CN101963602A - 检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换lc-ms/ms分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统；2)按设定的LC-MS/MS条件分析样品；3)结果分析。本发明方法对尿中各安眠镇静药物或代谢物的检测限为0.01～10ng·mL^-1；线性范围2～3个数量级，相关系数γ均在0.991以上，线性关系良好。本发明方法的待测尿样只需简单处理即可进样，简化了实验步骤，节约了分析时间，降低了成本。本发明的柱切换LC-MS/MS分析方法快速、灵敏、可靠，可以分析尿中的共32种常见安眠镇静药物及其代谢物，可广泛应用于实际案例分析中。

Description

检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法

技术领域

本发明涉及一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法，具体涉及一种检测尿样中32种安眠镇静药及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法。

背景技术

安眠镇静药物能对中枢神经系统产生抑制，引起镇静、催眠和抗惊厥，主要用以治疗焦虑、失眠和惊厥，同时由于其药理作用广泛，是临床治疗中广泛应用且不可缺少的药物，自问世以来其用量不断增加。但是，安眠镇静药物可产生依赖，从而导致滥用，已成为全球性药物依赖问题。由于安眠镇静药物品种多、易获得、应用广，其危害性超过阿片类药物。目前常见的安眠镇静药物口服量安全范围大，与酒类饮料共用可增强对中枢神经系统的抑制作用，其中，有些安眠镇静药物还可能造成暂时性记忆缺失，因此，常被用于麻醉后抢劫、强奸或致人昏睡后杀人，也有人因服用该类药物导致交通肇事，或服用大量药物自杀。安眠镇静药物具有用量少、代谢快、半衰期短等特点，在体内组织和体液中浓度很低，绝大部分转变为代谢物并很快随尿液排出体外，而司法鉴定中的受检样品通常是受检人服药数小时后乃至数十小时后的尿液或血液，故安眠镇静药物及其代谢物含量均较低，需要具备高灵敏度的检测方法。

样品前处理是生物样品分析方法中非常重要的步骤，也是一个比较费时、工作量很大的过程。对于非挥发性化合物，液液提取和固相萃取是较常用的样品前处理方法，目前研究的方向是在如何减少样品体积、缩短分析时间、降低成本、减少有机溶剂的使用体积、提高自动化程度等方面。样品的在线前处理不仅增加了处理样品的安全性，而且减少了人为因素影响，提高了准确度和精密度。

鉴于气相色谱仪对提取后的样品要求苛刻，例如：必须使用有机溶剂溶解样品、进样体积小、需要衍生化等，所以，液相色谱仪和液相色谱质谱联用仪更适于实现样品在线前处理。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)将高效液相色谱法HPLC的高分离性能和质谱MS的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合，使得样品前处理简便，不需衍生化步骤，分析范围广，还可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物，也可以分析复杂基质体系中的待测物，已成为体内毒(药)物分析中强有力的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法，具体涉及一种检测尿样中32种安眠镇静药及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法。本发明通过仪器改装，将柱切换技术与LC-MS/MS联用，待测尿样只需简单处理即可进样，简化了实验步骤，节约了分析时间，降低了成本，同时，本发明的柱切换LC-MS/MS分析方法快速、灵敏、可靠，已经应用于实际案例的分析。

本发明所述的柱切换LC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：

1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统

为了实现柱切换，本发明的分析方法至少需配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统，所述系统具体包括十通切换阀1、四元梯度泵2、高压二元泵3、进样器4、预处理柱5、分析柱6和检测器7。其中，十通切换阀1的接口⑤与四元梯度泵2连接；十通切换阀1的接口⑩与高压二元泵3通过进样器4连接；十通切换阀1的接口④、⑨分别与预处理柱5的两端相连；分析柱6的一端与十通切换阀1的接口⑧相连，另一端与检测器7连接。

所述四元梯度泵2为Waters Alliance 2695泵，高压二元泵3为Waters1525泵，检测器7为Quattro Premier XE串联四极杆质谱。

所述的双泵输液系统和高压流路选择阀系统的具体流路过程如下：

a.初始状态I(参见图1)：四元梯度泵2输送分析流动相，依次通过十通切换阀1的接口⑤、⑥、⑦、⑧，进入分析柱6；高压二元泵3输送预处理流动相经过进样器4，通过十通切换阀1的接口⑩、⑨，流入预处理柱5，即当样品通过进样器4进样时，预处理流动相将样品带入预处理柱5，样品在预处理柱5上净化和富集，废液通过十通切换阀1接口④、③排出；经过预处理时间后，十通切换阀1切换为进样状态II。

b.进样状态II(参见图2)：分析流动相通过十通切换阀1的接口⑤、④进入预处理柱5并把样品通过十通切换阀1的接口⑨、⑧，冲入分析柱6，并最终进入到检测器7中进行检测。

