CN101923081B - 检测尿中吗啡类生物碱的柱切换lc-ms/ms分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测尿中吗啡类生物碱的柱切换LC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统；2)按设定的LC-MS/MS条件分析样品；3)结果分析。本发明方法对尿样中的吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因的检测限为0.3～1ng·mL^-1，相关系数γ在0.9991以上，线性关系良好。同时，尿样可以直接进样分析，无需前处理，简化了实验步骤，节约了成本。本发明方法快速、灵敏、简单、可靠，可广泛应用于实际案例分析中。

Description

检测尿中吗啡类生物碱的柱切换LC-MS/MS分析方法

技术领域

本发明涉及一种检测尿中吗啡类生物碱的柱切换LC-MS/MS分析方法，具体涉及一种检测尿样中的吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因或乙酰可待因的柱切换LC-MS/MS分析方法。

背景技术

近年来随着国际毒潮持续泛滥，境外毒品对我国的侵袭日益加剧，吸食或注射海洛因的人员也越来越多。为了打击毒犯，维护正义，禁毒部门逐年加大对毒品案件的侦查力度。禁毒部门在侦破毒品案件时，为了定性检测吸毒嫌疑人体液中的毒品，常使用单抗免疫检测试剂盒，但是单抗免疫检测试剂盒容易受到某些药物的干扰出现假阳性，不能直接单独用作吸毒案件的定性依据，因此对这类人群体液中定性检验毒品，从而判断他们是否吸食毒品海洛因尤为重要。海洛因进入人体后，在体内代谢很快，几乎检测不到原体海洛因，而且海洛因在人体内很快代谢为吗啡和单乙酰吗啡，而吗啡属于水溶性药物，极性较大，应用气相色谱直接分析较为困难，而且灵敏度低。目前，气相色谱-质谱(GC-MS)分析尿中吗啡已有很多报道，但是对检材必须采用混合溶剂(氯仿∶异丙醇＝9∶1)提取、丙酸酐衍生化后用GC-MS进行定性分析，样品处理繁琐、难以满足实际案件快速检验的需要。

样品前处理是生物样品分析方法中一个非常重要的步骤，也是比较费时、工作量大的过程。柱切换技术，通过阀切换将处理试样与分析统一在一个系统中，不仅增加了样品处理的安全性，而且减少了人为因素影响，提高了准确度和精密度。液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术集液相色谱高效的在线分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性于一体，正成为法医毒物分析强有力的工具。多反应监测(MRM)模式通过两次离子选择作用，锁定目标物的母离子-子离子对，大大提高了分析的专一性和灵敏度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测尿中吗啡类生物碱的柱切换LC-MS/MS分析方法，通过仪器改装，将柱切换技术与LC-MS/MS联用，使得待测尿样无需前处理，可直接进样，大大简化了实验步骤，节约了分析时间，降低了成本，同时，本发明的柱切换LC-MS/MS分析方法快速、灵敏、可靠，可广泛应用于实际案例的分析。

本发明所述的柱切换LC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：

1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统

为了实现柱切换，本发明的分析方法至少需配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统，所述系统具体包括十通切换阀1、四元梯度泵2、高压二元泵3、进样器4、预处理柱5、分析柱6和检测器7。其中，十通切换阀1的接口⑤与四元梯度泵2连接；十通切换阀1的接口⑩与高压二元泵3通过进样器4连接；十通切换阀1的接口④、⑨分别与预处理柱5的两端相连；分析柱6的一端与十通切换阀1的接口⑧相连，另一端与检测器7连接。

所述四元梯度泵2为Waters Alliance 2695泵，高压二元泵3为Waters1525泵，检测器7为Quattro Premier XE串联四极杆质谱。

所述的双泵输液系统和高压流路选择阀系统的具体流路过程如下：

a.初始状态I(参见图1)：四元梯度泵2输送分析流动相，依次通过十通切换阀1的接口⑤、⑥、⑦、⑧，进入分析柱6；高压二元泵3输送预处理流动相经过进样器4，通过十通切换阀1的接口⑩、⑨，流入预处理柱5，即当样品通过进样器4进样时，预处理流动相将样品带入预处理柱5，样品在预处理柱5上被净化和富集，废液通过十通切换阀1接口④、③排出；经过预处理时间后，十通切换阀1切换为进样状态II。

b.进样状态II(参见图2)：分析流动相通过十通切换阀1的接口⑤、④进入预处理柱5并把样品通过十通切换阀1的接口⑨、⑧，冲入分析柱6，并最终进入到检测器7中进行检测。

其中，在进样状态II情况下，高压二元泵3继续持续不断的输送预处理流动相，此时十通切换阀1通过接口⑩、①、②、③直接将预处理流动相排出；经过切换时间后，十通切换阀1切换成初始状态I，平衡准备下一次进样。

2)液相色谱条件

a.预处理柱型号：HLB 25μm 2.1×20mm(Waters公司)

