CN107102082A - 液相色谱‑质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留的检测方法，尤其涉及一种液相色谱‑串联质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒2,4‑二甲基苯基甲酰胺和2,4‑二甲基苯胺的方法。一种液相色谱‑质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，该方法试样加氨化水稀释后用氨化乙腈沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液进行净化，采用液相色谱‑质谱/质谱仪检测，双甲脒和2,4‑二甲基苯胺内标法定量，单甲脒和2,4‑二甲基苯基甲酰胺外标法定量。该方法的灵敏度能满足蜂王浆中双甲脒及其代谢物残留量的检测和确证要求。

Description

液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残 留量的方法

技术领域

本发明涉及蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留的检测方法，尤其涉及一种液相色谱-串联质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的方法。

背景技术

蜂王浆(royal jelly)，又名蜂皇浆、蜂皇乳、蜂王乳、蜂乳，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，是供给将要变成蜂王的幼虫的食物，也是蜂王终身的食物。蜂王浆就像哺乳动物的乳汁极具营养价值和免疫功能而且含有极高的长寿因子。营养学家认为蜂王浆是一种可供人类直接服用的高活性成分的超级营养食品。近些年研究表明，蜂王浆具有辅助降低血糖，抗氧化，降低血脂，控制血管扩张，降低血压，保护肝脏，抗菌消炎以及提高免疫力抗衰老等医疗和保健的功效，因此越来越受到人们的关注与欢迎。

中国是世界蜂王浆第一生产国，也是第一出口国，世界上90％以上的蜂王浆来自于中国，主要出口国家和地区有日本，欧盟和美国等发达国家和经济体。蜂王浆也是中国蜂产品的第二大主要产品，也是最具市场竞争力、最具高价值的蜂产品。蜂王浆作为一个重要的保健品，其需求量也受到经济大环境的影响，有数据表明2014年我国鲜王浆出口量为742778千克，同比下降8.18％；出口均价为27.12美元/千克，同比略降7.01％。2015年我国蜂王浆出口量713.8吨，金额为19136135美元，同比下降3.90％与5％。在出口量下降的同时，国内的需求量也在降低，这对蜂王浆产业提出了严峻的挑战，于此同时伴随着人民生活水平的提高，对蜂王浆质量要求也在不断的提高。蜂王浆中药物残留情况一直是消费者除营养成分外的主要关注点，我国的药物和抗生素曾经的滥用情况较为突出，在蜂产品中药物的检出对其出口造成不利影响。

双甲脒(Amitraz)，又称N,N-双(2,4-二甲苯亚氨基甲基)甲胺，是一种有机氮杀虫、杀螨剂，其具有触杀和熏蒸作用，对叶螨科各发育阶段的虫态都有效。因此广泛用于果树、蔬菜、茶叶、棉花、大豆、甜菜等作物防治多种害螨，对同翅目害虫也具有良好药效，还可以用于防治蚜虫、棉铃虫、红铃虫等害虫。对牛、羊、猪等家畜体外寄生螨也有效，可以防治体虱、壁虱、疥癣和恙虫等，在蜂蜜养殖中对蜂螨有较好的防治效果，且对蜜蜂属于低毒性，因此曾被广泛用于蜂巢除螨。如图1所示，根据双甲脒的化学性质，其可发生代谢或降解，先形成单甲脒(N-2,4-Dimethyl phenyl-N-methylformamidine，DMPF)、2,4-二甲基苯基甲酰胺(N-(2,4-DiMethylphenyl)formamide，DMF)，最终降解为及2,4-二甲基苯胺(2,4-Dimethylaniline，DMA)。其中单甲脒既是双甲脒的一个代谢产物，其自身也是杀螨剂。单甲脒能防治抗三氯杀螨醇的螨，杀螨卵、若螨和成螨，对棉红铃虫、水稻三化螟和二化螟也有一定活性。防治柑橘、苹果、棉花等作物上的螨，喷施可防治棉蚜。对瓢虫、草蛉、食虫蝽象、食螨瓢虫、棉田蜘蛛、蜜蜂、家蚕比较安全，其毒性较双甲脒要低。2,4-二甲基苯胺在化工合成中通常作为单甲脒和双甲脒的合成原料而被使用，其具有毒副作用和致突变性，研究表明2,4-二甲基苯胺对肝脏的损伤较大。

