CN105929060A - 一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的lc-ms-ms检测方法 - Google Patents

一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的lc-ms-ms检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC‑MS‑MS检测方法，属于农药残留量检测技术领域。本方法用乙腈溶液均质提取样品中残留的乙基多杀菌素，提取液经分散净化后，液相色谱串联质谱（LC‑MS‑MS）检测，采用不含待测农药的空白基质溶液建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为87.2%～96.5%，平均相对标准偏差（RSD）为0.77%～3.23%，本发明检出限0.001mg/kg，定量检出限0.01mg/kg。具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法
技术领域
本发明涉及一种乙基多杀菌素残留量的检测方法，更具体地涉及一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）检测方法，属于农药残留量检测技术领域。
背景技术
乙基多杀菌素（Spinetram）是一种从放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolysporaspinosa）发酵产生的生物杀虫剂，其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的混合物（比值为3:1），他们的杀菌生物活性无显著差异。分子式：乙基多杀菌素-J为C42H69NO10，乙基多杀菌素-L为C43H69NO10。
乙基多杀菌素原药的质量分数为81.2%，是带有霉味的灰白色固体，pH6.46（1%水溶液， 23.1℃）；熔解温度：乙基多杀菌素-J为143.4℃，乙基多杀菌素-L为70.8℃；沸腾前分解温度： 乙基多杀菌素-J为297.8℃，乙基多杀菌素-L为290.7℃；溶解度（g/L，20℃）：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、1，2-二氯乙烷、二甲苯中＞250，n-辛醇中132，庚烷中61；水中溶解度：乙基多杀菌素-J为10.0mg/L，乙基多杀菌素-L为31.9 mg/L；不易燃；（54±2）℃14d热贮存稳定。乙基多杀菌素60g/L悬浮剂外观为带霉味的棕褐色液体；pH6~8；细度：≥98%通过45μm试验筛；悬浮率：100%；倾斜性：≤5%；冷、热、常温2年贮存稳定。
乙基多杀菌素原药大鼠急性经口、经皮LD50＞5000mg/kg，急性吸入LC50＞5.5mg/L；对眼睛有刺激性，皮肤无刺激性；无致敏性；大鼠3个月亚慢性喂养毒性试验最大无作用剂量：雄性大鼠为34.7mg/kg﹒d，雌性大鼠为10.1mg/kg﹒d；致突变试验：Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验均为阴性，未见致突变性。乙基多杀菌素60克/升悬浮剂大鼠急性经口、经皮LD50＞5000mg/kg，急性吸入LC50＞4.52mg/L；对眼睛有轻度刺激性，皮肤有刺激性；无致敏性。乙基多杀菌素原药（81.2%）为微毒，乙基多杀菌素60g/L悬浮剂为低毒杀菌剂。
乙基多杀菌素作用机理是作用于昆虫神经中烟碱型乙酰胆碱受体和r-氨基丁酸受体，致使虫体对兴奋性或抑制性的信号传递反应不敏感，影响正常的神经活动，直至死亡。乙基多杀菌素具有胃毒和触杀作用，主要用于防治鳞翅目害虫（小菜蛾、甜菜夜蛾） 及缨翅目害虫（蓟马）。经室内生物活性试验表明，对小菜蛾具有较好的杀虫活性（LC500.1327mg/L）；经田间药效实验结果表明，乙基多杀菌素60克/升悬浮剂对甘蓝小菜蛾有较好防效。用药量为300~600mL（制剂）/hm2或20~40mL（制剂）/667m2，使用方法为加水稀释后喷雾。该药速效性一般，持效时间为7d左右。在农业上，经田间药效表明，乙基多杀菌素防治鳞翅目害虫（小菜蛾、甜菜夜蛾）作用效果好，使用剂量低，应用范围广。
随着人们对食品中农药残留毒性的关注，乙基多杀菌素残留的检测也受到重视。欧盟于2012年6月发布规定，在部分水果产品上的最大残留限量为0.2mg/kg，在木霉、覆盆梅子等水果上的最大残留限量为0.8mg/kg。同时，作为我国主要出口市场的欧盟、日本等国家规定若田间使用农药没有在该国家登记，没有制定相应的残留限量标准时，出口至其国家的食品农产品包括畜禽肉等动物源性食品中残留限量均实行0.01mg/L 的“一律标准”。
目前乙基多杀菌素的检测方法尚无国家标准颁布，关于多杀菌素和乙基多杀菌素的原药及其在水体、土壤、水稻等基质中的残留分析方法已有报道，主要采用的是高效液相色谱法和超高效液相色谱(UPLC)法等。而利用液质联用方法在基质较为复杂的各种蔬菜水果中检测多乙基多杀菌素残留，并且适应范围广、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的LC-MS-MS方法尚未见报道。
因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的乙基多杀菌素在蔬菜水果中的残留检测方法亟待开发出来。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的检测方法。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）检测方法，包括如下步骤：
（1）试样制备：
将市场采集样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2gNaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的乙基多杀菌素系列混合标准工作液。
（4）测定和结果计算:
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行LC-MS-MS测定，测得样品液中乙基多杀菌素的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中乙基多杀菌素含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中乙基多杀菌素残留量。
