CN106770780A - 宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测方法，具体涉及一种宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法。本发明宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法包括以下步骤：(1)样品处理：用混合溶剂提取宝乐果原料或含宝乐果的制品中的活性物质，所述混合溶剂由甲醇和水组成；(2)采用HPLC‑MS/MS进行定量分析：采用HPLC‑MS/MS分别测定宝乐果标准溶液和步骤(1)得到的上样液，将上样液的测定结果与宝乐果标准溶液的测定结果进行比较，对宝乐果原料或含宝乐果的制品中的活性物质进行定性或定量。本发明采用特定的混合溶剂提取宝乐果原料或含宝乐果的制品中的活性物质，提取效率较高；同时，本发明通过HPLC‑MS/MS进行定性/定量分析，分离效果好，且检出限和定量限较低。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法。
背景技术
宝乐果(Borojo)是一种生长在南美洲热带雨林的水果，它适应厄瓜多尔气候，是茜草科林果属。Borojo果实直径达到7-12厘米，未成熟时绿色，成熟后转为茶褐色，重量700-1000克/只，果肉柔软，味酸且粘稠，去种子后果肉重量占88％。新鲜Borojo是极酸(pH2.74)、低水分(69.22％)、高碳水化物(28.02％)、低糖(9.72％)、高蛋白(1.22％)、高膳食纤维(2.98％)的水果。
宝乐果营养丰富，含多糖、植物油、矿物质、维生素、稀土元素，蛋白质、氨基酸等成分。据目前的研究报导，宝乐果可以缓解人的贫血症状、具有抗炎及抗氧化功效。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种检出限和定量限均较低的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法：其包括以下步骤：
(1)样品处理：按照每1克样品中加入8～12mL混合溶剂的比例，向样品中加入混合溶剂，溶解样品；其中，所述样品为宝乐果原料或含宝乐果的制品，所述混合溶剂由甲醇和水组成，所述混合溶剂中甲醇的体积百分比为40～80％；
当样品为宝乐果原料时，溶解样品后，进行加热处理，冷却后再进行离心或用滤纸过滤，取上清液(离心时)或滤液(过滤时)，用滤膜过滤，得到上样液；当样品为含宝乐果的制品时，溶解样品后，用滤膜过滤，得到上样液；
(2)采用HPLC-MS/MS进行分析：采用HPLC-MS/MS分别测定宝乐果标准溶液和步骤(1)得到的上样液，将上样液的测定结果与宝乐果标准溶液的测定结果进行比较，对样品中的活性物质进行定性或定量；
HPLC-MS/MS进行分析时，HPLC的条件为：色谱柱为C18柱；流动相由水相和有机相组成，所述水相与有机相的体积比为2:3～3:2；且所述水相为高纯水，所述有机相由甲醇和甲酸组成，所述甲酸与甲醇的体积比为0.1％；在流速为0.3～0.5mL/min的条件下进行等度洗脱；
HPLC-MS/MS进行分析时，质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源，检测器为三重四级杆串联质谱检测器。
本发明中，所述活性物质指的是糖基化8，9-环烯醚萜苷，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
本发明采用特定的混合溶剂提取宝乐果原料或含宝乐果的制品中的活性物质，提取效率较高；同时，本发明通过HPLC-MS/MS进行定性/定量分析，分离效果好，且检出限和定量限均较低。本发明测定宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检出限为10ng/mL，定量限为100ng/mL，线性范围为100.0～1.0×105ng/mL。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，按照每1克样品中加入10mL混合溶剂的比例，向样品中加入混合溶剂。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，混合溶剂中甲醇的体积百分比为50％。本发明采用混合溶剂来提取宝乐果原料或含宝乐果的制品中的活性物质，且申请人考察了混合溶剂中甲醇的体积百分比不同时，活性物质的提取效率和回收率，结果发现：混合溶剂中甲醇的体积百分比为50％，活性物质的提取效率更高、回收效果更好。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，当样品为宝乐果时，溶解样品后，于60-70℃水浴中加热20-30分钟。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，色谱柱的规格为150×4.6mm(即色谱柱的长为150mm，内径为4.6mm)，粒径为4μm。采用短柱有助于加强活性物质的峰形。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，水相与有机相的体积比为1:1，在流速为0.4mL/min的条件下进行等度洗脱。