通过食物链传播或直接在蜂巢中使用双甲脒后，所产生的蜂王浆比较容易被双甲脒及其代谢物污染，进而影响人类健康，如表1所示，各国纷纷制定双甲脒在蜂产品中(以蜂蜜居多)的最低限量，来保证其的质量安全。

表1主要国家和经济体对蜂产品中双甲脒的限量要求

韩国等国家虽然在蜂王浆中并未明确规定双甲脒的限量要求，但在猪肉等其他动物源性产品以及果蔬产品中双甲脒的最低限量都有明确规定，我国在出口蜂王浆的残留监控中也曾明确要求双甲脒不得检出(同时检测代谢物)。

基于双甲脒的稳定性以及代谢情况和检测手段的限制，目前食品中双甲脒残留量的测定通常是将样品进行通过酸、碱环境下高温水解后对最终代谢产物2,4-二甲基苯胺进行测定，再转化成双甲脒的含量。其中以气相色谱法或者气相色谱-质谱法为主。

例如：GB 29707-2013《牛奶中双甲脒残留标志物残留量测定气相色谱法》用氢氧化钠溶液提取，水解成2,4-二甲基苯胺，液-液萃取，七氟丁酸衍生后气相色谱-电子捕获检测法检测，方法测定低限5ug/kg。与之类似，目前发布的检测标准中GB/T 5009.143-2003《蔬菜、水果、食用油中双甲脒残留量的测定》和农业部1163号公告-3-2009《动物性食品中双甲脒残留标示物检测气相色谱法》等均采用水解后测定最终水解产物2,4-二甲基苯胺来完成对双甲脒含量的测定。

对蜂产品中双甲脒或其代谢物残留量的测定主要集中在蜂蜜的检测中，蜂王浆的测定较少。当然也有研究人员直接对双甲脒的残留情况进行测定，从而获得其单体的残留含量，但该检测方式忽略了双甲脒降解转化的部分含量。

例如：GB/T 21169-2007《蜂蜜中双甲脒及其代谢物残留量测定-液相色谱法》对蜂蜜样品中的双甲脒及其代谢物用正己烷-异丙醇混合溶剂提取，依次用乙腈、水定容，HPLC进行测定，实现对蜂蜜中双甲脒和最终代谢产物2,4-二甲基苯胺的测定，方法定量限双甲脒0.01mg/kg，2,4-二甲基苯胺0.02mg/kg。徐锦忠等采用混合溶剂提取-液液萃取的前处理方法，液相色谱-质谱/质谱法测定蜂蜜中双甲脒和最终代谢产物2,4-二甲基苯胺的测定，方法测定低限5ug/kg(双甲脒)和10ug/kg(双甲脒)。

伴随着液相色谱-质谱/质谱法的广泛应用，为充分发挥其定量优势，研究人员陆续将双甲脒及其代谢物检测的方式进行拓展，应用液相色谱-质谱/质谱法对其在环境水、水果中的残留量进行测定，实现对化合物有效分离和确证的定性与定量分析。

例如：郭浩等采用固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定了鱼塘水中双甲脒及其代谢产物，方法对水样直接进行固相萃取净化，实现对双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的测定，方法定量限0.4-1.0ng/L。同时他也对血液样品进行稀释后直接通过固相萃取净化，实现对血液中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的测定。Nilgun Tokmana等采用乙酸乙酯提取-液相色谱串联质谱测定的方法实现了对梨样品中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的测定，方法测定低限10ug/kg。

对于蜂王浆中双甲脒及其代谢物的测定，目前仅有SN/T 2574-2010《进出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量检测方法气相色谱-质谱法》和周召千灯发表的文章《动物源产品中双甲脒及其代谢产物残留量的气相色谱-质谱法测定》有报道，该方法均采用加酸水解，碱化后用正己烷-乙醚(2+1，体积比)混合溶剂提取，酸、碱液-液分配净化，采用气相色谱-质谱仪检测最终水解产物2,4-二甲基苯胺，方法测定低限0.01mg/kg。

本发明基于更好的满足蜂王浆质量检验监管需要，保障人民生活安全，维护国家的利益，提高检测技术水平，扩展蜂王浆中双甲脒及其代谢物检测的方式，本发明研究采用液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢物单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺残留量的测定。

