CN104155398B - 一种检测畜禽毛发中抗病毒药物残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。

Description

一种检测畜禽毛发中抗病毒药物残留量的方法

技术领域

本发明属于药物残留检测领域，特别是一种定性和定量检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。

背景技术

金刚烷胺是由人工合成饱和三环癸烷的氨基衍生物，用于亚洲A型流感病毒的预防和早期治疗，也用于治疗帕金森病引起的神经障碍和预防动物常见的病毒类疾病如禽流感等。金刚乙胺是金刚烷胺类似物，也用于预防和治疗A型流感病毒感染，临床疗效优于金刚烷胺，且不良反应小于金刚烷胺。病毒灵，通用名：吗啉胍，吗啉胍对多种病毒(包括甲型H1N1流感、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等)有抑制作用。用于流感、流行性腮腺炎、水痘、疱疹、滤泡性结膜炎等的防治。2012年12月我国爆发“速生鸡”事件，曝光鸡在饲养过程中被违规喂食利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒药物。违禁抗病毒药物的滥用不仅造成鸡肉风味和品质的下降，更会导致细菌耐药性的发生和药物残留，并通过食物链影响人类健康和破坏生态平衡，造成严重不良后果。美国食品药物管理局(FDA)早于2005年就禁止将人类抗病毒药物用于畜禽类；我国于2005年12月发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，禁止金刚烷胺等抗病毒药作为兽用药，但由于其价格低廉、效果良好，仍有不法分子大量使用金刚烷胺等抗病毒药物用于动物疾病的预防和治疗。滥用抗病毒药物会导致动物中毒，使病毒产生不同程度的耐药性，并诱发病毒产生变异，严重影响了国家动物疫病防控工作。

药物残留监测通常检测活体动物的尿液或血液样本，或者检测宰杀后动物的组织样本，如肌肉、肝脏等。由于兽药残留检测的时滞性，同时兽药在生物组织中受到酶类等生物大分子的作用，通常易于代谢而具有较高的清除率，因此有时追溯一些非正常的或非法使用的兽药则变得困难。建立快速灵敏的检测方法和寻找可活体取样的检材一直是兽药残留分析研究的两个重要方向。在过去的十几年间，人们从法医学检测人体头发中兴奋剂等违禁药物得到启发，探讨并研究了动物毛发作为检材的可行性。由于动物毛发易采集、运输，保存，更重要的是可以在宰前做出安全性评价的特点，毛发中缺少血液循环，缺少降解药物的各种活性物质和快速的排泄途径，使得药物代谢缓慢而可在毛发中的保留时间远远长于其他组织。与一般的组织样品(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和肺脏等)相比，毛发不需要将动物屠宰就可获得，较之前者简单、方便。另外，由于毛发的结构和成分特点以及较低的代谢活性，决定了药物进入毛发后在其中保留时间久，可作为长期检测样本，这是尿液或血液无法比拟的，尤其对于半衰期较短的药物，如金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍等，在经过一定时间的休药期后，从食用组织或血、尿中已无法检出药物残留证明是否使用过此禁用药物，而毛发因药物在其中代谢缓慢，在较长一段时间内仍可作为检测样本，提供违禁药物使用证明依据。检测畜禽毛发中是否含有抗病毒类药物残留，从而达到从养殖源头控制禁用药物使用的目的。因此，研究建立畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍药物残留的检测方法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要的意义。

我国对金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留的检测方法研究相对较少，也未曾制定国家标准和行业标准，仅有一个地方标准“DB32/T1163-2007.鸡肝中金刚烷胺残留检测——液相色谱-串联质谱法”，文献方法有气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。这些方法多应用于血液、医药和动物组织中金刚烷胺类药物的测定，而畜禽毛发中抗病毒类药物残留量的检测方法未见报道。