其中，在进样状态II情况下，高压二元泵3继续持续不断的输送预处理流动相，此时十通切换阀1通过接口⑩、①、②、③直接将预处理流动相排出；经过切换时间后，十通切换阀1切换成初始状态I，平衡准备下一次进样。

2.液相色谱条件

a.预处理柱型号：

HLB 25μm 2.1×20mm(Waters公司)

预处理柱柱温：室温

预处理流动相：水

流速：1.0mL·min^-1

预处理时间：36s

切换时间：0.60-3.00min

b.分析柱型号：

MS C18 3.5μm 2.1mm×150mm(Waters公司)

分析柱柱温：35℃

分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0.05％甲酸的水溶液(0.126克甲酸胺和500μL甲酸，加水至1000mL)，B为2mM甲酸胺和0.05％甲酸的乙腈(0.126克甲酸胺和500μL甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。

流速：0.2mL·min^-1

梯度：流动相梯度洗脱条件见表1。

表1流动相梯度洗脱条件

c.进样量：100μL

3.质谱条件

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：地西泮-D5

4.MRM参数

每个化合物设两个母离子-子离子对，分为3个MRM通道采集。

5.方法

a.样品处理

取尿样1.0mL加入50ng内标后混匀，高速离心(16000rpm，5min)，取上清液至自动进样小瓶中进样。

b.工作曲线

分别取不同量的对照品混合液(含表2中的安眠镇静药物及其代谢物代谢物)，吹干后各加入空白尿1.0mL，配成系列浓度的样品，加入50ng内标后混匀，高速离心(16000rpm，5min)，取上清液至自动进样小瓶中进样。

c.精密度

分别取不同量的对照品混合液(含表2中的安眠镇静药物及其代谢物代谢物)，吹干后各加入空白尿1.0mL，配成高、中、低三个浓度的样品，加入50ng内标后混匀，高速离心(16000rpm，5min)，取上清液至自动进样小瓶中进样。各浓度日内重复测定6次得日内精密度，连续测定4天得日间精密度。

6.结果分析

根据色谱图和回归方程，计算各化合物的浓度。经分析，本发明方法对尿中各安眠镇静药物或代谢物的检测限为0.01～10ng·mL^-1；线性范围2～3个数量级，相关系数γ均在0.991以上，线性关系良好。

其中，要实现本发明所述的柱切换LC-MS/MS分析方法，首先需要确定以下条件：

1)切换时间的确定

采用柱切换方法，切换时间的确定至关重要，本发明通过实验确定预处理流动相冲洗时间。初始状态I时，预处理柱和分析柱是并联状态，进样后各化合物富集、保留在预处理柱上，36s后切换到进样状态II，即可除去尿液中的水溶性杂质和盐类，同时使峰面积达到最大化，此时，时间增加或者减少时，峰面积均减小。在进样状态II时，预处理柱和分析柱串联在一起，分析流动相将保留在预处理柱上的化合物洗脱进入分析柱，3.00min后回到初始状态I，化合物继续在分析柱上完成分离，但当时间增加时，峰面积不再增加，仅保留时间延长，因此确定切换时间为36s-3.00min。

2)液相色谱分析条件的确定

以乙腈和水作为分析流动相主体，同时根据样品离子化的需要，在乙腈和水中需要加入甲酸和甲酸铵，其中甲酸主要起到改善峰形的作用，甲酸铵可以提高仪器信号的响应值。为了克服梯度洗脱影响色谱峰面积的稳定性，本发明在分析流动相A和分析流动相B中加入相同浓度的甲酸和甲酸铵，保证了梯度变化过程中甲酸和甲酸铵的浓度一致，改善了色谱峰面积的稳定性。对于分析流动相B，若直接在乙腈中加入甲酸和甲酸铵，发现有析出的现象，因此，本发明方法通过比较确定了分析流动相B的配制方法为：0.126克甲酸胺和500μL甲酸溶于40mL水中，再加入乙腈960mL，得到含2mM甲酸胺和0.05％甲酸的乙腈。

由于分析的化合物较多，相同时间出峰的药物过多会使每个色谱峰的数据采集点数减少，影响灵敏度和稳定性。为了液相色谱部分也能起到一定的分离作用，因此本发明方法采用了梯度洗脱的方式，并选择合适的梯度，使多种化合物在时间上分布比较均匀，以减少相互干扰。