预处理柱柱温：室温

预处理流动相：水

流速：1.0mL·min^-1

预处理时间：36s

切换时间：36s-3.00min

b.分析柱型号：MS C18 3.5μm 2.1mm×150mm(Waters公司)

分析柱柱温：35℃

分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0.05％(v/v)甲酸的水溶液(0.126克甲酸胺和500μL甲酸，加水至1000mL)，B为2mM甲酸胺和0.05％(v/v)甲酸的乙腈(0.126克甲酸胺和500μL甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。

流速：0.2mL·min^-1

梯度：流动相梯度洗脱条件见表1。

表1流动相梯度洗脱条件

c.进样量：100μL

3)质谱条件

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：吗啡-d3

4)MRM参数

各化合物及内标设两个母离子-子离子对。

5)结果分析

根据色谱图和回归方程，计算各化合物的浓度。经检测，本发明方法对尿样中的吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因的检测限为0.3～1ng·mL^-1，相关系数γ在0.9991以上，线性关系良好。

其中，要实现本发明所述的柱切换LC-MS/MS分析方法，首先需要确定以下条件：

1)切换时间的确定

采用柱切换方法，切换时间的确定至关重要，本发明通过实验确定预处理流动相冲洗时间。初始状态I时，预处理柱和分析柱是并联状态，进样后各化合物富集、保留在预处理柱上，36s后切换到进样状态II，即可除去尿液中的水溶性杂质和盐类，同时使峰面积达到最大化，此时，时间增加或者减少时，峰面积均减小；进样状态II时，预处理柱和分析柱串联在一起，分析流动相将保留在预处理柱上的化合物洗脱进入分析柱，3.00min后回到初始状态I，化合物继续在分析柱上完成分离，但当时间增加时，峰面积不再增加，仅保留时间延长，因此确定切换时间为36s-3.00min。

2)液相色谱分析条件的确定

以乙腈和水作为分析流动相主体，同时根据样品离子化的需要，在乙腈和水中需要加入甲酸和甲酸铵，其中甲酸主要起到改善峰形的作用，甲酸铵可以提高仪器信号的响应值。为了克服梯度洗脱对色谱峰面积的稳定性的影响，本发明在分析流动相A和分析流动相B中加入相同浓度的甲酸和甲酸铵，保证了梯度变化过程中甲酸和甲酸铵的浓度一致，改善了色谱峰面积的稳定性。另外，吗啡类生物碱水溶性较大，在色谱柱上不易保留，而且由于母体结构相似，碎片离子也相同，本发明为了确保所述柱切换LC-MS/MS分析方法定性定量的准确性，避免相互干扰，保证分析的化合物在保留时间上分开，于是本发明采用初始为90％(v/v)的A相的梯度洗脱，最终各化合物得到了很好的分离。

相对于现有技术，本发明的柱切换LC-MS/MS分析方法，具有如下优点：

1)前处理简单，自动化操作，样品只需简单处理或不经处理即可进样分析，同时本发明方法也适用于对不稳定药物的检测分析。

2)样品在预处理柱上被净化和富集，提高了分析灵敏度。特别是当无法用液-液萃取检测水溶性较大的组分时，可采用本发明方法检测，并可取得很好的效果。

3)样品处理的全过程由仪器程序控制，即使进样体积较大，也可获得很高的精密度与重现性。

附图说明

图1为本发明分析方法的初始状态I的示意图，其中，1为十通切换阀、2为四元梯度泵、3为高压二元泵、4为进样器、5为预处理柱、6为分析柱、7为检测器，十通切换阀1与高压二元泵3通过进样器4相连的接口为⑩，按逆时针其余的接口依次为①②③④⑤⑥⑦⑧⑨，其中，每相邻的两个接口相通，具体为接口①与接口②，接口③与接口④，接口⑤与接口⑥，接口⑦与接口⑧，接口⑨与接口⑩相通，共形成五组通路。

图2为本发明分析方法的进样状态II的示意图，各数字标号同图1，此状态下的五组通路分别为：接口①与接口⑩，接口②与接口③，接口④与接口⑤，接口⑥与接口⑦，接口⑧与接口⑨相通。

图3为本发明分析方法的总离子流色谱图。

图4为实际案件中尿样中吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因的色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

仪器和试剂：

Quattro Premier XE串联四极杆液-质联用仪，Waters Alliance 2695四元梯度泵及Waters 1525高压二元泵、配MassLynxV4.1软件购于美国Waters公司)，十通切换阀(Rheodyne，USA)。

对照品：吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因及内标吗啡-d3来源于中国药品生物制品检定所、Cerilliant公司。

乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均为色谱纯，购于Merck公司，其他试剂均为国产分析纯，水为自制超纯水。

储备液：吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因为固体对照品，配成1.0mg·mL^-1的甲醇溶液，再按照浓度配成混合稀释液。内标吗啡-d3为1.0mg·mL^-1的甲醇溶液，稀释成浓度为0.1mg·mL^-1的甲醇溶液。