在选定的色谱条件下，宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的分离效果更好，分离度更高。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述等度洗脱的时间为5-10分钟。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，离子化温度为450～550℃；质谱检测时，采用多反应监测模式和负离子化模式扫描。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，质谱检测时，电喷雾离子源的温度为500℃，特征离子的质荷比为382.00和181.00。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述宝乐果原料为宝乐果浓缩液、宝乐果浓缩粉或宝乐果原果酱；所述含宝乐果的制品为含宝乐果的食品、保健品、化妆品或清洁液。所述宝乐果原料或含宝乐果的制品优选但不限于这些物质，本发明的检测方法还可以用于其他宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的测定。
作为本发明所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的优选实施方式，所述方法的检出限为10ng/mL，检测浓度范围为100～100000ng/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用特定的混合溶剂提取宝乐果原料或含宝乐果的制品中的活性物质，提取效率较高；同时，本发明以液质联用进行定性/定量分析，在特定的色谱条件下，活性物质的分离效果较好；且配合质谱检测，检出限和定量限均较低。本发明测定宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检出限为10ng/mL，定量限为100ng/mL，线性范围为100.0～1.0×105ng/mL。
附图说明
图1为宝乐果中活性物质的质谱扫描图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的试剂和溶液如下：
实施例中的水为符合GB/T 6682规定的一级水；甲醇为色谱纯；甲酸为色谱纯；标准品为宝乐果参比物；标准储备溶液的配制方法为：准确称取按其纯度折算为100％质量的标准品100mg，置于10mL棕色容量瓶中，用由甲醇和水组成的混合溶剂(其中，甲醇与水的体积比为1:1)配制成浓度为10.0mg/mL标准储备溶液；标准储备溶液均用锡纸做避光保护，放置在4℃冰箱中储存。
标准溶液的配制：按1：10、1：100、1:200、1：1,000、1:2,000、1：10,000、1:20,000、1：100,000、1：1，000，000比例用由甲醇和水组成的混合溶剂(其中，甲醇与水的体积比为1:1)稀释标准储备溶液至2mL进样瓶中。
实施例中所用的仪器和设备为：安捷伦公司HPLC，型号：1260；AB SCIEX公司质谱仪，型号：API2000；恒温水浴锅；电子天平。
实施例1
本发明宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的一种实施例，本实施例所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法为：
(1)样品处理：称取10g宝乐果原果酱(样品)至烧杯中，用100mL混合溶剂溶解，用锡纸封住烧杯口，然后于70℃水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，得到上样液；其中，所述混合溶剂由甲醇和水组成，所述混合溶剂中甲醇的体积百分比为50％；
(2)采用HPLC-MS/MS进行定量分析：采用HPLC-MS/MS分别测定宝乐果标准溶液和步骤(1)得到的上样液，根据上样液中活性物质含量情况，选定峰面积相近的标准溶液，标准溶液和上样液中活性物质响应值均应在仪器检测线性范围内；以宝乐果标准溶液中活性物质色谱峰的峰面积为纵坐标，其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线(标准曲线的线性范围为：100.0～1.0×105ng/mL)，从标准工作曲线得到上样液中活性物质的浓度；
HPLC-MS/MS进行定量分析时，HPLC的条件为：色谱柱为C18反相柱，色谱柱的规格为150×4.6mm，粒径为4μm；流动相：由水相和有机相组成，所述水相与有机相的体积比为1:1；且所述水相为高纯水，所述有机相由甲醇和甲酸组成，所述甲酸与甲醇的体积比为0.1％；在流速为0.4mL/min的条件下进行等度洗脱5分钟；柱温无要求；进样量为5μL；
HPLC-MS/MS进行定量分析时，质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源，检测器为三重四级杆串联质谱检测器；采用MRM(多反应监测模式)对扫描和负离子化模式扫描；离子化条件如表1所示；特征离子如表2所示；HPLC-MS/MS分析时宝乐果中活性物质的质谱扫描如图1所示；图中，3.83为保留时间(即：宝乐果活性物质的保留时间为3.83min)。
表1
表2
| Q1(母离子) | Q3(子离子) | 扫描时间 |
