CN109459524A

CN109459524A - 一种同时测定禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留的方法

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Publication number: CN109459524A
Application number: CN201811555912.XA
Authority: CN
Inventors: 曹小彦; 蓝梦哲; 周九林; 李金连; 周敏
Original assignee: Sva Measurement & Measurement (hunan) Co Ltd; Guangzhou GRG Metrology and Test Technology Co Ltd
Current assignee: Grg Metrology & Test Hunan Co ltd; Radio and TV Measurement and Testing Group Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109459524B

Abstract

本发明公开了一种同时测定禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留的方法，包括如下步骤：S1.称取待测样品，通过QuEChERs进行分散提取，上清液过滤后即得待测试样，绘制基质标准曲线；S2.将S1中所得待测试样经过液相色谱串联质谱同时测定6种拟除虫菊酯类农药的残留量，以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量；本发明通过对禽蛋样品进行QuEChERS净化，有效除去样品中的干扰测定的基质，空白样品基质配标，利用液相色谱串联三重四级杆质谱以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定6种拟除虫菊酯农药残留量。经过优化后，鸡蛋中目标农药化合物回收率达到77.1%～109.4%，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15%，线性范围在0.005mg/kg～0.200mg/kg之间。

Description

一种同时测定禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留的方法

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，更具体地，涉及一种同时测定禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留的方法。

背景技术

在家禽饲养，例如蛋鸡饲养过程中，母鸡会遭受寄生虫、虱子、螨类等病原物的侵害，从而对鸡生长发育均有不同程度的危害，导致的产蛋量下降。为了治疗这些疾病，鸡农通常会使用杀虫剂杜绝疾病蔓延；目前，鸡农常用的杀虫剂有以氟虫腈为首报道的杀虫剂外，更多还会使用到拟除虫菊酯类农药，用来兑水稀释喷撒消毒。

拟除虫菊酯类农药是目前应用广泛的一类的仿生合成杀虫剂，其结构或生物活性与天然除虫菊类似。此类农药过去被认为高效、低毒、杀虫谱广，用来代替有机氯农药和其他剧毒长残留杀虫剂，其中，生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯、胺菊酯及醚菊酯已在家禽的外寄生虫(如：虱、螨、蜱、臭虫)、其他害虫(如：蚊、苍蝇)以及生活在鸡舍垫料中的一些昆虫的防治中得到了广泛应用。

然而杀虫剂经食物链会进入鸡蛋、鸡肉当中，此外，由于环境的污染，也可能经过禽饲料进入禽类养殖食物链中，最终对人体造成危害，因此建立检测禽类鸡蛋中上述六种拟除虫菊酯类农药就显得十分必要。

现有的文献和专利大多集中在植物源性食品的研究，动物源性食品中农药的测定方法的研究主要集中在有机氯和有机磷等农药，而拟除虫菊酯类农药的测定方法研究较少，且主要采用气相色谱-质谱联用的方法，液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪测定的方法较少(陈中祥,战培荣,覃东立,等.气相色谱-质谱法测定水产品中氟胺氰菊酯残留量[J].水产学杂志,2013,26(4):29-32.；沈燕,刘贤进,孙星,等.陈中祥,战培荣,覃东立,等.气相色谱-质谱法测定水产品中氟胺氰菊酯残留量[J].水产学杂志,2013,26(4):29-32.；邓武剑,吴卫东,赵旭,等.气相色谱-三重四极杆质谱法快速检测鸡蛋中氟虫腈及其代谢物[J].色谱,2018,36(6):547-551.；王秀丽.气相色谱法测定鸡蛋中有机氯农药残留[J].家禽科学,2005(1):34-35.)，而同时在鸡蛋中检测生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯、胺菊酯及醚菊酯这6种拟除虫菊酯类农药残留的方法还未见报道。

液液萃取法和固相萃法取常用于样品中有机农药的前处理净化。但在禽蛋中，由于油脂、蛋白质含量较高，在萃取后还需要再除油脂、蛋白，因而使前处理的操作更加繁琐复杂，难以适用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有的禽蛋类样品前处理存在的缺陷和不足，提供一种QuEChERs分散萃取净化禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药的方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术中缺少检测禽蛋中拟除虫菊酯类方法的缺陷，提供一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱同时测定禽蛋中生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯、胺菊酯及醚菊酯这6种拟除虫菊酯类农药残留的方法，可根据保留时间和离子丰度比值进行定性，定量离子进行定量，提高方法的准确度。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种QuEChERs分散萃取净化禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药的方法，包括如下步骤：

