CN101813675A

CN101813675A - 检测全血、尿中吗啡类生物碱的lc-ms/ms分析方法

Info

Publication number: CN101813675A
Application number: CN201010146298A
Authority: CN
Inventors: 张玉荣; 梁晨; 叶海英; 汪蓉
Original assignee: CRIMINAL INVESTIGATION GENERAL TEAM SHANGHAI PUBLIC SECURITY BUREAU
Current assignee: CRIMINAL INVESTIGATION GENERAL TEAM SHANGHAI PUBLIC SECURITY BUREAU
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2030-04-13
Also published as: CN101813675B

Abstract

本发明公开了一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法，所述LC-MS及MS的条件分别如下：1)LC-MS色谱条件：流动相由A、B组成，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的水，B为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的乙腈，所述A、B的体积比为90∶10；柱温：45℃；流速：0.2mL/min；进样量：10μL；2)MS条件：检测方式：多反应监测MRM；扫描方式：正离子扫描；电喷雾电压：3200V；雾化气流速：N₂ 600L/hr；锥孔反吹气流速：N₂ 50L/hr；离子源温度：105℃；碰撞气：氩气；内标：吗啡-d3。所述吗啡类生物碱为3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡和可待因。本发明采用固相萃取方法对样品进行净化，使定性和定量更准确；采用不同的淋洗和洗脱条件，使所得回收率最高，样品上样后经一步清洗后即用甲醇洗脱，简化了实验步骤，节约了分析时间。

Description

检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法

技术领域

本发明涉及一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法，具体涉及一种检测全血、尿中3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡和可待因的LC-MS/MS分析方法。

背景技术

随着国际毒潮持续泛滥，境外毒品对我国的侵袭日益加剧，吸食或注射海洛因的人员也越来越多，因此对人体内吗啡类生物碱的分析检测的要求也越来越高。按照公安部《对吸食、注射毒品人员成瘾标准界定》的规定，凡查获吸食、注射毒品者，应进行毒瘾司法鉴定和吸毒违法行为的认定。其中，这两个认定的首位要素就是需要先对涉毒人员的血样或尿液进行检测。为保证检测的客观性、准确性和及时性，必须了解海洛因在人体内的代谢过程。一般来说，海洛因在人体内代谢很快，几乎检测不到原体，很快被血脂酶去乙酰化成O⁶-单乙酰吗啡，再进一步代谢成去甲吗啡和吗啡。而吗啡的主要代谢途径则是其3位羟基与葡萄糖醛酸结合，从而使87％的吗啡在72小时内被代谢掉，而其中的75％则被代谢为3-β-D葡萄糖醛酸吗啡形式。由于该3-β-D葡萄糖醛酸吗啡水溶性强、极性大，提取、检测都比较困难，因此鲜有文献报道。

现有的关于GC-MS分析生物检材中吗啡类生物碱的文献报道，其检材都必须要经溶剂提取、衍生化等步骤，无法检测生物检材中吗啡与葡萄糖醛酸的结合物-3-β-D葡萄糖醛酸吗啡，因此不能满足案件检验的需要。

近年来，液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术发展迅速，它集液相色谱高效的在线分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性于一体，正成为法医毒物分析强有力的工具。与GC/MS相比，应用范围更广，不受被分析物挥发性、极性、热稳定性的限制，也无需衍生化过程。多反应监测(MRM)模式通过两次离子选择作用，锁定目标物的母离子-子离子对，大大提高了分析的专一性和灵敏度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法，具体是提供一种检测全血、尿中3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡和可待因的LC-MS/MS分析方法。

本发明的LC-MS/MS分析方法，具体如下：

1.色谱及质谱条件(LC-MS/MS)

1)液相色谱(LC-MS)条件

色谱柱：Xterra

MS C₁₈ 3.5μm 2.1×150mm(Waters公司)

