CN104483427A - 一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其具体步骤为：（1）水样的预处理；（2）浓缩富集：依次用等体积甲醇，超纯水和稀酸溶液活化固相萃取小柱；将水样过柱，富集完成后用淋洗液淋洗小柱并在真空下干燥；洗脱液洗脱目标物，收集洗脱液在氮气流下吹干，用有机溶液溶解残留物并加入内标，定容；过滤后转移至棕色进样瓶中，待测；（3）定量检测水源水中12种抗生素。本发明能够有效的分离富集并检测多个不同种类的抗生素物质，具有高回收率、高灵敏度、高选择性及操作简便等优点，对水源水中12种抗生素的痕量分析检测效果显著。
Description
【技术领域】
本发明提供了一种微量有机污染物的检测方法，特别地提供一种以固相萃取（SPE）作为前处理，基于液质联用法(HPLC-MS/MS)同时检测水源水中多达12种抗生素的分析方法，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域，具体地说，是一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法。
【背景技术】
近年来，抗生素类药物不仅常用于治疗人体细菌性疾病，同时也被广泛用于畜牧业和水产养殖业作为抗菌生长促进剂加快动物的生长。通常医用和兽用抗生素使用中约有30%-90%会以原药或其轭合物形式排出体外，通过医用废水或者生活污水进入污水处理厂，而现有的污水处理工艺对抗生素类物质的去除效果并不理想。
近年来我国抗生素的年平均消费量高达2.5万吨。据报道，在工业污水、养殖废水、河流地表水甚至潜在水源地水体中均已检出多种抗生素，如珠江(11-460 ng/L)、 黄河(3-300 ng/L)、黄浦江(0.17-313 ng/L)、长江口(0.03-219 ng/L)。虽然抗生素在环境水体中的残留浓度大多低于1 μg/L，但长期稳定存在的低浓度抗生素能够诱导和传播微生物的抗生素耐药性，并通过食物链对人类健康构成潜在威胁。
随着人类对于水环境安全问题的日益重视，有关环境水体中抗生素残留检测的专利和论文已有公开发表，但这些研究多针对某一类或两三类抗生素的同步分析并且所分析抗生素的总数量最多不超过6种。然而抗生素的种类数量繁多，关于多种类多数量抗生素残留的分离富集和同步分析方法的建立显得颇为重要。
目前，有关检测环境水体中抗生素残留的分析方法已经引起了科学家的广泛关注，并对此进行了深入研究：
中国专利公开号CN103293248A公开了一种水体中磺胺类抗生素的分离富集方法。所述方法是将水样酸化并通过活化的HLB固相萃取柱富集，然后洗脱液洗脱目标物并在氮气流下吹干，残留物用乙腈溶解后以液相色谱-串联质谱法检测三种磺胺类抗生素的含量。
中国专利公开号 CN103336080A公开了一种同时检测水中四环素类的方法。所述方法包括水样过滤、调节水样pH为2-4、活化HLB固相萃取柱、水样富集、甲醇洗脱目标物并在氮气流下吹干，最后用乙腈溶解残留物后以3200QTrap液相色谱-串联质谱仪检测痕量四环素类抗生素的浓度，灵敏度高且重现性好。
中国专利公开号CN102798689A公开了一种分离富集并检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素的方法。所述方法是将水样静置后经过0.45 μm混合滤膜过滤，然后依次用甲醇、超纯水活化HLB固相萃取小柱，将水样流经小柱，用磷酸、超纯水依次淋洗小柱，甲醇洗脱并用氮气吹至1mL以下，最后用甲醇定容1mL并加入内标物，采用液相色谱-串联质谱法定量检测。该方法对活化剂、淋洗剂、过柱流速、洗脱剂和洗脱体积进行了优化选择，具有检测限低、灵敏度高、选择性好等优点。
中国专利公开号CN103344715A公开了一种分离富集水中青霉素类抗生素的方法。所述方法是将水样pH用酸调至2-4，依次用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB柱，水样过柱富集后用1%甲酸的甲醇溶液洗脱，氮气流下吹干洗脱液并用乙腈溶解残留物，采用液相色谱-串联质谱法定量检测青霉素类抗生素的浓度。此方法预处理环境友好、富集倍数高、分析快速准确。
中国专利公开号CN103278587A公开了一种分离富集水环境中三种头孢类抗生素的方法。所述方法包括用酸将水样pH调至2-4，过滤；依次用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB柱；水样富集后在氮气保护下干燥，用1%甲酸的甲醇溶液洗脱；收集洗脱液并在氮气流下吹干后乙腈溶解残留物，采用液相色谱-串联质谱法定量检测三种头孢类抗生素的浓度。
中国专利公开号CN102269747A公开了一种一次性测定多种抗生素的方法。所述方法包括制备样品滤液、设定液相色谱条件和质谱条件，并通过上述条件分析养殖场动物粪便、土壤、水体等环境样本中四环素类、氯霉素类和磺胺类共六种抗生素的含量，大大提高了方法的适用范围。