S1.预处理：禽蛋去壳，将蛋清与蛋黄搅拌均匀，得待测样品；

S2.提取：取待测样品，加入1％乙酸酸化乙腈提取液、氯化钠，混匀离心；

S3.分散萃取净化：取S2上清液，加入C18和PSA的复合分散萃取填料，混匀、离心；

所述6种拟除虫菊酯类农药为生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯、胺菊酯及醚菊酯。

本发明针对鸡蛋中含有的脂肪、胆固醇以及蛋白质等可能产生基质效应物质，会干扰液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪对拟除虫菊酯类农药的分析，分别通过对比C18柱、PSA、Si和ALN分散萃取净化后的脂肪酸组成和浓缩后残留物剩余分量，分别找出了两种鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药较好的净化填料：C18和PSA；其中，碳十八烷基硅烷键合硅胶(C18)填料对非极性的组分具有吸附作用，能有效去除低极性杂质和高级脂肪酸酯类等大分子基质干扰物；N-丙基乙二胺(PSA)能有效地去除脂肪酸和有机酸。

针对鸡蛋蛋白含量高，乙腈极性强，既能有效提取拟除虫菊酯农药，又能沉淀蛋白，通过乙酸、乙酸铵等调节，给方法提供弱酸等缓冲盐体系，提高拟除虫菊酯类农药的提取效率。通过对比乙腈、1％乙酸酸化乙腈、乙酸铵+乙腈(1g/20mL)三种提取剂对拟除虫菊酯类农药的提取效果，找到一种鸡蛋中拟除虫菊酯类农药较好的提取溶剂：1％乙酸酸化乙腈。

再有，以1％乙酸酸化乙腈作为提取溶剂，C18和C18+PSA复合净化填料对鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药回收率进行对比分析，结果表明以C18+PSA作为分散萃取净化填料，对于鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药提取效率最佳。与传统的固相萃取方式相比，分散萃取净化试剂使用量少、快速，且能针对鸡蛋选择合适的净化方案，有效消除特殊样品的基质干扰。解决了鸡蛋按照常规检测方法出现回收率偏低的问题。

优选地，S2中所述1％乙酸酸化乙腈提取液的体积是待测样品质量的2～4倍。

优选地，S4中所述上清液与C18、PSA的质量体积比为每1mL上清液中加0.1gC18和0.1gPSA。

一种同时测定禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留的方法，包括如下步骤：

S1.按上述方法对待测样品进行预处理，上清液氮吹浓缩过滤后即得待测试样，空白样品基质配标；

S2.将S1中所得待测试样经过液相色谱串联质谱同时测定6种拟除虫菊酯类农药的残留量，以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量；

所述气相色谱条件为：色谱柱IntersiL ODS C18；进样量：2μL；流速：0.4mL/min；梯度洗脱，流动相为体积百分比(5～90％)：(10％～95％)的A液和B液组成，A液为含0.1％甲酸的甲醇溶液，B液为含0.1％甲酸和0.5mmol/L乙酸铵的甲醇溶液；洗脱程序为梯度洗脱；所述梯度洗脱程序为：起始比例A相为90％，B相为10％，维持1min；1～3min，A相降至5％，B相升至95％，维持至4.5min；4.5～5.5min，A相升至90％，B相降至10％，维持至6min；

所述质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：150℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流量：1000L/Hr；锥孔气流量：20L/hr；毛细管电压0.5kV；

优选地，S1所述空白样品基质配标为称取不含6种拟除虫菊酯类农药的阴性样品，按照待测样品的提取方法提取得到提取液，将提取液与标准品溶液混合而成，用高效液相色谱串联质谱法测定6种拟除虫菊酯类农药与空白样品基质混合标准工作溶液中各农药组分的提取离子峰面积，以浓度为横坐标，以提取离子峰面积为纵坐标，绘制出6种拟除虫菊酯类农药的标准工作曲线。

本发明检测方法为：高效液相色谱串联质谱法测定禽蛋QuEChERs分散萃取净化液中的6种农药残留量，记录提取离子峰面积，基质外标法定量，得到所述禽蛋样品提取净化液中6种农药的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到禽蛋样品中待测6种拟除虫菊酯类农药残留量；