相对于现有技术，本发明的柱切换LC-MS/MS分析方法，具有如下优点：

1)前处理简单，自动化操作。样品只需简单处理即可进样分析，本发明所述方法也适用于对不稳定药物的检测。

2)样品在预处理柱上被净化和富集，提高了分析灵敏度。特别是当无法用液-液萃取检测水溶性较大的组分时，可采用本发明方法检测，并可取得很好的效果。

3)样品处理的全过程由仪器程序控制，即使进样体积较大，也可获得很高的精密度与重现性，因此本方法同时适用于内标法和外标法定量分析。

附图说明

图1为本发明分析方法的初始状态I的示意图，其中，1为十通切换阀、2为四元梯度泵、3为高压二元泵、4为进样器、5为预处理柱、6为分析柱、7为检测器，十通切换阀1与高压二元泵3通过进样器4相连的接口为⑩，按逆时针其余的接口依次为①②③④⑤⑥⑦⑧⑨，其中，每相邻的两个接口相通，具体为接口①与接口②，接口③与接口④，接口⑤与接口⑥，接口⑦与接口⑧，接口⑨与接口⑩相通，共形成五组通路。

图2为本发明分析方法的进样状态II的示意图，各数字标号同图1，此状态下的五组通路分别为：接口①与接口⑩，接口②与接口③，接口④与接口⑤，接口⑥与接口⑦，接口⑧与接口⑨相通。

图3为本发明的柱切换LC-MS/MS方法的空白色谱图及32种安眠镇静药物及内标的MRM总离子流色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

仪器和试剂

Quattro Premier XE串联四极杆液-质联用仪，Waters Alliance 2695四元梯度泵及Waters 1525高压二元泵、配MassLynxV4.1软件购于美国Waters公司，十通切换阀(Rheodyne，USA)。

对照品：常见安眠镇静药物对照品见表2，内标地西泮-D5来源于中国药品生物制品检定所、Cerilliant公司。

乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均为色谱纯，购于Merck公司，其他试剂均为国产分析纯，水为自制超纯水。

储备液：

a.固体对照品：哌唑嗪、唑匹坦、延胡索乙素、氯氮平、氟西泮、咪达唑仑、苯海拉明、多塞平、苯海索、阿米替林、氯丙嗪、卡马西平、艾司唑仑、奥沙西泮、硝西泮、阿普唑仑、三唑仑、氯硝西泮、氟硝西泮、去甲基安定、羟基安定、地西泮，配成1.0mg·mL^-1的甲醇溶液，再按照浓度配成混合稀释液。

b.液体对照品：7-氨基硝基安定、7-氨基氯硝安定、α-羟基咪达唑仑、α-羟基三唑仑、α-羟基阿普唑仑、劳拉西泮、安眠酮、异安定酮、甲基劳拉西泮、普拉西泮，配成浓度为0.1mg·mL^-1的甲醇溶液，再按照浓度配成混合稀释液。

c.内标地西泮-D5：配成浓度为0.1mg·mL^-1的甲醇溶液。

实施例1

配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统

将十通切换阀1的接口⑤与四元梯度泵2(Waters Alliance 2695)连接；十通切换阀1的接口⑩与高压二元泵3(Waters 1525)通过进样器4连接；十通切换阀1的接口④、⑨与预处理柱5(

HLB)的两端分别相连，分析柱6(

MS C18)的一端与十通切换阀1的接口⑧相连，另一端与检测器7(Quattro Premier XE串联四极杆质谱)连接。

实施例2

安眠镇静药物及其代谢物：7-氨基硝基安定、哌唑嗪、7-氨基氯硝安定、唑匹坦、延胡索乙素、氯氮平、氟西泮、咪达唑仑、苯海拉明、多塞平、α-羟基咪达唑仑、苯海索、阿米替林、氯丙嗪、α-羟基三唑仑、α-羟基阿普唑仑、卡马西平、艾司唑仑、奥沙西泮、硝西泮、阿普唑仑、劳拉西泮、三唑仑、氯硝西泮、安眠酮、氟硝西泮、去甲基安定、羟基安定、异安定酮、甲基劳拉西泮、地西泮、普拉西泮的检测。

1.液相色谱条件

a.预处理柱型号：

HLB 25μm 2.1×20mm(Waters公司)

预处理柱柱温：室温

预处理流动相：水

流速：1.0mL·min^-1

预处理时间：36s

切换时间：36s-3.00min

b.分析柱型号：

MS C18 3.5μm 2.1mm×150mm(Waters公司)

分析柱柱温：35℃

分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0.05％(v/v)甲酸的水溶液(0.126克甲酸胺和500μL甲酸，加水至1000mL)，B为2mM甲酸胺和0.05％(v/v)甲酸的乙腈(0.126克甲酸胺和500μL甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。