表2双甲脒及代谢物的基本性质

目前尚无通过液相色谱-质谱/质谱法对蜂王浆中双甲脒及其代谢物残留量测定的标准方法和研究报道。针对食品中双甲脒残留量的测定等研究报道通常是将样品进行通过酸、碱环境下高温水解后对最终代谢产物2,4-二甲基苯胺进行测定，再转化成双甲脒的含量。其中以气相色谱法(GC)或者气相色谱-质谱法(GC-MS)为主。已有研究人员通过液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)对蜂蜜和环境水等样品中双甲脒或其代谢物残留量的测定研究报道。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，该方法试样加氨化水稀释后用氨化乙腈沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液进行净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，双甲脒和2,4-二甲基苯胺内标法定量，单甲脒和2,4-二甲基苯基甲酰胺外标法定量。该方法的灵敏度能满足蜂王浆中双甲脒及其代谢物残留量的检测和确证要求。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，所述的代谢产物为单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺，该方法包括以下的步骤：

一、提取：

称取蜂王浆试样2.0g于两个50mL聚塞离心管中，加入同位素内标，加8mL 5％氨水溶液，2000转/分钟，涡旋混匀5分钟，静置5分钟，加10mL 5％氨水乙腈溶液，2000转/分钟，涡旋混匀，静置5分钟，定容至20mL，涡旋混匀5分钟，8500转/分钟离心，移取上清液2.0mL，加2mL 5％氨水乙腈溶液混匀，涡旋混匀，8500转/分钟离心，取上清液待净化；

二、净化

将提取溶液转移至氧化铝固相萃取柱，氧化铝固相萃取柱采用3mL乙腈和3mL 5％氨水乙腈溶液依次活化，接收流出液，加2mL 5％氨水乙腈溶液洗涤氧化铝固相萃取柱，接收全部流出液，40℃下氮气吹至0.5mL以下，加乙腈至2mL，再加2mL水，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待LC-MS/MS测定；

三、测定

3.1)液相色谱参数：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，150mm×4.6mm(i.d)，5μm；

进样量：10μL；柱温：25℃；

流动相：0.15％甲酸溶液和乙腈梯度洗脱；液相色谱梯度洗脱程序如下：

3.2)质谱参数

离子源参数：电离方式：电喷雾电离；扫描模式：正离子；监测模式：多反应监测；离子源温度：130℃；气体流速：16L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：2500V；

双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的质谱参数如下：

*表示为定量离子对；

3.3)空白试验

除不加试样外，均按步骤3.1)和3.2)测定方法进行；

3.4)结果计算和表述

按公式(1)计算试样中蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量：

式中：

X—试样中蜂王浆中双甲脒及其代谢产物量的含量，单位为毫克每千克；

C—由标准工作曲线得到样液中蜂王浆中双甲脒及其代谢产物的浓度，单位为微克每毫升；

V—样液最终体积，单位为毫升；

m—最终样液所代表的试样量，单位为克。

本发明由于采用了上述的技术方案，该方法试样加氨化水稀释后用氨化乙腈沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液进行净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，双甲脒和2,4-二甲基苯胺内标法定量，单甲脒和2,4-二甲基苯基甲酰胺外标法定量。该方法的灵敏度能满足蜂王浆中双甲脒及其代谢物残留量的检测和确证要求。

附图说明

图1双甲脒主要的代谢路径。

图2资生堂-C₁₈ 150mm×4.6mm(i.d)，3μm对双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的分离情况(液相色谱-质谱/质谱法)。

图3Agilent Eclipse XDB-C18150mm×4.6mm(i.d)，5μm色谱柱对双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的分离情况(液相色谱-质谱/质谱法)。

图4Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱，甲醇-0.15％甲酸水为分离体系对双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的分离情况(液相色谱-质谱/质谱法)。

图5双甲脒液相色谱质谱/质谱法测定主要离子碎片。

图6单甲脒液相色谱质谱/质谱法测定主要离子碎片。

图7 2,4-二甲基苯基甲酰胺液相色谱质谱/质谱法测定主要离子碎片。

图8 2,4-二甲基苯胺液相色谱质谱/质谱法测定主要离子碎片。

图9～图12蜂王浆中双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺测定的标准工作曲线(液相色谱-质谱/质谱法)。

图13空白王浆基质加标标准溶液液相色谱-质谱/质谱法总离子流图(浓度0.005mg/kg)。

图14～图17空白王浆基质加标标准溶液液相色谱-质谱/质谱法总离子流图(浓度0.005g/kg)。

图18空白王浆基质加标标准溶液的液相色谱-质谱/质谱法提取离子流图(浓度0.005mg/kg)。

图19～图22空白王浆基质液相色谱-质谱/质谱法总离子流图。

图23王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法总离子流图(添加浓度0.005mg/kg)。

图24～图27王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法提取离子流图(添加浓度0.005mg/kg)。