定量计算公式：w＝(p×v×f)/m，式中：w为样品中待测6种拟除虫菊酯类农药残留量，单位为mg/kg；p为测定值，单位为ng/mL；m为称取的样品量，单位为g；v为定容体积，单位为mL；f为稀释倍数。

优选地，S1所述过滤为采用0.22μm滤膜进行过滤。

优选地，所述色谱柱为规格为2.1mm×150mm，3μm。

优选地，所述液相色谱串联质谱为液相色谱串联三重四级杆质谱。

优选地，所述禽蛋为鸡蛋。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明经过对鸡蛋样品进行QuEChERS净化方式优化，有效除去样品中的干扰测定的基质，空白样品基质配标，利用液相色谱串联三重四级杆质谱以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定6种拟除虫菊酯农药残留量。使用液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪测定进行检测，每针总时长为5min，与现有技术气相色谱和气相色谱串联质谱分析约25min相比，效率大大提高。经过优化后，鸡蛋中目标农药化合物回收率达到77.1％～109.4％，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15％，线性范围在0.005mg/kg～0.200mg/kg之间，检出限和定量限均能满足国家标准中对鸡蛋中6种菊酯农药残留限量的最低要求。方法分离良好专属性强，检出限和定量限足够低，线性范围良好，重复性好，准确可靠，可推广应运用于日常鸡蛋监督检测当中。

附图说明

图1为本发明不同分散萃取填料对鸡蛋油脂净化效果对比。

图2为本发明不同分散萃取填料对鸡蛋油脂、蛋白等杂质净化效果对比。

图3为本发明检测方法的6种拟除虫菊酯杀农药的标准品溶剂标准曲线和基质标准曲线。

图4为本发明检测方法6种拟除虫菊酯杀农药的总离子流图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。以下为本发明具体实施方式用到的仪器和试剂：

液相色谱三重四级杆串联质谱仪(Waters TQ-Smicro)

标准物质：6种菊酯类农药成分(生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、甲氰菊酯和苯醚菊酯、胺菊酯、醚菊酯)

分析纯试剂：乙酸(华润化学，500mL)，乙酸铵(广州，500g)，氯化钠(广州，500g)。

色谱纯试剂：乙腈(CNW 4L)

质谱级试剂：乙腈、甲酸、乙酸铵(Fisher)

净化填料：PSA(CNW)，C18(CNW)，ALN(CNW)、Si(CNW)分散萃取填料

实施例1 QuEChERs前处理方法优化

采用QuEChERs分散萃取净化方式对鸡蛋进行前处理，通过以下方式来优化

1、固相萃取柱对油脂、蛋白的净化效果比较

(1)通过对比C₁₈、PSA、Si和ALN固相萃取柱对油脂的净化效果，找出一种鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药较好的净化填料。对比乙腈提取液浓缩后所得油脂进行甲酯化，以面积归一法(％)进行比较，其结果如图1和表1所示：

表1不同分散萃取填料对油脂的净化效果影响

由上述数据可知，对于鸡蛋油脂净化效果最佳的固相萃取填料依次为：C₁₈>PSA>ALN>Si。

(2)通过对比乙腈提取液氮吹浓缩前后，所得离心管的重量差值进行比较，其结果如图2和表2所示：

表2不同分散萃取填料对蛋白的净化效果影响

分散萃取填料(各0.5g)	氮吹浓缩前后离心管重量差值(g)
		C18	0.0622
PSA	0.1085
		ALN	0.0216
Si	0.0027

由上述数据可知，对于鸡蛋油脂、蛋白等杂质净化效果最佳的分散萃取填料依次为：PSA>C₁₈>ALN>Si。

2、通过对比乙腈、1％乙酸酸化乙腈、乙酸铵+乙腈(1g/20mL)三种提取剂对拟除虫菊酯类农药：生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯、胺菊酯及醚菊酯的提取效果，找出一种鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药较好的提取溶剂；对比不同提取溶剂对农药的提取效率，以0.06mg/kg进行加标回收实验，回收率(％)进行比较如表3所示：