实施例1

配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统

将十通切换阀1的接口⑤与四元梯度泵2(Waters Alliance 2695)连接；十通切换阀1的接口⑩与高压二元泵3(Waters 1525)通过进样器4连接；十通切换阀1的接口④、⑨与预处理柱5(

HLB)的两端分别相连，分析柱6(

MS C18)的一端与十通切换阀1的接口⑧相连，另一端与检测器7(Quattro Premier XE串联四极杆质谱)连接。

实施例2

吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因的检测

1.液相色谱条件

a.预处理柱型号：HLB 25μm 2.1×20mm(Waters公司)

预处理柱柱温：室温

预处理流动相：水

流速：1.0mL·min^-1

预处理时间：36s

切换时间：36s-3.00min

b.分析柱型号：

MS C18 3.5μm 2.1mm×150mm(Waters公司)

分析柱柱温：35℃

分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0.05％(v/v)甲酸的水溶液(0.126克甲酸胺和500μL甲酸，加水至1000mL)，B为2mM甲酸胺和0.05％(v/v)甲酸的乙腈(0.126克甲酸胺和500μL甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。

流速：0.2mL·min^-1

梯度：流动相梯度洗脱程序见表1。

c.进样量：100μL

2.质谱条件

检测方式：多反应监测(MRM)

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：吗啡-d3

3.MRM参数

各化合物及内标设两对母离子-子离子对，各MRM参数详见表2。

表2各化合物及内标的质谱MRM参数

4.结果分析

1)色谱图

各化合物的总离子流色谱图参见图3，其中，吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因及内标在选定的液相色谱分析条件下，保留时间分别为6.01min、7.69min、9.58min、10.80min和6.01min，色谱行为良好。

2)最低检测限

以峰强度较低的子离子峰强度信噪比(S/N)＝5时确定为最低检测限，各化合物的检测限参见表3。

表3各化合物的检测限和线性关系

3)线性关系和精密度

分别取不同量的对照品混合液(含吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因)于具塞尖底试管中，吹干后加入空白尿样配成系列浓度的样品。以峰面积与内标峰面积之比(Y)对样品中化合物的浓度(X)作图，得到回归方程和相关系数，结果见表3，由表3可以看出各化合物线性关系良好。

高、中、低浓度日内重复测定6次得日内精密度，连续测定4天得日间精密度，结果见表4。

表4各化合物的日内及日间精密度

经分析，本发明方法对尿样中的吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因的检测限为0.3～1ng·mL^-1，相关系数γ在0.9991以上，线性关系良好，可广泛应用于多起实际案件的吸毒尿样分析。

图4为实际案例中一吸毒案件的尿样检测色谱图，检出吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因成分，其含量分别为87.3ng·mL^-1、10.3ng·mL^-1、16.7ng·mL^-1、4.1ng·mL^-1。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (1)

1.一种检测尿中吗啡类生物碱的柱切换LC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统：所述系统包括十通切换阀(1)、四元梯度泵(2)、高压二元泵(3)、进样器(4)、预处理柱(5)、分析柱(6)和检测器(7)；其中，所述十通切换阀(1)的接口⑤与所述四元梯度泵(2)连接；所述十通切换阀(1)的接口⑩与所述高压二元泵(3)通过所述进样器(4)连接；所述十通切换阀(1)的接口④、⑨与所述预处理柱(5)的两端分别相连；所述分析柱(6)的一端与所述十通切换阀(1)的接口⑧相连，另一端与所述检测器(7)连接，其中，所述四元梯度泵(2)为Waters Alliance 2695泵，所述高压二元泵(3)为Waters 1525泵，所述检测器(7)为Quattro Premier XE串联四极杆质谱；

2)按设定的LC-MS/MS条件分析样品，其中，所述吗啡类生物碱选自：吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因、乙酰可待因，

LC-MS色谱条件如下：

i)预处理柱型号：

HLB 25μm 2.1×20mm

预处理柱柱温：室温

预处理流动相：水

流速：1.0mL·min^-1

预处理时间：36s

切换时间：36s-3min

ii)分析柱型号：

MS C183.5μm 2.1mm×150mm

分析柱柱温：35℃

分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0.05％甲酸的水溶液，B为2mM甲酸胺和0.05％甲酸的乙腈

流速：0.2mL·min^-1

iii)进样量：100μL，

LC-MS色谱采用流动相梯度洗脱，洗脱条件为：

MS条件如下：

检测方式：多反应监测MRM

扫描方式：正离子扫描

电喷雾电压：3200V

雾化气流速：N₂，600L/hr

锥孔反吹气流速：N₂，50L/hr

离子源温度：105℃

碰撞气：氩气

内标：吗啡-d3

质谱MRM参数为：

3)结果分析：根据色谱图和回归方程，计算各化合物的浓度。

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