CN109406688A - 用于检测产品中违禁药品的标准样品 - Google Patents

Abstract

本发明属于保健品领域，提供了一种用于检测产品中违禁药品的标准样品，所述标准样品由山楂提取物、山药提取物、太子参提取物和玉米淀粉组成，所述产品为抗疲劳产品，所述标准样品可以应用检测市场上声称具有抗疲劳产品中的违禁药品的质控，不同实验室可依据本标准样品进行实验室检测能力评估，提高违禁药品的检出率，降低漏检率。

Description

用于检测产品中违禁药品的标准样品

技术领域

本发明属于保健品领域，具体涉及保健品的质控领域，具体涉及一种用于检测抗疲劳产品中违禁药品的标准样品。

背景技术

在中国现有的注册保健产品中，有超过1/3以上宣称具有抗疲劳功能的产品，因此违法添加药品行为也多发生在此类产品中。根据根据国家食品药品监督管理总局(http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1162/76614.html)公布的保健食品中可能非法添加的物质名单(第一批)，可能非法添加物质为：那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非等PDE5型(磷酸二酯酶5型)抑制剂。

发明人根据目前市面上现有的具有抗疲劳功能的保健产品处方，发现保健品中普遍含有一系列的辅料，对保健品中违禁药品的检测造成了巨大干扰。

目前现行有效的检测方法为国家食品药品监督管理总局2016年第196号公告：关于发布食品中那非类物质的测定和小麦粉中硫脲的测定2项检验方法的公告。该方法为高效液相色谱质谱联用方法，检出限为ppb级，这类检测方法极易受到产品中其他物质的干扰，因此实验室对于这类物质的检测结果无相应的标准物参考标准，无法检测确定是否漏检已含有的违禁物质。因此需要一种在保健食品基质中添加违禁物质的质控样的标准样品，用以模拟基质对违禁物质检出的干扰。该标准样品用作实验室内部质控或对实验室检验能力的考察，即在保健食品基质干扰下，定量检出ppb级违禁物质。

发明内容

本发明的目的提供一种检测产品中违禁产品的标准样品，所述标准样品由违禁药品、山楂提取物、山药提取物、太子参提取物和玉米淀粉组成，所述玉米淀粉为标准样品的基质，玉米淀粉的用量是用来满足稀释所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物在该标准样品中含量，使其满足上述几种提取物在标准样品中含量均为50-150g/Kg,所述违禁药品的含量为5-60mg/kg。

进一步地，在上述所述标准样品中，所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物的含量均为75-125g/Kg，违禁药品的含量范围为20-50mg/kg。

进一步地，在上述所述标准样品中，所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物的含量均为100g/Kg，违禁药品的含量范围为40mg/kg。

进一步地，在上述所述标准样品中，所述标准样品为固体形式。

所述产品优选抗疲劳类产品。

(玉米淀粉为市售普通级别淀粉，优选符合GB/T 8885-2008食用玉米淀粉规定)。

在标准样品中，如果去掉一种成分将减少10％到30％产品覆盖率，如果增加一种成分将降低方法检出的专属性，影响定量结果准确性，因此，本发明的组合物的成分及其比例为最佳选择。

上述标准样品的组分范围是基于申请人多年的数据积累来确定的，因为不同的保健品所含有的基质是不同的，其中基质(山楂提取物、山药提取物、太子参提取物)的含量尚无定论，申请人对收到的保健品进行测试后进行统计，确定了上述含量的浓度范围，其中过低的基质浓度无法模拟保健品中的基质浓度，过高的基质浓度会导致后续检测中液相信号的干扰，不利于检测结果的测定。

山楂具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，同时也是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药，对胸膈脾满、疝气、血淤、闭经等症有很好的疗效。山药具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精的疗效。太子参具有补益脾肺，益气生津。治肺虚咳嗽，脾虚食少，心悸，怔忡，水肿，消渴，精神疲乏的疗效。发明人考察了2000余份市售保健食品配方，声称具有抗疲劳功能的产品中，多数含有山楂、山药、太子参等中药提取物，因此选择以上3种中药提取物作为基质主要成分。

所述玉米淀粉需要根据标准样品的配置浓度进行调整。

所述山楂提取物、山药提取物、太子参提取物均为市售产品,(例如商品名“山楂提取物”厂家可选自武汉欣欣佳丽生物科技有限公司、朗林生物、南京泽朗医药科技有限公司等厂家；商品名“山药提取物”生产厂家可选自西安小草植物科技有限责任公司、湖北巨胜科技有限公司、武汉宏信康精细化工有限公司等厂家；商品名“太子参提取物”生产厂家可选自武汉宏信康精细化工有限公司、南京道斯夫生物科技有限公司、西安小草植物科技有限责任公司等厂家。),并优选符合以下质量标准要求的产品。本领域普通技术人员可根据相应的成本条件和实验需求，筛选符合要求的原料生产商的产品，或者按照常规提取工艺提取得到符合以下质量要求的提取物。