本发明与已有文献和专利相比，具有更高的回收率和更低的检测限及定量限，表现为如下几点：

1、首次对畜禽毛发中抗病毒类药物进行检测。

2、空白猪毛和鸡毛添加浓度为2.0、10.0、100.0μg/kg时，金刚烷胺方法的平均回收率为89.5％～108％，日内相对标准偏差为1.58％～3.46％，日间相对标准偏差为3.85％～7.48％；金刚乙胺方法的平均回收率为86.6％～107％，日内相对标准偏差为2.11％～4.51％，日间相对标准偏差为3.27％～7.67％；吗啉胍方法的平均回收率为85.3％～102％，日内相对标准偏差为2.94％～3.74％，日间相对标准偏差为3.95％～7.80％。

3、采用内标法定量，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍的检出限(LOD)均达0.5μg/kg，定量限(LOQ)均达2.0μg/kg。

超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatography\UPLC)是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。

超高效液相色谱仪优点：

超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同，所改变的地方有以下几点：

(1)小颗粒、高性能微粒固定相的出现。高效液相色谱的色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是5um，而超高效液相色谱的色谱柱，会达到3.5um，甚至1.7um。这样的孔径更加利于物质分离。

(2)超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。

(3)高速采样速度的灵敏检测器。

(4)使用低扩散、低交叉污染自动进样器。配备了针内进样探头和压力辅助进样技术；

(5)仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。

与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。

如今，超高效液相色谱仪主要应用于

(1)药物分析如天然产物中复杂组分的分析

(2)生化分析如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品

(3)食品分析如食品中农药残留的检测

(4)环境分析如水中微囊藻毒素的检测

(5)其他如化妆品中违禁品的检测

超高效液相色谱方法的突出优点体现在节省分析时间和溶剂用量上,尤其对基质复杂的痕量组分测定采用该方法以提高分析通量是今后发展的必然趋势。

三重四极杆串联质谱工作原理：

化合物分子在真空条件下受电子流的“轰击”或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带正电荷的离子，这些离子按质荷比(m/z)的大小被收集并记录的图谱。

电喷雾电离(ESI)：

样品溶液在电场的作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂不断挥发而缩小，导致表面电荷密度不断增大，当电荷之间的排斥力足以克服液滴的表面张力时，液滴发生裂分，如此反复进行，最后得到带单电荷或多电荷的离子。

三重四极杆串联质谱优点：

(1)不需进行衍生化。

(2)在单个分析中实现确认定量。

(3)在复杂很脏的基体中的低检测限。

(4)提高实验室效率/产出率(使用固相萃取技术)。

(5)更可靠和可值得信赖的测试结果。

(6)质量范围：5-1200amu

(7)分辨率：≤0.4Da

(8)灵敏度高

(9)定量重现性好

发明内容

本发明的目的在于提供了一种简便、快速、灵敏、准确且经济的检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。

本发明包括下列步骤：

a.取适量畜禽毛发试样，清洗并剪碎；

b.称取制备好的试样；

c.加入D15-金刚烷胺标准工作液，0.2mol/LHCI溶液消解后用2.0％三氯乙酸水溶液+乙腈(1：2V/V)溶液提取，加入氯化钠分层；

d.提取液于60℃下氮气吹干，用2％甲酸水溶液定容，待净化处理；

e.待净化液过MCX柱；

f.设定超高效液相色谱-电喷雾串联质谱条件；

g.净化液供超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定；

h.数据处理与分析。

本发明以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱作为检测的基本原理，现代超高效液相色谱-电喷雾串联质谱系统配置有化学工作站、计算机和软件系统在内的数据采集与处理系统，可检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。

超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分为两个步骤：数据采集与数据处理。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。

标准溶液的配置：

标准储备液：称取适量金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍标准品，用甲醇分别配制成1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃下避光储存。

标准中间液：取上述标准储备液各1mL，用甲醇分别稀释成质量浓度为10.0mg/L的标准中间液，于-18℃下避光储存。

标准混合工作液：取上述标准中间液各1mL，用甲醇稀释成质量浓度为1.0mg/L的标准混合工作液，于-4℃下避光储存。

D15-金刚烷胺标准工作液：称取适量D15-金刚烷胺标准品，用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液，然后用甲醇稀释成质量浓度为10.0mg/L的标准中间溶液，再用甲醇-水(1:1)溶液稀释成质量浓度为200.0μg/L的标准工作液，于-4℃下避光储存。