步骤(1)中样品若为脱水蔬菜和水果，需降低称样量，并加适量水充分浸润。
步骤(2)中用乙腈提取时加入氯化钠盐析含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。
步骤(4)中所述的液相色谱的流动相包括A相和B相，A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水；流速：0.3 mL/ min；进样体积：1.0μL；柱温箱：45℃。
步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：
步骤(4)中液相色谱的色谱柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18，2.1×50mm,1.8μm。
步骤(4)中分析条件为：离子源温度375℃.离子源:ESI.电喷雾电压：5000V。雾化器压力：0.138MPa。辅助加热气：0.379MPa。扫描模式：正离子扫描。
步骤(4)中质谱检测使用多反应监测(MRM)扫描模式，乙基多杀菌素的母离子、子离子，去簇电压和碰撞能量分别为：
步骤(4) 中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。
本发明所具有的有益效果：
1、本发明采用LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）法定性定量测定蔬菜中残留的以及多杀菌素含量，采用外标法定量，平均回收率为87.2％～96.5%，平均相对标准偏差（RSD）为0.77％～3.23％%，灵敏度高、重复性好。
2、本发明检出限0.001mg/kg，定量检出限0.01mg/kg，能够简便、快速、定性定量准确的蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量，能满足美国、日本、欧盟等国家对相应食品安全检测的0.01mg/kg 残留限量，即“一律标准”的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
3、建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）应用于蔬菜、水果食品中乙基多杀菌素定性确证和定量检测。
附图说明
图1乙基多杀菌素标准曲线；
图2乙基多杀菌素标样0.1mg/L色谱图；
图3苹果空白色谱图；
图4苹果添加0.1mg/kg色谱图；
图5结球甘蓝空白色谱图；
图6结球甘蓝添加0.1mg/kg色谱图；
图7菠菜空白色谱图；
图8菠菜添加0.1mg/kg色谱图；
图9豇豆空白色谱图；
图10豇豆添加0.1mg/kg色谱图；
图11蓝莓空白色谱图；
图12蓝莓添加0.1mg/kg色谱图。
具体实施例
下列实施例是对发明的进一步说明，但本发明不仅限于此。
实施例中使用的仪器：
液质联用仪：Agilent 6460 Triple Quad LC/MS；Trace 1310型气相色谱-TSQ 8000型三重四极杆串联质谱仪（美国Thermo公司)；Sartorius 电子天平（千分之一，北京赛多利斯天平有限公司)；IKA T18 Basic均质器（德国 IKA 公司)；MS 3基本型涡旋混合器（IKA，Germany)。
药品及标准品：标准品购自天津农业部环境质量监督检验测试中心(质量浓度均为100ug/mL)。乙腈(HPLC 级，Merke，Germany)；甲酸(HPLC 级，CNW，Germany)；甲醇、氯化钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
基质匹配标准溶液：用空白样品基质溶液配成不同浓度的基质混合标准溶液，用于制作标准工作曲线，不同种类蔬菜或水果制得不同种类的基质校正工作溶液，基质匹配标准溶液现配现用。
供试蔬菜水果：苹果、结球甘蓝、菠菜、豇豆、蓝莓、葡萄，购自本地超市。
实施例1苹果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测：
（1）试样制备：
将采集苹果样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好的苹果试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的苹果基质空白样品按上述步骤(1)、(2) 处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。
（4）测定和结果计算:
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入LC-MS-MS进行测定，测得样品液中乙基多杀菌素的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中乙基多杀菌素含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中乙基多杀菌素残留量。
步骤(4)中所述的液相色谱的流动相包括A相和B相，A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水；流速：0.3 mL/ min；流速：0.3 mL/ min；进样体积: 1.0μL；柱温箱：45℃。
步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序如表1：
表1：实施例1的梯度洗脱程序
步骤(4)中液相色谱的色谱柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18，2.1×50mm,1.8μm。
步骤(4)中分析条件为：离子源温度375℃.离子源:ESI.电喷雾电压：5000V。雾化器压力：0.138MPa。辅助加热气：0.379MPa。扫描模式：正离子扫描。
步骤(4)中质谱检测使用多反应监测(MRM)扫描模式：乙基多杀菌素的母离子、子离子，去簇电压和碰撞能量分别如表2：
表2：实施例1的MRM检测参数
步骤(4)中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。
以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。
表3 苹果空白基质中乙基多杀菌素的标准曲线
加标回收率和重复性：