图28王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法总离子流图(添加浓度0.01mg/kg)。

图29～图32王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法提取离子流图(添加浓度0.01mg/kg)。

图33王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法总离子流图(添加浓度0.1mg/kg)。

图34～图37王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法提取离子流图(添加浓度0.1mg/kg)。

图38王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法总离子流图(添加浓度0.2mg/kg)。

图39～图42王浆基质加标回收实验溶液液相色谱-质谱/质谱法提取离子流图(添加浓度0.2mg/kg)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

1提取：

称取蜂王浆试样2.0g(精确至0.01g)于两个50mL聚塞离心管中，加入同位素内标，加8mL 5％氨水溶液，2000转/分钟，涡旋混匀5分钟，静置5分钟，加10mL 5％氨水乙腈溶液，2000转/分钟，涡旋混匀，静置5分钟，定容至20mL，涡旋混匀5分钟，8500转/分钟离心，移取上清液2.0mL，加2mL 5％氨水乙腈溶液混匀，涡旋混匀，8500转/分钟离心，取上清液待净化。

由于双甲脒的不稳定性，因此首先对化合物的稳定性进行考察，另外，由于蜂王浆样品的特殊性，在对测定蜂王浆样品中药物残留时，通常需要对样品去除蛋白，来降低蛋白对测定的影响。试验综合考察了1％氨水溶液，3％氨水溶液和5％氨水溶液，以及1％氨水乙腈溶液，3％氨水乙腈溶液和5％氨水乙腈溶液沉淀蛋白和提取情况，研究发现5％氨水溶液加入可以有效改变蜂王浆基质的酸碱度，有助于提高前处理过程中化合物的稳定性(蜂王浆样品pH约为6左右，2g蜂王浆样品加入8mL 5％氨水溶液pH可以调整至9-10之间，与文献报道的最佳稳定条件相一致)。5％氨水乙腈溶液不但可以有效保持pH值稳定，同时还起到有效沉淀蜂王浆中的蛋白质的作用。

前处理过程中，加入5％氨水乙腈溶液后，静置有助于提高蛋白的沉淀效率，有助于后续固相萃取柱的净化本发明(研究发现：不静置加入5％氨水乙腈溶液涡旋混合后直接离心，蛋白沉淀不充分，后续固相萃取净化时会发生固相萃取柱阻塞的情况)。

研究发现，在固相萃取净化前，向提取液中加入2mL5％氨水乙腈溶液可以进一步沉淀蛋白质，减少蛋白质对检测的影响。

2净化

将提取溶液转移至氧化铝固相萃取柱(3mL乙腈和3mL 5％氨水乙腈溶液依次活化)，接收流出液，加2mL 5％氨水乙腈溶液洗涤氧化铝固相萃取柱，接收全部流出液，40℃下氮气吹至0.5mL以下，加乙腈至2mL，再加2mL水，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待LC-MS/MS测定。

目前样品前处理净化通常有液-液分配和固相萃取净化两种方式，对双甲脒及代谢物的测定前期通过水解后液-液分配净化的方式较多，伴随着检测技术的发展，也有研究人员采用固相萃取净化技术对样品中的双甲脒及代谢物进行提取和净化。固相萃取净化(Solid-Phase Extraction，简称SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，可以有效的净化样品，减少基质背景的影响具有重要的作用。

试验通过纯标准物质分别考察了C18、HLB、MCX和中性氧化铝四种固相萃取柱。C18和HLB固相萃取柱分别考查水上样，水淋洗，二氯甲烷，甲醇，乙腈和混合溶剂二氯甲烷-乙腈-甲醇(2+1+1，体积比)混合溶剂进行洗脱。MCX固相萃取柱则采用酸性水溶液上样，中性水淋洗，5％氨化甲醇洗脱，中性氧化铝柱(Al2O3)直接用5％氨化乙腈进行洗脱接收。本发明结果如表4所示。

表4固相萃取条件的摸索

综上所述，采用中性氧化铝固相萃取的方式可以对目标化合物均达到较好的净化效果。

3、测定条件的选择

3.1流动相和定容溶剂的选择

本发明选择C18色谱柱对目标化合物进行分离，本发明考查了Agilent EclipseXDB-C₁₈150mm×4.6mm(i.d)，5μm和资生堂-C₁₈ 150mm×4.6mm(i.d)，3μm两种色谱柱进行试验，主要考察化合物的分离度和灵敏度，对双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺进行测定，结果显示如图2和图3所示，两个色谱柱均可以达到很好的分离，采用资生堂-C₁₈ 150mm×4.6mm(i.d)，3μm双甲脒略有伸舌现象。