此法根据选择离子定性，内标法定量。配制金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍混合标准溶液质量浓度为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、100.0μg/L的系列标准溶液，分别加入D15-金刚烷胺标准工作液10.0μg/L进行测定，以定量离子峰面积(y)对浓度(x，μg/L)做标准曲线。结果显示，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍在0.5～100.0μg/L范围内的线性关系良好(r²＞0.999)。取空白猪毛和鸡毛样品，添加不同质量浓度的金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍混合标准溶液，按照优化实验条件由高至低的质量浓度进行检测，直至信噪比等于3(S/N＝3)和信噪比等于10(S/N＝10)时，确定猪毛和鸡毛样品中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍的检出限(LOD)均为0.5μg/kg，定量限(LOQ)均为2.0μg/kg。

取空白猪毛和鸡毛样品，添加金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍混合标准溶液分别为2.0、10.0、100.0μg/kg，然后按照本方法进行样品前处理和测定，每个添加水平测定6次，日内精密度通过1d内测定3个加标水平下的6个平行样品得到，日间精密度为连续6d(每天测定1次)测定3个加标水平下的样品得到，结果显示，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍添加浓度为2.0、10.0、100.0μg/kg时，方法的平均回收率为85.3％～108％，日内相对标准偏差为2.81％～4.51％，日间相对标准偏差为4.65％～7.80％。精密度和相对标准偏差见表1和表2。

表1空白猪毛中添加金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍日内和日间精密度及相对标准偏差(n＝6)

表2空白鸡毛中添加金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍日内和日间精密度及相对标准偏差(n＝6)

试样中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量以质量分数X计，数值以微克每千克(μg/kg)表示，单点校正按式(1)、(2)计算：

$C_i=\frac{A_i\×{A^{\′}}_{\mathrm{is}}\×C_s\×C_{\mathrm{is}}}{A_{\mathrm{is}}\×A_s\×C^{\′}\mathrm{is}}..................\left(1\right)$

$X=\frac{C_i\×V}{m}..................\left(2\right)$

式中：

C_i—试样溶液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍浓度(μg/L)；

C_is—试样溶液中D15-金刚烷胺内标浓度(μg/L)；

C_s—对照溶液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍浓度(μg/L)；

C′is—对照溶液中D15-金刚烷胺内标浓度(μg/L)；

A_i—试样溶液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍峰面积；

A_is—试样溶液中D15-金刚烷胺内标峰面积；

A_s—对照溶液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍峰面积；

A′_is—对照溶液中D15-金刚烷胺内标峰面积；

X—试样中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍的残留量(μg/kg)；

V—样液最终定容体积(mL)；

m—试样质量(g)；

标准曲线校准按式(3)计算：

$X=\frac{C_i\×V}{m}..................\left(3\right)$

C_i—标准曲线上查得的试样中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍浓度(μg/L)；；

V—样液最终定容体积(mL)；

m—试样质量，单位为克(g)。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的20％。

对于样品痕量金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍检测，取样、样品前处理和质谱条件的优化是检测的基础与关键。

在同样的研究中，脖颈区域是较为干净的区域，在此取样的样本中，一些甾体的累积量较高，并且高度稳定，具有更长的检测时间窗口。

毛发暴露在外部环境，极易被污染，为排除污染物对药物的干扰，洗涤步骤至关重要。洗涤毛发通常用甲醇、二氯甲烷和去污剂(如I％SDS，5％吐温)。比较1％SDS、甲醇、5％吐温80和10％吐温80三种洗涤液的洗涤效果后，发现用1％SDS+5％吐温80+纯水(1：1：1)洗涤样品的空白基质噪音最低，干扰最小，而回收率差别不显著，因而选择1％SDS+5％吐温80+纯水(1：1：1)作为洗涤溶剂。实验发现，将毛发置于液体环境时间长了，毛发中的药物含量下降显著，因此，要注意洗涤时间不宜过久。