在不含乙基多杀菌素的苹果中加入0.01 mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min 后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，乙基多杀菌素的平均回收率为92.1％～93.8％，平均相对标准偏差(RSD)为1.32％～2.77％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表4 实施例1中乙基多杀菌素的回收率和重复性(n＝6)
检出限：将不同浓度的乙基多杀菌素基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，乙基多杀菌素的检出限为1μg/kg。
实施例2 结球甘蓝中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测：
（1）试样制备：
将采集的结球甘蓝样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好的结球甘蓝试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的结球甘蓝基质空白样品按上述步骤(1)、(2) 处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。
标准工作溶液的配制、液相色谱- 串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1苹果样品中乙基多杀菌素的测定一致。
加标回收率和重复性：
在不含乙基多杀菌素的结球甘蓝中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在3个加标水平上，乙基多杀菌素的平均回收率为90.8％～96.5％，平均相对标准偏差(RSD)为0.77％～1.98％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表5 实施例2中乙基多杀菌素的回收率和重复性(n＝6)
检出限：将不同浓度的乙基多杀菌素基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，乙基多杀菌素的检出限为1μg/kg。
施例3 菠菜中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测：
（1）试样制备：
将采集的菠菜样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好的菠菜试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的菠菜基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。
标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1中苹果样品中乙基多杀菌素的测定一致。
加标回收率和重复性：
在不含乙基多杀菌素的菠菜中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表6。由表6可以看出，在3个加标水平上，乙基多杀菌素的平均回收率为89.2％～96.3％，平均相对标准偏差(RSD)为1.49％～3.23％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表6 实施例3中乙基多杀菌素的回收率和重复性(n＝6)
检出限：将不同浓度的乙基多杀菌素基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，乙基多杀菌素的检出限为1μg/kg。
实施例4 豇豆中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测：
（1）试样制备：
将采集的豇豆样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好的豇豆试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的豇豆基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。
标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1中苹果样品中乙基多杀菌素的测定一致。
加标回收率和重复性：
在不含乙基多杀菌素的豇豆中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表7。由表7可以看出，在3个加标水平上，乙基多杀菌素的平均回收率为93.3％～95.1％，平均相对标准偏差(RSD)为1.49％～1.71％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表7 实施例4中乙基多杀菌素的回收率和重复性(n＝6)
检出限：将不同浓度的乙基多杀菌素基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，乙基多杀菌素的检出限为1μg/kg。
实施例5 蓝莓中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测：
（1）试样制备：
将采集的蓝莓样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好的蓝莓试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的蓝莓基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。
标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1中苹果样品中乙基多杀菌素的测定一致。
加标回收率和重复性：
在不含乙基多杀菌素的蓝莓中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表8。由表8可以看出，在3个加标水平上，乙基多杀菌素的平均回收率为90.9％～94.6％，平均相对标准偏差(RSD)为1.11％～1.54％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表8 实施例5中乙基多杀菌素的回收率和重复性(n＝6)