表3不同提取剂的提取效果比较

由上述数据可知，当采用1％乙酸酸化乙腈进行提取时，对6种拟除虫菊酯类农药提取效果最好。

3、考察以1％乙酸酸化乙腈作为提取溶剂，0.5g C₁₈和0.5gC₁₈+0.5gPSA复合净化填料对鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药回收率的影响，以0.06mg/kg进行加标回收实验，回收率(％)进行比较结果如表4所示：

表41％乙酸酸化乙腈+不同净化填料对6种拟除虫菊酯类农药提取效率的影响

通过上述比对实验，表明在1％乙酸酸化乙腈提取溶剂下，以C₁₈+PSA复合填料作为分散萃取净化填料，对于鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药提取效率最佳。

实施例2 QuEChERs液相色谱串联三重四级杆质谱测定鸡蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留

1、标准溶液的制备

(1)6种农药混合储备液1(用以稀释曲线和检出限验证)：称取各标准物质适量到同一容量瓶中，用乙腈溶解并稀释成苯醚菊酯、甲氰菊酯、醚菊酯、胺菊酯浓度约为50μg/mL，其余项目为5μg/mL的储备液。

(2)6种农药混合储备液2(用以做加标回收试验)：称取各标准物质适量到同一容量瓶中，用乙腈溶解并稀释浓度为5μg/mL的储备液。

2、样品溶液的制备

(1)鸡蛋去壳将蛋清与蛋黄搅拌均匀，取10g样品于50mL聚乙烯离心管中，加10mL水、20mL 1％乙酸酸化乙腈提取液、5g氯化钠，涡旋提取5min，然后于4000r/min离心5min。

(2)取上清液5mL，加入0.5gC₁₈+0.5gPSA复合净化填料，涡旋1min并于4000r/min离心5min。

(3)取2mL洗脱液氮吹浓缩，用1mL含0.1％甲酸和0.5mmol/L乙酸铵的甲醇溶液复溶，上清液过0.22μm滤膜，装瓶，上机。

3、色谱条件

经过优化的液相色谱条件：IntersiL ODS C18色谱柱(2.1mm×150mm，3μm))；进样量2μL；流速：0.4mL/min；柱温40℃；梯度洗脱，洗脱液A为含0.1％甲酸的甲醇溶液，洗脱液B为含0.1％甲酸和0.5mmol/L乙酸铵的甲醇溶液，洗脱程序见表5。

表5洗脱程序

4、质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：150℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；锥孔气流量：20L/hr；毛细管电压0.5kV。雾化气、去溶剂气、辅助加热气为高纯氮气、碰撞气为高纯氩气。其他电压值、监测离子对、定量离子对等见下表6。

表6 6种拟除虫菊酯杀虫剂的质谱测定参数

备注：“*”表示定量离子。

5、基质配标准工作曲线

按照步骤2样品前处理步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，并把提取液与标准品溶液混合而成，配成基质混合标准工作溶液，外标法定量，空白样品基质配标的浓度范围与混合标准使用液相同。

用高效液相色谱串联质谱法测定6种拟除虫菊酯类农药与空白样品基质混合标准工作溶液中各农药组分的提取离子峰面积，以浓度为横坐标，以提取离子峰面积为纵坐标，绘制出6种拟除虫菊酯类农药的标准工作曲线；

通过其斜率进行计算：ME(％)＝(基质标曲斜率/溶剂标曲斜率-1)×100；ME：0％～20％：弱基质效应；ME：20％～50％，中等基质效应；ME＞50％，强基质效应；若为负值则是负效应。由图3结果可知，利用液相质谱测定鸡蛋中拟除虫菊酯农药以基质负效应为主。

6、上机数据采集：取标准溶液和样品溶液各2μL注入气相质谱仪，通过保留时间和离子丰度比定性、定量离子峰面积定量。上述条件得出的6种拟除虫菊酯类农药的出峰情况和定量定性离子的选择，其结果如表7所示。

具体为高效液相色谱串联质谱法测定禽蛋QuEChERs分散萃取净化液中的6种农药残留量，记录提取离子峰面积，基质外标法定量，得到所述禽蛋样品提取净化液中6种农药的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到禽蛋样品中待测6种拟除虫菊酯类农药残留量；

表7本发明6种拟除虫菊酯类农药的出峰情况和定量定性离子的选择

实施例3检测方法性能验证

分析实施例2所述检测方法标准曲线的线性，方法的最低检测限，最低定量限，回收率(准确度)和重复性、重现性(精密度)等。

1、线性范围(μg/mL)