流速：0.2mL·min^-1

梯度：流动相梯度洗脱条件参见前文表1。

c.进样量：100μL

2.质谱条件

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：地西泮-D5

3.MRM参数

各化合物及内标设两对母离子-子离子对，各MRM参数详见表2。

表2安眠镇静药物及其代谢物及内标的质谱学参数

4.方法

a.样品处理方法

取尿样1.0mL加入50ng内标混匀，高速离心(16000rpm，5min)，取上清液至自动进样小瓶中进样。

b.工作曲线

分别取不同量的对照品混合液(含表2中的安眠镇静药物及其代谢物代谢物)，吹干后各加入空白尿1.0mL，配成系列浓度的样品，加入50ng内标后混匀，高速离心(16000rpm，5min)，取上清液至自动进样小瓶中进样。

c.精密度

分别取不同量的对照品混合液(含表2中的安眠镇静药物及其代谢物代谢物)，吹干后各加入空白尿1.0mL，配成高、中、低三个浓度的样品，加入50ng内标后混匀，高速离心(16000rpm，5min)，取上清液至自动进样小瓶中进样。各浓度日内重复测定6次得日内精密度，连续测定4天得日间精密度。

5.结果分析

a.色谱图

空白色谱图和三组化合物的MRM总离子流色谱图，见图3。

b.最低检测限

以峰强度较低的子离子峰强度信噪比(S/N)＝5时确定为最低检测限，各化合物的检测限参见表3。

表3各化合物的检测限和线性关系

c.线性关系

以各化合物的峰面积与内标峰面积之比(Y)对尿样中化合物的浓度(X)作图，得到各化合物的回归方程和相关系数，权重均为1/x，结果见表3，由表3可以看出各化合物线性关系良好。

d.精密度

添加常见安眠镇静药物及代谢物在高、中、低三个浓度时的日内、日间精密度，结果见表4。

表4常见安眠镇静药物及其代谢物的日内及日间精密度

本发明方法成功分析了如上32种常见的安眠镇静药物及其代谢物。经分析，该方法对尿中的32种常见的安眠镇静药物或代谢物的检测限为0.01～10ng·mL^-1；线性范围2～3个数量级，相关系数γ均在0.991以上，线性关系良好。并且，本发明方法杂质影响少，符合筛选分析的要求，实际应用表明本发明所述方法适用于较本发明的研究对象更为复杂的药选范围，可广泛应用于实际涉毒案件的鉴定，为执法部门提供可靠的认定证据。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统：所述系统包括十通切换阀(1)、四元梯度泵(2)、高压二元泵(3)、进样器(4)、预处理柱(5)、分析柱(6)和检测器(7)；其中，所述十通切换阀(1)的接口⑤与所述四元梯度泵(2)连接；所述十通切换阀(1)的接口⑩与所述高压二元泵(3)通过所述进样器(4)连接；所述十通切换阀(1)的接口④、⑨与所述预处理柱(5)的两端分别相连；所述分析柱(6)的一端与所述十通切换阀(1)的接口⑧相连，另一端与所述检测器(7)连接；

2)样品处理：取尿样1.0mL加入50ng内标地西泮-D5混匀，高速离心16000rpm、5min，取上清液至自动进样小瓶中进样；

3)按设定的LC-MS/MS条件分析样品；

4)结果分析：根据色谱图和回归方程，计算各化合物的浓度。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述四元梯度泵(2)为Waters Alliance 2695泵，所述高压二元泵(3)为Waters 1525泵，所述检测器(7)为Quattro Premier XE串联四极杆质谱。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色谱条件如下：

i)预处理柱柱温：室温

预处理流动相：水

流速：1.0mL·min^-1

预处理时间：36s

切换时间：36s-3min

ii)分析柱柱温：35℃

分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0.05％甲酸的水溶液，B为2mM甲酸胺和0.05％甲酸的乙腈

流速：0.2mL·min^-1

iii)进样量：100μL。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述MS条件如下：

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：地西泮-D5。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色谱采用流动相梯度洗脱。

6.根据权利要求1-5任一项所述的分析方法，其特征在于，所述安眠镇静药物及其代谢物选白：7-氨基硝基安定、哌唑嗪、7-氨基氯硝安定、唑匹坦、延胡索乙素、氯氮平、氟西泮、咪达唑仑、苯海拉明、多塞平、α-羟基咪达唑仑、苯海索、阿米替林、氯丙嗪、α-羟基三唑仑、α-羟基阿普唑仑、卡马西平、艾司唑仑、奥沙西泮、硝西泮、阿普唑仑、劳拉西泮、三唑仑、氯硝西泮、安眠酮、氟硝西泮、去甲基安定、羟基安定、异安定酮、甲基劳拉西泮、地西泮、普拉西泮。

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