山楂提取物检测方法:取本品细粉约1g，精密称定，精密加入水100m1，室温下浸泡4小时，时时振摇，滤过。精密量取续滤液25m1，加水50ml，加酚酞指示液2滴，用氢氧化钠滴定液(0.lmol/L)滴定，即得。每1ml氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.404mg的枸椽酸(C₆H₈O₇)。本品按干燥品计算，含有机酸以枸橼酸计大于等于5.0％。

山药提取物检测方法：用95％乙醇作溶剂，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法(见中国药典2010年版一部附录ⅩA)测定，乙醇浸出物大于等于25.0％。

太子参提取物检测方法：用95％乙醇作溶剂，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法(见中国药典2010年版一部附录ⅩA)测定，乙醇浸出物大于等于14.0％。

在上述所述标准样品中，所述违禁产品为那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的一种或一种以上的药品混合。

本发明提供上述标准样品的制备方法，其中，由以下步骤组成：

1)称取玉米淀粉，粉碎至20-100目，优选35目，过筛备用；

2)称取违禁药品，溶于无水乙醇中，配制成违禁药品溶液；

3)称取山楂提取物、山药提取物和太子参提取物，用乙醇混合成混悬溶液；

4)将无水乙醇加入搅拌釜，加入步骤2)所述违禁药品溶液和步骤3)混悬溶液，边加边搅拌，加入玉米淀粉，边加边搅拌，至玉米淀粉溶解完全，继续搅拌，并回收乙醇；

5)回收乙醇后，过筛挤压制粒，制粒干燥；

6)制粒过筛20-100目，优选60目，得到所述标准样品。

步骤1)要求外观干燥、疏松、混合均匀、色泽一致

步骤2)配制比例根据加入药品的溶解度和制备的质控样的浓度而定，一般不超过2mg/mL，混合均匀，适当储藏条件保证稳定性(如低温、避光等)。

步骤3)中药材提取物的混悬液不粘稠易倾倒，混悬微粒细微均匀，下沉后不结块，稍加振摇能均匀分散，而且每一批次质控样制备时，按比例加入的中药提取物混悬液全部加入到反应釜中。

步骤4)将无水乙醇加入搅拌釜，加入违禁药品溶液和混悬溶液缓慢加入搅拌釜中，边加边搅拌，在缓缓加入玉米淀粉，边加边搅拌，至玉米淀粉溶解完全加入后，继续搅拌进行混合；每一批质控样制备时加入不少于6L无水乙醇，搅拌速度600转/分。

步骤5)水浴加热，回收乙醇。过筛挤压制粒，湿粒粒度应较均匀，外观检查无异物。

将制粒进行干燥；干燥程度根据加入目标化合物的稳定性质差异略有不同，一般不超过3％。

步骤6)过筛；再过筛20-100目，优选60目，得到标准样品。

均一性稳定性良好，与设定靶值比较接近。关键的制备工艺在于混匀一步，关键参数是混匀的筛子目数和过筛的次数(通过仪器分析结果的方差分析进行均匀性检验，满足均一性要求)

该标准样品可以作为一种质控样，用于检验各个实验室对于保健品中违禁药品的的检测能力，最终为检测结果提供测试条件的参照。

本发明进一步提供了一种标准样品在免疫调节产品中违禁药品的检测中的应用。

进一步地，在上述应用中，所述应用由以下步骤组成：

1)根据所要测定的违禁药品，配置所述违禁产品的标准样品，建立含有不同浓度违禁产品的标准样品；

2)违禁产品的标准样品预处理：称取所述标准样品，溶于乙腈溶解后，超声混匀，过滤等待进样，将待测抗疲劳供试品超声混匀，过滤等待进样；

3)称取违禁产品标准品，进行违禁产品标准品的标准曲线制备；

4)采用液质联用的方法进行，所述液相方法为：色谱柱为C18柱，1.8μm，100mm×2.1mm，或性能相当者；A为0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液、B为乙腈，流速0.3ml/ml,洗脱梯度，0min，90％A：10％B；2min，90％A：10％B；2.1min，65％A：35％B；4min，65％A：35％B；4.1min，60％A：40％B；6.5min，60％A：40％B；7min，20％A：80％B；9min，20％A：80％B；9.1min，10％A：90％B；12min，10％A：90％B；