流动相由A、B组成，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的水，B为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的乙腈，A、B的体积比为90∶10。

柱温：45℃

流速：0.2mL/min

进样量：10μL

2)质谱(MS)条件

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂ 600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂ 50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

3)MRM参数

每个化合物选取两个母离子-子离子对，结合保留时间定性，峰度强的子离子定量。

2.样品处理

1)血样

全血用纯净水1∶1(v/v)稀释后离心上样(16000rpm，5min)。依次用1mL甲醇，1mL水活化oasis HLB柱(1cc/30mg)，精取全血稀释液加入内标100ng，混匀后上柱，用1mL含5％(v/v)甲醇的水淋洗柱子，然后用1mL甲醇洗脱，整个过程流速控制在约2mL/min。洗脱液在60℃水浴中空气流下吹干，残渣用100μL流动相溶解，转移至自动进样小瓶中进样，。

2)尿样

依次用1mL甲醇，1mL水活化oasis HLB柱(1cc/30mg)，精密吸取1.0尿样，加入内标100ng，混匀后上柱，用1mL含5％(v/v)甲醇的水淋洗柱子，然后用1mL甲醇洗脱，整个过程流速控制在2mL/min左右。洗脱液在60℃水浴中空气流下吹干，残渣用100μL流动相溶解，转移至自动进样小瓶中进样。

其中，固定相为C₁₈。

3.结果分析

根据色谱图和线性方程，计算各化合物的浓度。

相对于现有技术，本发明的LC-MS/MS分析方法，具有如下优点：

1)可以快速的检测出生物检材中吗啡与葡萄糖醛酸的结合物-3-β-D葡萄糖醛酸吗啡。

2)采用不同的淋洗和洗脱条件，即用1mL含5％(v/v)甲醇的水淋洗，1mL甲醇洗脱，使所得回收率最高。因此，样品上样后经一步清洗后即用甲醇洗脱，简化了实验步骤，节约了分析时间。吸食海洛因者的血样通常比较粘稠，为了便于过柱，将全血用纯净水稀释、离心后上样。

3)采用固相萃取方法进行净化，使定性和定量更准确。本发明曾分别采用甲醇、乙腈直接稀释沉淀蛋白进样，但由于溶剂效应，几个成分的色谱峰都集中在2min，无法有效分离；另外采用这种方法，基质效应影响明显，每个实际样品中各成分出峰时间都有所不同。

附图说明

图1为实际案件血样中3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因及内标的MRM色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、内标吗啡-d₃购自于Cerilliant公司，吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因购自于中国药品生物制品检定所。

乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均为色谱纯，购自Merck公司，其它试剂均为国产分析纯。

Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串联四极杆液-质联用仪(美国Waters公司)，配MassLynxV4.1软件。

oasis HLB柱购自美国Waters公司。

实施例1

血样中3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因的检测

1.液相色谱条件

色谱柱：Xterra

MS C₁₈ 3.5μm 2.1×150mm(Waters公司)

流动相为A和B，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的水，B为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的乙腈，A、B的体积比为90∶10。

柱温：45℃

流速：0.2mL/min

进样量：10μL

2.质谱条件

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂ 600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂ 50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：吗啡-d3

3.MRM参数

每个化合物选取两个母离子-子离子对，结合保留时间定性，峰度强的子离子定量，各参数详见表1。

表1 各化合物及内标的质谱MRM参数

4.样品处理

全血用纯净水1∶1(v/v)稀释后离心上样(16000rpm，5min)。依次用1mL甲醇，1mL水活化oasis HLB柱(1cc/30mg)，精取全血稀释液加入内标100ng，混匀后上柱，用1mL含5％(v/v)甲醇的水淋洗柱子，然后用1mL甲醇洗脱，整个过程流速控制在约2mL/min。洗脱液在60℃水浴中空气流下吹干，残渣用100μL初始流动相溶解，转移至自动进样小瓶中进样。

