min。流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：2μl；检测波长：220nm为主要检测波长；254nm、280nm辅助定性；各化合物的最大吸收波长(见表1)。

2.结果与讨论

2.1色谱条件的选择

2.1.1色谱柱的选择

选用美国Thermo公司的三种液相色谱柱进行比较，分别为syncronisC18-AQ 4.6×250mm，5μm)、Hilic-10(2.1×150mm，3μm)以及AcclaimTMMixed-Mode WCX-1(2.1×150mm，3um)，由于17种待测物，大多为碱性物质，也有少部分酸性物质，C18色谱柱与Hilic柱未能实现17种化合物一次性分离，而离子混合型WCX色谱柱作分离，则能实现一次进样对所有物质进行分离。

2.1.2流动相的选择

由于待分析的化合物种类较多，极性差别较大，选用离子混合型WCX色谱柱的同时，流动相pH的变化会直接影响各物质的出峰时间，本发明提供的技术方案正是通过三种溶剂的梯度变化洗脱，从而改变分析时的pH变化，达到17种物质能在WCX色谱柱上分离,但缓冲盐的pH应为6.3～6.5，否则吡拉西坦、萘普生和咖啡因难以分离。

2.1.3检测波长的选择

因17种化学药物最大吸收波长在210～280nm不等，吡拉西坦在此范围更无最大吸收波长，故本发明采用二极管阵列检测器，选用220nm为主要检测波长，254nm、280nm辅助定性；可同时检测到17种化学药物，结果只需将254nm、280nm波长响应值与220nm响应值做比值对比，可实现辅助定性。

2.2标准储备溶液的稳定性

对标准储备溶液分别在0小时、1小时、8小时、12小时与24小时进针，考察溶液的稳定性。研究表明，对照溶液有效使用在8小时内的有吡拉西坦，12小时内的有加兰他敏、倍他司汀、己烯雌酚、阿米三嗪、多奈哌齐、氟桂利嗪，24小时以内的有萘普生、咖啡因、依达拉奉、双氯芬酸钠、茴拉西坦、氟马西尼、烟酸占替诺、雌三醇、石杉碱甲、尼莫地平。

2.3线性关系、检出限、回收率试验

2.3.1线性关系、检出限

取标准工作曲线按1.2的色谱条件进样分析，以峰面积Y对标准品的浓度X(mg/L)进行回归分析，按照S/N:3计算检出限(LOD)、S/N:10计算检出限(LOQ)、17种化学药物的回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限。(见表1)

表117种化学药物检测数据

2.3.2加样回收试验、重复性试验

在经测定不含有17种化学药物的基质的空白样品中进行加标回收率试验。按本方法进行实验，平行测定6次，计算重复测定的相对标准偏差。所得到的平均加标回收率范围为85％～120％。(见表2)。

表2是17种化学药物精密度与回收率

辅助改善记忆类保健食品部分基质比较复杂，适当的净化是有必要的。固相萃取技术是目前应用较多的净化手段。本发明比较了C18-SPE柱、硅胶SPE柱、HLB-SPE柱作比较。结果表明，利用C18-SPE柱净化除了能拦截大部分杂质外，还能对17种化学药物洗脱完全,均有较好的回收率；而硅胶SPE柱，虽然完全洗脱17种化学药物，但也不能对杂质进行除杂；HLB-SPE柱虽然能拦截杂质，但也对17种化学药物拦截，影响其回收率。故本发明选择的净化条件为C18-SPE柱。

2.5不同品牌高效液相色谱仪的评价

本次实验除了选用安捷伦高效液相仪外，还选用了Thermo的3000高效液相仪，两台仪器对同一份对照与样品的测试，均无显著差异，故本方法对仪器无特殊要求。

2.6实际样品的测定

本次实验中，17种促智类化学药物均未检出。

本发明建立了使用同一种色谱条件同时测定辅助改善记忆类保健食品中可能添加的17种化学药物含量的高效液相方法，在20min内完成了对各化合物的分析测定，在保证分离度的情况下，实现了快速有效的高通量分析，可为监测辅助改善记忆类保健食品非法添加药物提供强有力的技术支持。

Claims (1)

1.一种同时测定固体保健食品中非法添加的多种化学药物的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)标准溶液的制备

分别精密称取17种标准物质适量，加40％甲醇水溶液使成浓度为0.2mg/mL，检测17种化学药物单标色谱和混标色谱图；

2)标准工作曲线

取标准溶液适量加40％甲醇水溶液，分别配制成40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，作为标准工作曲线溶；

3)样品前处理

称取相当于一次口服剂量，置于100mL锥形瓶中，精密加入50mL 40％甲醇水溶液，称其重量，超声提取30分钟，冷却，用40％甲醇-水溶液补足重量，过滤，滤液待用；

4)净化

精密量取上述滤液2mL以约1mL/min流速通过C18-SPE柱，用3mL 40％甲醇-水洗脱，合并流出液与洗脱液，用0.22μm有机滤膜过滤即得待测样品；

其中，所述色谱条件为：

色谱柱：Thermo AccliaimTM Mixed-Mode WCX-1柱；流动相：A：水；B：100mmol/L磷酸二氢钠缓冲盐，pH 6.4；C:乙腈；梯度洗脱程序：0～10min，85％～45％A、10％B、5％～45％C；10～12min，45％A、10％B、45％C；12～15min，45％～31％A、10％～14％B、45％C；15～15.1min，31％～0％A、14％～50％B、50％C；15.1～17min，0％A、50％B、50％C；17～17.1min，0％～85％A、50％～10％B、50％～5％C；17.1～20min，85％A、10％B、5％C；在85％A、10％B、5％C下平衡3min。流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：2μl；检测波长：220nm为主要检测波长；254nm、280nm辅助定性。