毛发的结构致密，需要消解后才能将药物释放出来。通常有三种消解法：碱消解、酸消解和酶消解。实验分别比较了0.1mol/LHCI、0.2mol/LHCI、0.5mol/LHCI、1.0mol/LHCI、0.2mol/LNaOH、0.5mol/LNaOH和1.0mol/LNaOH消解效果。结果表明：使用0.2mol/LHCI消解后，猪毛和鸡毛中金刚烷胺添加回收率最高。

分别使用内标法和外标法对猪毛和鸡毛中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍进行添加回收率比较。结果表明，使用外标法时金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍平均回收率均低于60.0％；而用内标法进行定量时，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍平均回收率均大于为85.0％；内标法的定量回收率明显高于外标法。这主要是因为内标法能校正由于样品前处理过程中目标化合物造成的损失以及质谱离子化过程中干扰物对待测离子的抑制或增强作用。所以，同位素内标法比外标法具有更好的准确性。

质谱条件的优化：

分别配制1.0mg/L的金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍和D15-金刚烷胺标准溶液，不通过色谱柱直接进入离子源，在ESI⁺模式下分别进行质谱条件的优化。先进行一级质谱图全扫描，确定各目标化合物的母离子，并优化得到源内碎裂电压，然后在选定的源内碎裂电压条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，选取丰度相对最强的1对碎片离子作为定量离子，次强的1对或2对碎片离子作为定性离子，并分别对子离子的碰撞能进行优化。最后在MRM模式下分别对雾化气压力、干燥气温度和流量等参数进行优化。优化后的质谱条件见表3。

表3MRM监测模式下金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍及D15-金刚烷胺的质谱优化条件

*定量离子

为进一步说明本发明的特点和效果，以下结合附图对发明做进一步的描述。

附图说明

图1是吗啉胍、金刚烷胺、D15-金刚烷胺和金刚乙胺标准品(10.0μg/L)TIC图。

图2是本发明具体实施例1中空白猪毛中添加吗啉胍、金刚烷胺和金刚乙胺(10.0μg/kg)TIC图。

图3是本发明具体实施例2中空白鸡毛中添加吗啉胍、金刚烷胺和金刚乙胺(10.0μg/kg)TIC图。

其中，横坐标和纵坐标分别为吗啉胍、金刚烷胺、D15-金刚烷胺和金刚乙胺各化合物保留时间和峰高，峰1为吗啉胍，峰2为金刚烷胺和D15-金刚烷胺，峰3为金刚乙胺。

实施例

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：

用自来水洗出猪毛可见杂质，毛发于1％SDS+5％吐温80+纯水(1：1：1)超声15分钟，蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50℃干燥，放干燥器中备用。

用剪刀剪碎成l-2mm，称取毛发0.5g于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作液50.0μL，0.2mol/LHCI溶液5mL，混匀后65℃消解2小时，取出，加入8mL2.0％三氯乙酸水溶液+乙腈(1：2)，涡旋30s，超声提取40min后加入2g氯化钠，涡漩混匀2min，5000r/min离心10min，取上清液于另一管中，60℃下用氮气吹干后，加入3mL2％甲酸水溶液溶解，溶解液加载至已依次用3mL甲醇、3mL水活化过的MCX柱中，再依次用3mL2％的甲酸水溶液、3mL甲醇淋洗，减压抽干，用3mL5％的氨水甲醇溶液(体积比)洗脱；洗脱液在60℃下用氮气吹干后，用1mLV(0.1％甲酸水溶液)：V(甲醇)＝90：10的溶液溶解残渣，涡旋30s，经0.22mm滤膜过滤后，上机测定。

设定液相色谱条件为：

色谱柱：EclipsePlusC18(RRHD1.8μm，2.1×100mm)。流动相A为0.1％甲酸水溶液；B为甲醇。梯度洗脱程序：0～3.0min，2％～5％B；3.0～5.0min，5％～90％B；5.0～5.1min，90％B～2％B；5.1～7.0min，维持2％B。流速0.25mL/min；柱温30℃；进样体积：5.0μL。

质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：4000V；离子源温度(TEM)：325℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：15L/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12L/min。