质谱条件：电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式为多反应监测(MRM)；雾化气压力为30psi；离子喷雾电压为3500V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；

5)根据标准样品的检测结果，确定实验室的检测条件，比照违禁药品的标准曲线和供试品中液相质谱的出峰条件和质谱情况，测定供试品中是否含有违禁成分。

本方法适用于酒、咖啡、功能饮料、玛卡片、保健食品中的违禁产品含量的测定。

具体实施方式

下面实验例用于进一步说明本发明但不限于本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。

实施例1

标准样品A：所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物的浓度均为100g/Kg，违禁产品的浓度范围为40mg/kg，其余成分为玉米淀粉，根据提供的制备方法进行配置。

方法1、以下为国家食品药品监督管理局的批准方法

对照品的制备，将含有那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的供试品，各成分分别为约10mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，用50％乙腈水溶液稀释指出每1ml含5μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备，精密称取一次服用量，研细后转移至50ml量瓶中，加入乙腈约40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过；

测定法分别精密称量供试品溶液及对照品溶液各10μl注入液质联用仪，记录液相色谱图和一、二级质谱图。

结果判断采用比较供试品与对照品的色谱图、一级质谱图和二级质谱图的方法进行定性分析，确定供试品中添加的化学成分。在没有对照品情况下，若供试品质谱图中出现了表中相应的准分子离子峰及三个以上二级质谱特征碎片离子时，可结合DAD光谱确定供试品中添加的化学成分。

供试品液相出峰顺序：1-那红地那非；2-红地那非；3-伐地那非；4-羟基豪莫西地那非；5-西地那非；6-豪莫西地那非；7-氨基他达那非；8-他达拉非；9-硫代艾地那非；10-伪伐地那非；11-那莫西地那非。

表1质谱离子峰和碎片离子表

该类方法在近年来非法添加行为呈现出的新驱势下，暴露出一定不足。例如根据上述方法常常无法检测得到市面上的保健品中含有的违禁产品，原因是非法添加药物剂量的随意性很强，有些产品添加剂量极低，采用质谱全扫描模式灵敏度较低，容易产生漏筛。

方法2申请人实验室方法：

水为GB/T 6682规定的一级水

试剂

乙腈：色谱纯

甲酸：质谱级

乙酸铵：质谱级

0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液：称取乙酸铵0.7708g于1000ml量瓶中，加入甲酸1ml，摇匀，用0.22μm有机相滤膜过滤后备用。

标准品

那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非，纯度HPLC≥98％。

标准储备液

分别称取那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非标准品0.1g(精确至0.0001g)，用乙腈溶解，并转移至100ml容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度为1mg/mL。储存于4℃冰箱中，有效期3个月。

混合标准系列工作液：分别准确量取那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非标准储备液，加入山楂提取物、山药提取物和太子参提取物，制备成标准样品，用乙腈稀释为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的标准混合溶液，临用时配制。

试样制备

准确称取2g试样(精确至0.01g)于50ml容量瓶，加入40ml乙腈，超声20min，冷却至室温，用乙腈定容至刻度，摇匀，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤。去续滤液1.0ml于50ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，供液相色谱-串联质谱仪测定。

色谱条件

色谱柱：C18柱，1.8μm，100mm×2.1mm(内径)，或性能相当者；

流动相：A为0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液，B为乙腈，洗脱梯度见表2；

流速：0.3ml/min；

进样量：5μL。

表2梯度洗脱

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0	0.3	90	10
2	0.3	90	10
				2.1	0.3	65	35
4	0.3	65	35
				4.1	0.3	60	40
6.5	0.3	60	40
				7	0.3	20	80
9	0.3	20	80
				9.1	0.3	10	90
12	0.3	10	90

质谱条件

电离方式：电喷雾正离子模式；

检测方式：多反应检测(MRM)；

雾化气压力：30psi；

离子喷雾电压：3500V；

干燥气温度：350℃；

干燥气流速：8L/min；

定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能力见表3。

表3

定性测定

按照上述条件测定试样和标准样品，试样中色谱峰保留时间与标准样品中某一组分一致(变化范围在±2.5％以内)；试样中离子对的相对丰度与标准样品的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4规定的范围，则可判定试样中存在该组分。

表4

定量测定

将标准样品分别按照仪器条件进行测定，绘制相应的标准溶液的色谱法面积。以标准溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

将试样溶液按照仪器条件进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次；试样待测液响应值高于标准曲线线性范围，应用乙腈稀释后进行分析。