本发明分别考察了甲醇和乙腈为有机相，0.15％甲酸水溶液为水相的色谱分离体系，结果如图3和图4显示，乙腈为有机相分离情况明显好于甲醇为流动相进行分离。试验发现对蜂王浆样品进行测试，色谱图在2,4-二甲基苯胺出峰前会有比较明显的基质干扰，乙腈-0.15％甲酸溶液梯度洗脱可以对蜂王浆样品基质的干扰谱峰进行较好的分离，而不影响2,4-二甲基苯胺的定量。因此本发明最终采用Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱，采用乙腈-0.15％甲酸水为分离体系，且在初始比例乙腈-0.15％甲酸水溶液(4+6，体积比)时对蜂王浆基质的干扰峰分离情况最佳。色谱测试条件如表5所示。

表5液相色谱梯度洗脱程序

通常样品稀释溶剂对待测物质的峰形、分离度和灵敏度存在一定的影响，一般采用流动相作为样品稀释溶剂，梯度洗脱程序时选用0时间的流动相比例。试验考察了采用乙腈-0.15％甲酸水(4+6，体积比)作为定容溶剂，试验表明在该条件下，双甲脒容易发生降解，8个小时几乎可以完全分解。研究对比采用乙腈-水(1+1，体积比)作为定容溶剂，各化合物可以稳定存在24小时以上。因此最终采用乙腈-水(1+1，体积比)作为定容溶剂，并且在试验后立刻展开测试。

最终液相色谱参数：C18色谱柱，150mm×4.6mm(i.d)，5μm，或相当者。进样量：10μL。柱温：25℃。流动相：0.15％甲酸溶液(12.6)和乙腈(12.1)梯度洗脱。

3.2质谱参数的确认

本发明采用流动注射的方式在正离子模式下对双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺标准溶液进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描，选择信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定性和定量离子对。由于双甲脒的稳定性原因，在摸索质谱参数的时候需要关注离子源的参数，以避免双甲脒在检测的过程中发生源内裂解(研究发现双甲脒源内裂解的主要产物是单甲脒)，各类药物的质谱参数见表6，子离子全扫描质谱图见图5-8。

离子源参数：电离方式：电喷雾电离。扫描模式：正离子。监测模式：多反应监测(MRM)。离子源温度：130℃(Gas Temp)。气体流速：16L/min(Gas Flow)。鞘气温度：250℃(Sheath Gas Temp)。鞘气流速：11L/min(Sheath Gas Flow)。毛细管电压：2500V(Capillary)。

表6双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的质谱参数

*表示为定量离子对。

4、方法基质效应的考察

液相色谱-质谱/质谱法测定食品中药物残留时，有时基质对离子对具有增强或抑制效应。为了消除基质效应，可以添加同位素内标，同位素内标不但可抵消离子化时的基质效应，还可消除样品前处理过程中的差异，但在检测复杂基质时尽管有些药物采用内标法定量也很难抵消基质效应，造成定量结果偏差。用空白样品提取液稀释标准溶液，可使标准工作曲线溶液和样品溶液具有同样的离子化条件，从而减少甚至消除样品基质效应。

本发明通过外标法考察纯溶剂(乙腈-水，1+1，体积比)配制获得线性标准工作曲线和空白样品获得的基质加标线性工作曲线的测定结果。两条线性工作曲线获得的添加回收率，结果表明，王浆空白基质对4个化合物均存在较为明显基质抑制，抑制效率约30％左右。本发明采用空白基质加标的方式来获取线性工作曲线，对化合物进行定量计算。

6、方法的主要技术指标

6.1、线性范围和定量限

根据基质效应考察结果，最终选用空白基质作为标准工作曲线溶液的稀释溶剂，分别获得双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺溶液浓度分别为0、0.25、0.5、5、10、15ng/mL，对应的质量浓度分别为0、0.005、0.01、0.1、0.2、0.3mg/kg的标准线性工作曲线溶液，添加浓度分别为0.005，0.01，0.1，0.2mg/kg。在所确定的本发明条件下进行测试，测试结果中单甲脒和2,4-二甲基苯基甲酰胺测定其峰面积，以待测物峰面积Y为纵坐标，待测物质量浓度X(mg/kg)为横坐标，双甲眯和2,4-二甲基苯胺以待测物与内标物峰面积比值Y为纵坐标，待测物质量浓度X(mg/kg)为横坐标，绘制标准溶液工作曲线如表8和图9～图12所示。