5.结果分析

1)最低检测限

以峰度弱的子离子峰强度信噪比S/N＞5确定为最低检测限(LOD)，各化合物的LOD见表2。

表2 各化合物的检测限和线性关系

2)线性关系和精密度

分别取不同量的对照品混合液(含3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因)于具塞尖底试管中，吹干后加入空白全血稀释液1.0mL，配成系列浓度的样品，按样品处理方法操作。以峰面积与内标峰面积之比(Y)对样品中化合物的浓度(X)作图，得回归方程和相关系数，结果见表2，可以看出，各化合物的线性关系良好。

高、中、低浓度日内重复测定6次得日内精密度，连续测定3天得日间精密度，结果见表3。

表3 各化合物的日内及日间精密度

将上述方法应用于一起实际案件的血样分析，血样中检测出3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因成分的含量分别为2.634、0.335、0.055、0.132μg/mL，结果参见图1。

实施例2

尿样中3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因的检测

1.液相色谱条件、质谱条件、MRM参数同实施例1。

2.样品处理

依次用1mL甲醇，1mL水活化oasis HLB柱(1cc/30mg)，精密吸取1.0尿样，加入内标100ng，混匀后上柱，用1mL含5％(v/v)甲醇的水淋洗柱子，然后用1mL甲醇洗脱，整个过程流速控制在2mL/min左右。洗脱液在60℃水浴中空气流下吹干，残渣用100μL初始流动相溶解，转移至自动进样小瓶中进样。

3.结果分析

1)色谱行为

3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因及内标在选定的液相色谱分析条件下，保留时间分别为1.98min、2.25min、3.58min、4.70min和2.26min，在8min内完成分析，色谱行为良好。

2)最低检测限

以峰强度较低的子离子峰强度信噪比S/N＞5确定为最低检测限(LOD)，各化合物的LOD见表4。

表4 各化合物的检测限和线性关系

3)线性关系和精密度

分别取不同量的对照品混合液(含3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因)于具塞尖底试管中，吹干后加入空白尿样1.0mL，配成系列浓度的样品，按样品处理方法操作。以峰面积与内标峰面积之比(Y)对样品中化合物的浓度(X)作图，得到回归方程和相关系数，见表4，各化合物线性关系良好。

高、中、低浓度日内重复测定6次得日内精密度，连续测定3天得日间精密度，见表5。

表5 各化合物的日内及日间精密度

将上述方法应于一起实际案件的吸毒尿样分析中，尿样中检出3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因成分的含量分别为2.603、0.044、0.331、0.531μg/mL。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述LC-MS及MS的条件分别如下：

1)LC-MS色谱条件：

流动相由A、B组成，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的水，B为含2mmol/L甲酸铵和0.05％(v/v)甲酸的乙腈，所述A、B的体积比为90∶10；

柱温：45℃；

流速：0.2mL/min；

进样量：10μL；

2)MS条件：

检测方式：多反应监测MRM；

扫描方式：正离子扫描；

电喷雾电压：3200V；

雾化气流速：N₂ 600L/hr；

锥孔反吹气流速：N₂ 50L/hr；

离子源温度：105℃；

碰撞气：氩气；

内标：吗啡-d3。

2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述MRM参数是根据每个化合物选取两个母离子-子离子对，结合保留时间定性，峰度强的子离子定量。

3.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，样品采用以下方式进行处理：

首先固相萃取，依次用甲醇、水活化柱子，精取全血稀释液或尿样加入内标，混匀后上柱，淋洗柱子，洗脱，洗脱液在空气流下吹干，残渣用流动相溶解，然后转移至自动进样小瓶中进样。

4.根据权利要求3所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，全血用纯净水1∶1(v/v)稀释后离心上样。

5.根据权利要求3所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，固定相为C₁₈。

6.根据权利要求1至5任一项所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述吗啡类生物碱为3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O⁶-单乙酰吗啡和可待因。