结果计算

X＝C×V×1000/m

式中：X为试样中某组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；

C为标准样品中某组分的浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；

V为试样溶液定容体积，单位为毫升(ml)；

m为试样称取质量，单位为克(g)；

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

为了验证标准样品的有效性：

在鉴定抗疲劳产品中违禁产品前，申请人分别采用上述方法和标准样品A对检测机构进行了检测能力进行鉴定。

申请人找到寻找相同等级的检测机构甲-戊，分别使用标准样品A，A的配置为：(那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非各浓度均为40mg/Kg，山楂提取物、山药提取物、太子参提取物各浓度均为100g/Kg,其余为玉米淀粉)；检测方法分别为国家现行试验方法和实验室方法，甲检测机构无法检测出A中的某些ppb级违禁药品((“某些”比如为那红地那非、红地那非、伐地那非等上述一种或者多种ppb级违禁药品成分，因与本发明欲保护内容关联不密切，因此数据不再一一列举，暂欠奉))；乙-戊可以完全检测出B中的违禁药品；选用的10种抗疲劳保健品(违禁产品已知ppb级)进行分别检测，检测结果发现，甲检测机构的漏检率为：20％；乙-戊检测机构的漏检率为0(漏检判定：未检测出已含有的违禁产品或少检测出已含有的违禁产品，均为漏检)，因此标准样品A能够准确反映出五家检测的违禁产品的检测水平，有效促进甲检测机构的检测水平的提升。

Claims (9)

1.一种用于检测产品中违禁药品的标准样品，其特征在于，所述标准样品由违禁药品、山楂提取物、山药提取物、太子参提取物和玉米淀粉组成，所述玉米淀粉为标准样品的基质，玉米淀粉的用量是用来满足所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物在该标准样品中含量均为50-150g/Kg,所述违禁药品的含量为5-60mg/kg。

2.根据权利要求1所述的标准样品，其特征在于，所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物的含量均为75-125g/Kg，违禁药品的含量范围为20-50mg/kg。

3.根据权利要求1所述的标准样品，其特征在于，所述山楂提取物、山药提取物和太子参提取物的含量均为100g/Kg，违禁药品的含量范围为40mg/kg。

4.根据权利要求1所述的标准样品，其特征在于，所述标准样品为固体形式。

5.根据权利要求1-4任一所述的标准样品，其特征在于，所述违禁药物为那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他打拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的一种或一种以上的混合物。

6.根据权利要求5所述的标准样品，其特征在于，所述产品为抗疲劳类产品。

7.一种权利要求1所述标准样品的制备方法，其特征在于，由以下方法组成：

1)称取玉米淀粉，粉碎至20-100目，优选35目，过筛备用；

2)称取违禁药品，溶于无水乙醇中，配制成违禁药品溶液；

3)称取山楂提取物、山药提取物和太子参提取物，用无水乙醇混合成混悬溶液；

4)将无水乙醇加入搅拌釜，加入步骤2)所述违禁药品溶液和步骤3)混悬溶液，边加边搅拌，加入玉米淀粉，边加边搅拌，至玉米淀粉溶解完全，继续搅拌，并回收乙醇；

5)回收乙醇后，过筛挤压制粒，制粒干燥；

6)制粒过筛20-100目，优选60目，得到所述标准样品。

8.一种权利要求1所述标准样品在检测抗疲劳产品中违禁药品中的应用。

9.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用由以下步骤组成：

1)根据所要测定的违禁药品，配置所述违禁产品的标准样品，建立含有不同浓度违禁产品的标准样品；

2)违禁产品的标准样品预处理：称取所述标准样品，溶于乙腈溶解后，超声混匀，过滤等待进样，将待测抗疲劳供试品超声混匀，过滤等待进样；

3)称取违禁产品标准品，进行违禁产品标准品的标准曲线制备；

4)采用液质联用的方法进行，所述液相方法为：色谱柱为C18柱，1.8μm，100mm×2.1mm，或性能相当者；A为0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液、B为乙腈，流速0.3ml/ml,洗脱梯度，0min，90％A：10％B；2min，90％A：10％B；2.1min，65％A：35％B；4min，65％A：35％B；4.1min，60％A：40％B；6.5min，60％A：40％B；7min，20％A：80％B；9min，20％A：80％B；9.1min，10％A：90％B；12min，10％A：90％B；

质谱条件：电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式为多反应监测(MRM)；雾化气压力为30psi；离子喷雾电压为3500V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；

5)根据标准样品的检测结果，确定实验室的检测条件，比照违禁药品的标准曲线和供试品中液相质谱的出峰条件和质谱情况，测定供试品中是否含有违禁成分。