表8蜂王浆中双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺测定的标准工作曲线

蜂王浆空白基质加标(溶液浓度0.005mg/kg)，空白蜂王浆和在空白王浆中添加浓度为0.005，0.01，0.1，0.2mg/kg经过前处理本发明后的标准物质的总离子流图和提取离子流图参见图13-42，空白基质加标回收样品(浓度0.005mg/kg)双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺各化合物定量离子对谱峰信噪比(S/N)如图24～27所示，分别为双甲脒(294.5/163.2，2217)，单甲脒(163.2/122.2，152)，2,4-2,4-二甲基苯基甲酰胺(150.1/107.1，10)，二甲基苯胺(122.1/107.1，37.1)，定量限符合要求。

6.2、方法回收率和精密度数据

本发明参照检验检疫食品化妆品专业化学分析方法验证程序，选用不含待测组分的蜂王浆样品，对双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺进行4个浓度水平(0.005，0.01，0.1和0.2mg/kg)的添加回收本发明，每个浓度水平取6个平行样，双甲眯回收率84.0％-109.5％，相对标准偏差为1.0％-6.8％；单甲脒回收率50.5％-72.0％，相对标准偏差为1.6％-15.0％；2,4-二甲基苯基甲酰胺回收率80.0％-107.3％，相对标准偏差为2.2％-8.6％；2,4-二甲基苯胺回收率80.0％-110.4％，相对标准偏差为0.8％-9.8％。

Claims (1)

1.液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，所述的代谢产物为单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺，其特征在于该方法包括以下的步骤：

一、提取：

称取蜂王浆试样2.0g于两个50mL聚塞离心管中，加入同位素内标，加8mL 5％氨水溶液，2000转/分钟，涡旋混匀5分钟，静置5分钟，加10mL 5％氨水乙腈溶液，2000转/分钟，涡旋混匀，静置5分钟，定容至20mL，涡旋混匀5分钟，8500转/分钟离心，移取上清液2.0mL，加2mL 5％氨水乙腈溶液混匀，涡旋混匀，8500转/分钟离心，取上清液待净化；

二、净化

将提取溶液转移至氧化铝固相萃取柱，氧化铝固相萃取柱采用3mL乙腈和3mL 5％氨水乙腈溶液依次活化，接收流出液，加2mL 5％氨水乙腈溶液洗涤氧化铝固相萃取柱，接收全部流出液，40℃下氮气吹至0.5mL以下，加乙腈至2mL，再加2mL水，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待LC-MS/MS测定；

三、测定

3.1)液相色谱参数：Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱，150mm×4.6mm(i.d)，5μm；

进样量：10μL；柱温：25℃；

流动相：0.15％甲酸溶液和乙腈梯度洗脱；液相色谱梯度洗脱程序如下：

时间(min) 流速(mL/min) 0.15％甲酸水溶液(％) 乙腈(％) 0.00 0.4 60.0 40.0 8.00 0.4 35.0 65.0 9.00 0.7 5.0 95.0 14.00 0.7 5.0 95.0 15.00 0.7 60.0 40.0 16.00 0.4 60.0 40.0 19.00 0.4 60.0 40.0

3.2)质谱参数

离子源参数：电离方式：电喷雾电离；扫描模式：正离子；监测模式：多反应监测；离子源温度：130℃；气体流速：16L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：2500V；

双甲眯、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的质谱参数如下：

*表示为定量离子对；

3.3)空白试验

除不加试样外，均按步骤3.1)和3.2)测定方法进行；

3.4)结果计算和表述

按公式(1)计算试样中蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量：

<mrow> <mi>X</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>C</mi> <mi>V</mi> </mrow> <mi>m</mi> </mfrac> <mn>...</mn> <mrow> <mo>(</mo> <mn>1</mn> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>

式中：

X—试样中蜂王浆中双甲脒及其代谢产物量的含量，单位为毫克每千克；

C—由标准工作曲线得到样液中蜂王浆中双甲脒及其代谢产物的浓度，单位为微克每毫升；

V—样液最终体积，单位为毫升；

m—最终样液所代表的试样量，单位为克。