6种农药混合储备液1(用以稀释曲线和检出限验证)：称取各标准物质适量到同一容量瓶中，用乙腈溶解并稀释成苯醚菊酯、甲氰菊酯、醚菊酯、胺菊酯浓度约为50μg/mL，其余项目为5μg/mL的储备液，具体如下表8：

结果显示，本发明6种拟除虫菊酯类农药在0.02～0.400μg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996，其线性关系如表8所示：

表8本发明检测方法的线性范围

2、检出限和定量限

取标准溶液进行测试，以信噪比为3时候的浓度为检出限，信噪比为10时的浓度为定量限，结果如表9所示：

表9本发明检测方法的检出限和定量限

3、精密度

6种农药混合储备液2(用以做加标回收试验)：称取各标准物质适量到同一容量瓶中，用乙腈溶解并稀释浓度为5μg/mL的储备液。以0.060mg/kg的含量标准进行加标回收率的实验，每种杀虫剂的加标回收实验重复6次，精密度结果见表10。

表10本发明检测方法的精密度

4、准确度

各称取三份混合均匀的样品10g(精确到0.001g)置于小烧杯中，按照下表加入标准溶液，按照实施例2制备好供试液，进行测试，计算回收率。其结果如表11～13所示：

表11水平一加标回收率(0.06mg/kg)

表12水平二加标回收率(0.10mg/kg)

表13水平三加标回收率(0.20mg/kg)

从上述结果可以看出，本发明经过对鸡蛋样品进行QuEChERS净化方式优化，有效除去样品中的干扰测定的基质，空白样品基质配标，利用液相色谱串联三重四级杆质谱以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定6种拟除虫菊酯农药残留量。

经过优化后，鸡蛋中目标农药化合物回收率达到74.7％～108.6％，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15％，线性范围在0.020mg/kg～0.400mg/kg之间，检出限和定量限均能满足国家标准中对鸡蛋中6种菊酯农药残留限量的最低要求。本发明方法分离良好专属性强，检出限和定量限足够低，线性范围良好，重复性好，准确可靠，可推广应运用于日常鸡蛋监督检测当中。理论上也适用于所有禽蛋的检测。

Claims

1.一种QuEChERs分散萃取净化禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2.提取：取待测样品，加入1%乙酸酸化乙腈提取液、氯化钠，混匀离心；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述1%乙酸酸化乙腈提取液的体积是待测样品质量的2～4倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中所述上清液与C18、PSA的质量体积比为每1mL上清液中加0.1gC18和0.1gPSA。

4.一种同时测定禽蛋中6种拟除虫菊酯类农药残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.按权利要去1～3任一项所述方法对待测样品进行预处理，上清液氮吹浓缩过滤后即得待测试样，空白样品基质配标；

所述液相色谱条件为：色谱柱IntersiL ODS C18；进样量：2μL；流速：0.4mL/min；梯度洗脱，流动相为体积百分比（5～90%）：（10%～95%）的A液和B液组成，A液为含0.1%甲酸的甲醇溶液，B液为含0.1%甲酸和0.5mmol/L乙酸铵的甲醇溶液；洗脱程序为梯度洗脱；所述梯度洗脱程序为：起始比例A相为90%，B相为10%，维持1min；1～3min，A相降至5%，B相升至95%，维持至4.5min；4.5～5.5 min，A相升至90%，B相降至10%，维持至6 min；

所述质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描（ESI+）；扫描方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流量：1000L/Hr；锥孔气流量：20 L/hr；毛细管电压0.5kV；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1所述空白样品基质配标为称取不含6种拟除虫菊酯类农药的阴性样品，按照待测样品的提取方法提取得到提取液，将提取液与标准品溶液混合而成，用高效液相色谱串联质谱法测定6种拟除虫菊酯类农药与空白样品基质混合标准工作溶液中各农药组分的提取离子峰面积，以浓度为横坐标，以提取离子峰面积为纵坐标，绘制出6种拟除虫菊酯类农药的标准工作曲线。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1所述过滤为采用0.22μm滤膜进行过滤。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为规格为2.1mm×150mm，3μm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱为液相色谱串联三重四级杆质谱。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禽蛋为鸡蛋。