| 382.000 | 181.000 | 200ms |
(3)结果计算：结果按(1)式计算样品中活性物质的含量。
X＝c×n×V/m (1)
式中:
X——试样中活性物质含量，单位为毫克每千克，mg/kg；
c——从标准工作曲线得到被测上样液中活性物质的浓度，单位为微克每毫升，μg/mL；
n——初始上样液稀释倍数；
V——初始上样液的定容体积，单位为毫升，mL；
m——称取的样品质量，单位为克,g。
注：计算结果应保留到小数点后两位。
实施例2
本发明宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的一种实施例，本实施例所检测的样品为含宝乐果的护肤液。本实施例除样品处理的方法与实施例不同之外，其他步骤均同实施例1；本实施例中，样品处理的方法为：称取10g样品至烧杯中，用100mL混合溶剂溶解，再用0.22μm的滤膜过滤，得到上样液；其中，所述混合溶剂由甲醇和水组成，所述混合溶剂中甲醇的体积百分比为50％。
本实施例中HPLC-MS/MS分析时宝乐果中活性物质的质谱扫描图谱与实施例1的质谱扫描图是一致的，在此不一一赘述。
实施例3
本发明宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的一种实施例，本实施例所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法中，结果计算的步骤同实施例1，其他步骤如下：
(1)样品处理：称取10g宝乐果浓缩粉(样品)至烧杯中，用80mL混合溶剂溶解，用锡纸封住烧杯口，然后于60℃水浴加热25分钟，取出烧杯冷却至室温后，用滤纸过滤取虑液，用0.22μm的滤膜过滤，得到上样液；其中，所述混合溶剂由甲醇和水组成，所述混合溶剂中甲醇的体积百分比为40％；
(2)采用HPLC-MS/MS进行定量分析：采用HPLC-MS/MS分别测定宝乐果标准溶液和步骤(1)得到的上样液，根据上样液中活性物质含量情况，选定峰面积相近的标准溶液，标准溶液和上样液中活性物质响应值均应在仪器检测线性范围内；以宝乐果标准溶液中活性物质色谱峰的峰面积为纵坐标，其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线(标准曲线的线性范围为：100.0～1.0×105ng/mL)，从标准工作曲线得到上样液中活性物质的浓度；
HPLC-MS/MS进行定量分析时，HPLC的条件为：色谱柱为C18反相柱，色谱柱的规格为150×4.6mm，粒径为4μm；流动相：由水相和有机相组成，所述水相与有机相的体积比为2:3；且所述水相为高纯水，所述有机相由甲醇和甲酸组成，所述甲酸与甲醇的体积比为0.1％；在流速为0.5mL/min的条件下进行等度洗脱5分钟；柱温无要求；进样量为5μL；
HPLC-MS/MS进行定量分析时，质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源，检测器为三重四级杆串联质谱检测器；采用多反应监测模式(MRM)和负离子化模式扫描；离子化条件如表3所示；特征离子如表2所示。本实施例中HPLC-MS/MS分析时宝乐果中活性物质的质谱扫描图谱与实施例1的质谱扫描图是一致的，在此不一一赘述。
表3
实施例4
本发明宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法的一种实施例，本实施例所述宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法中，结果计算的步骤(3)同实施例1，其他步骤如下：
(1)样品处理：称取10g宝乐果浓缩液(样品)至烧杯中，用120mL混合溶剂溶解，用锡纸封住烧杯口，然后于65℃水浴加热20分钟，取出烧杯冷却至室温后，用滤纸过滤取虑液，用0.22μm的滤膜过滤，得到上样液；其中，所述混合溶剂由甲醇和水组成，所述混合溶剂中甲醇的体积百分比为80％；
(2)采用HPLC-MS/MS进行定量分析：采用HPLC-MS/MS分别测定宝乐果标准溶液和步骤(1)得到的上样液，根据上样液中活性物质含量情况，选定峰面积相近的标准溶液，标准溶液和上样液中活性物质响应值均应在仪器检测线性范围内；以宝乐果标准溶液中活性物质色谱峰的峰面积为纵坐标，其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线(标准曲线的线性范围为：100.0～1.0×105ng/mL)，从标准工作曲线得到上样液中活性物质的浓度；
HPLC-MS/MS进行定量分析时，HPLC的条件为：色谱柱为C18反相柱，色谱柱的规格为150×4.6mm，粒径为4μm；流动相：由水相和有机相组成，所述水相与有机相的体积比为3:2；且所述水相为高纯水，所述有机相由甲醇和甲酸组成，所述甲酸与甲醇的体积比为0.1％；在流速为0.3mL/min的条件下进行等度洗脱10分钟；柱温无要求；进样量为5μL；
HPLC-MS/MS进行定量分析时，质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源，检测器为三重四级杆串联质谱检测器；采用多反应监测模式(MRM)和负离子化模式扫描；离子化条件如表4所示；特征离子如表2所示。本实施例中HPLC-MS/MS分析时宝乐果中活性物质的质谱扫描图谱与实施例1的质谱扫描图是一致的，在此不一一赘述。