实施例2：

用自来水洗出鸡毛可见杂质，毛发于1％SDS+5％吐温80+纯水(1：1：1)超声15分钟，蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50℃干燥，放干燥器中备用。

用剪刀剪碎成l-2mm，称取毛发0.5g于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作液50.0μL，0.2mol/LHCI溶液5mL，混匀后65℃消解2小时，取出，加入8mL2.0％三氯乙酸水溶液+乙腈(1：2)，涡旋30s，超声提取40min后加入2g氯化钠，涡漩混匀2min，5000r/min离心10min，取上清液于另一管中，60℃下用氮气吹干后，加入3mL2％甲酸水溶液溶解，溶解液加载至已依次用3mL甲醇、3mL水活化过的MCX柱中，再依次用3mL2％的甲酸水溶液、3mL甲醇淋洗，减压抽干，用3mL5％的氨水甲醇溶液(体积比)洗脱；洗脱液在60℃下用氮气吹干后，用1mLV(0.1％甲酸水溶液)：V(甲醇)＝90：10的溶液溶解残渣，涡旋30s，经0.22mm滤膜过滤后，上机测定。

设定液相色谱条件为：

色谱柱：EclipsePlusC18(RRHD1.8μm，2.1×100mm)。流动相A为0.1％甲酸水溶液；B为甲醇。梯度洗脱程序：0～3.0min，2％～5％B；3.0～5.0min，5％～90％B；5.0～5.1min，90％B～2％B；5.1～7.0min，维持2％B。流速0.25mL/min；柱温30℃；进样体积：5.0μL。

质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：4000V；离子源温度(TEM)：325℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：15L/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12L/min。

当然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本说明，而并非作为本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

Claims (1)

1.一种检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法，其特征在于包括以下步骤：

a.取适量畜禽毛发试样，清洗并剪碎；

b.称取制备好的试样；

c.加入D15-金刚烷胺标准工作液，0.2mol/LHCI溶液消解后用2.0%三氯乙酸水溶液+乙腈，1:2V/V，溶液提取，加入氯化钠分层；

d.提取液于60摄氏度下氮气吹干，用2%甲酸水溶液定容，待净化处理；

e.待净化液过MCX柱；

f.设定超高效液相色谱-电喷雾串联质谱条件；

g.净化液供超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定；

h.数据处理与分析；

其中，畜禽毛发为猪毛，用自来水洗出猪毛可见杂质，毛发于1%SDS+5%吐温80+纯水，1：1：1，超声15分钟，蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50℃干燥，放干燥器中备用；

用剪刀剪碎猪毛成l-2mm，称取毛发0.5g于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作液50.0μL，0.2mol／LHCI溶液5mL，混匀后65℃消解2小时，取出，加入8mL2.0%三氯乙酸水溶液+乙腈，1：2，涡旋30s，超声提取30min后加入2g氯化钠，涡漩混匀2min，5000r/min离心10min，取上清液于另一管中，60℃下用氮气吹干后，加入3mL2%甲酸水溶液溶解，溶解液加载至已依次用3mL甲醇、3mL水活化过的MCX柱中，再依次用3mL2%的甲酸水溶液、3mL甲醇淋洗，减压抽干，用3mL5%的氨水甲醇溶液，其中百分比单位为体积比，洗脱；洗脱液在60℃下用氮气吹干后，用0.1%甲酸水溶液：甲醇=90：10的溶液1mL溶解残渣，涡旋30s，经0.22mm滤膜过滤后，上机测定；

设定液相色谱条件为：

色谱柱：EclipsePlusC18，RRHD1.8μm，2.1×100mm；流动相A为0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；梯度洗脱程序：0~3.0min，2%~5%B；3.0~5.0min，5%~90%B；5.0~5.1min，90%B~2%B；5.1~7.0min，维持2%B；流速0.25mL/min；柱温30℃；进样体积：5.0μL；

质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子模式，ESI+；检测方式：多反应监测MRM；毛细管电压：4000V；离子源温度TEM：325℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：15L/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12L/min。