检出限：将不同浓度的乙基多杀菌素基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，乙基多杀菌素的检出限为1μg/kg。
实施例6 葡萄中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测：
（1）试样制备：
将采集的葡萄样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
（2）提取及净化：
称取5.0g已制备好的葡萄试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
（3）标准工作溶液的配制:
将不含乙基多杀菌素的葡萄基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。
标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1中苹果样品中乙基多杀菌素的测定一致。
加标回收率和重复性：
在不含乙基多杀菌素的葡萄中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表9。由表9可以看出，在3个加标水平上，乙基多杀菌素的平均回收率为87.2％～92.3％，平均相对标准偏差(RSD)为1.50％～2.24％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表9 实施例6中乙基多杀菌素的回收率和重复性(n＝6)
检出限：将不同浓度的乙基多杀菌素基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，乙基多杀菌素的检出限为1μg/kg。
数据表明，将实施例方法配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多杀菌素标准工作溶液，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在0.001~0.1mg/L范围内峰面积与进样浓度呈良好的线性关系，标准曲线方程为：Y=3000000x-12253，相关系数为r=0.9987。
上述实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）试样制备：将采集样品按照四分法缩分，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存；2）提取及净化：称取已制备好试样于离心管中，加入乙腈，高速匀浆后加入NaCl，剧烈振摇1min；取上层乙腈相离心，取上清液加入体积比1:1甲醇和水混合溶液过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品；3）标准工作溶液的配制：将不含乙基多杀菌素的同种类基质空白样品按上述步骤1)、2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的乙基多杀菌素系列混合标准工作液；4）测定和结果计算：将步骤3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤2)中净化后的样品液进行LC-MS-MS测定，测得样品液中乙基多杀菌素的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中乙基多杀菌素含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中乙基多杀菌素残留量。
2.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于：步骤1)试样制备中将样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。
3.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤2)提取及净化中称取5.0g已制备好试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min；取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。
4.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于：步骤4)测定和结果计算中所述的LC-MS-MS测定中液相色谱的流动相包括A相和B相，A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水；流速：0.3 mL/ min；流速：0.3 mL/ min；进样体积:1.0μL；柱温箱：45℃。
5.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的LC-MS-MS测定中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：
。
6.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的LC-MS-MS测定中液相色谱的色谱柱ZORBAX ECLIPSE PlusC18，2.1×50mm，1.8μm。
7.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的LC-MS-MS测定中质谱检测使用多反应监测(MRM)扫描模式，乙基多杀菌素的母离子、子离子，去簇电压和碰撞能量分别为：
。
8.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的LC-MS-MS测定中分析条件为：离子源温度375℃，离子源：ESI.电喷雾电压：5000V；雾化器压力：0.138MPa；辅助加热气：0.379MPa；扫描模式：正离子扫描。
9.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤1)中样品若为脱水蔬菜和水果，需降低称样量，并加适量水充分浸润。
10.根据权利要求1所述的一种蔬菜水果中乙基多杀菌素残留量的LC-MS-MS检测方法，其特征在于，步骤2)中用乙腈提取时加入氯化钠盐析含水量较少的样品盐析时需加水。
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