表4
实施例5标准物质添加的回收率及变异系数(％)
称取6份质量均为10g不含宝乐果的饼干(至烧杯中，向其中5份样品中分别加入10000ng/mL宝乐果标准溶液，再按照实施例1所述方法测定6份样品中活性物质的含量，并计算加标回收率。
称取6份质量均为10g不含宝乐果的护肤乳液至烧杯中，向其中5份样品中分别加入5000ng/mL宝乐果标准溶液，再按照实施例2所述方法测定6份样品中活性物质的含量，并计算加标回收率。
称取6份质量均为10ml的不含宝乐果的橘子汁至烧杯中，向其中5份样品中分别加入1000ng/mL宝乐果标准溶液，再按照实施例2所述方法测定6份样品中活性物质的含量，并计算加标回收率。
称取6份质量均为10ml的不含宝乐果的橘子汁至烧杯中，向其中5份样品中分别加入100ng/mL宝乐果标准溶液，再按照实施例2所述方法测定6份样品中活性物质的含量，并计算加标回收率。
样品加标回收率结果见表5。
表5
由表5可见，采用本发明的方法检测不含宝乐果的食品，添加水平在较大浓度时，加标回收率为103.5～109.4％；采用本发明的方法检测不含宝乐果的护肤品，添加水平在5000ng/mL浓度时，加标回收率为88.2～91.2％。当加入回收在检测限附近和检测低限时，加标回收率仍可得到45-80％.在由加标回收率可见，本发明的检测方法准确度较高。并且，本发明的方法检测宝乐果原料或含宝乐果的制品时，变异系数较低，可见本发明的检测方法重现性好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品处理：按照每1克样品中加入8～12mL混合溶剂的比例，向样品中加入混合溶剂，溶解样品；其中，所述样品为宝乐果原料或含宝乐果的制品，所述混合溶剂由甲醇和水组成，所述混合溶剂中甲醇的体积百分比为40～80％；
当样品为宝乐果原料时，溶解样品后，进行加热处理，冷却后再进行离心或用滤纸过滤，取上清液或滤液，用滤膜过滤，得到上样液；当样品为含宝乐果的制品时，溶解样品后，用滤膜过滤，得到上样液；
(2)采用HPLC-MS/MS进行分析：采用HPLC-MS/MS分别测定宝乐果标准溶液和步骤(1)得到的上样液，将上样液的测定结果与宝乐果标准溶液的测定结果进行比较，对样品中的活性物质进行定性或定量；
HPLC-MS/MS进行分析时，HPLC的条件为：色谱柱为C18柱；流动相由水相和有机相组成，所述水相与有机相的体积比为2:3～3:2；且所述水相为高纯水，所述有机相由甲醇和甲酸组成，所述甲酸与甲醇的体积比为0.1％；在流速为0.3～0.5mL/min的条件下进行等度洗脱；
HPLC-MS/MS进行分析时，质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源，检测器为三重四级杆串联质谱检测器。
2.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，按照每1克样品中加入10mL混合溶剂的比例，向样品中加入混合溶剂。
3.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，混合溶剂中甲醇的体积百分比为50％。
4.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，当样品为宝乐果原料时，溶解样品后，于60-70℃水浴中加热20-30分钟。
5.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
6.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，色谱柱的规格为150×4.6mm，粒径为4μm。
7.如权利要求1或6所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，水相与有机相的体积比为1:1，在流速为0.4mL/min的条件下进行等度洗脱；优选地，所述等度洗脱的时间为5-10分钟。
8.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，离子化温度为450～550℃；质谱检测时，采用多反应监测模式和负离子化模式扫描；优选地，所述步骤(2)中，质谱检测时，电喷雾离子源的温度为500℃，特征离子的质荷比为382.00和181.00。
9.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述宝乐果原料为宝乐果浓缩液、宝乐果浓缩粉或宝乐果原果酱；所述含宝乐果的制品为含宝乐果的食品、保健品、化妆品或清洁液。
10.如权利要求1所述的宝乐果原料或含宝乐果的制品中活性物质的检测方法，其特征在于：所述方法的检出限为10ng/mL，检测浓度范围为100～100000ng/mL。
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| CN109966202A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-07-05 | 广州博罗霍生物科技有限公司 | 宝乐果在透皮吸收中的用途 |
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