李清雪等（“水环境中多种磺胺类抗生素残留的HPLC同步检测”，《河北师范大学学报》，第37卷第3期，2013年5月）公开了一种使用高效液相色谱同步检测污水厂进出水中九种磺胺类抗生素的分析方法，并确定了最佳固相萃取条件。
但上述这些方法仍存在一些缺陷，例如只能针对某一类或少数几类具体的抗生素进行分析检测，而抗生素种类多达16种，这些方法无法检测出更多种类的抗生素；或者分析的环境样品大多为污水、河流地表水等水样样品，缺少与人类饮用水安全直接相关的饮用水水源地样品的分析等。因此，随着人们对饮用水安全的日益关注，针对饮用水水源地水体中多种类抗生素的同步分析检测非常迫切。
饮用水安全是当今环境安全问题的热点之一。随着饮用水安全标准的日益提高，对于能够快速、灵敏、准确地测定水源水中尽可能多的抗生素残留存在迫切需求，也是目前水环境领域中深入研究的重点课题之一。然而迄今为止，针对水源水中多种抗生素残留的分离富集和同步分析检测尚无一套完整可靠的专利，因而本发明应运而生。该方法能够实现快速、灵敏、准确地检测出水源水中四大类共12种抗生素，将大大降低检测成本并对饮用水安全研究做出贡献。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法；通过前处理过程的优化、液相色谱条件和质谱条件的优化，最终所得的各组分提取色谱峰峰形尖锐、对称性良好，实现了稳定和准确地对水源水样品中12种典型抗生素的分离富集和定量测定，从而为水源水安全的检测提供了一种新颖可靠的手段和方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其具体步骤为：
（1）水样的预处理
取1 L水样经滤膜过滤除去悬浮物，用酸调pH并加入螯合剂，固相萃取前加入替代物指示回收率；
上述步骤（1）中，作为水样的预处理方式，可取1 L水样，经玻璃纤维滤纸过滤除去细小颗粒状悬浮物后用稀盐酸调节pH，加入Na2EDTA 作为螯合剂，固相萃取前加入替代物13C3-咖啡因（13C3-caffeine）指示回收率。
其中，过滤水样所用玻璃纤维滤膜并没有特别的限定，例如可为GF 6或GF/F系列，其孔径可为0.45 μm左右，非限定性地可例举0.45 μm、0.7 μm。其目的是过滤去除颗粒悬浮物质，防止后续对富集和检测的影响。
其中，得到过滤后的水样调节pH值时，所述pH值可为3-4，非限定性地可举例3.2、3.4、3.6和3.8。
（2）浓缩富集
依次用等体积甲醇，超纯水和稀酸溶液活化固相萃取小柱；将水样过柱，富集完成后用淋洗液淋洗小柱并在真空下干燥；洗脱液洗脱目标物，收集洗脱液在氮气流下吹干，用有机溶液溶解残留物并加入内标，定容；过滤后转移至棕色进样瓶中，待测；
上述步骤（2）中，作为水样浓缩富集的一个实施方式，其步骤如下：依次用等体积甲醇、超纯水和稀盐酸溶液活化Oasis HLB固相萃取小柱；将预处理后的1 L水样以较慢流速经过固相萃取小柱；萃取完成后用甲醇的水溶液淋洗小柱，真空干燥10-20 min；用甲醇洗脱目标物，收集洗脱液在氮气流下吹至近干，用有机溶剂溶解残留物并加入内标物西玛通，定容至1 mL；经针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
其中，浓缩富集水样采用的固相萃取小柱为Oasis hydrophilic-liphophilic balance (简称Oasis HLB)，它是由亲水性的N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
其中，活化固相萃取小柱所用等体积甲醇、超纯水和稀盐酸溶液的体积并没有特别的限定，例如可为5 mL、8 mL或10 mL。
其中，活化固相萃取小柱所用稀盐酸溶液的pH值并没有特别的限定，所述pH值可为3-4，非限定性地可举例3.2、3.4、3.6和3.8。
其中，水样流经固相萃取的流速并没有特别的限定，例如可为2 mL/min、3 mL/min或5 mL/min。为了保证目标物质在固相萃取小柱上被充分吸附，水样流经速度最好不超过10 mL/min。
其中，萃取完成后淋洗小柱所用一定比例甲醇的水溶液中甲醇比例并没有特别的限定，例如可为3%、5%或10%。其目的是洗去保留在固相萃取小柱上的杂质成分，但为了防止目标物质同时被淋洗的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的比例最好不超过10%。
其中，淋洗过后固相萃取小柱真空干燥的时间并没有特别的限定，例如可为10 min、15 min或20 min。其目的是将淋洗剂中的水分抽干，以免水分被带入下一步的洗脱液中。
其中，溶解氮吹后残留物质的有机溶剂并没有特别的限定，例如可为甲醇、甲醇/水（1:1，体积比）或乙腈。
其中，过滤所使用针式滤器的有机相膜并没有特别的限定，例如可为PTFE (聚四氟乙烯)，其孔径可为0.45 μm或以下，非限定性地可例举0.22 μm、0.45 μm。
(3) 定量检测水源水中12种抗生素
(3.1) 液相色谱分离，有机相流动相为乙腈，水相流动相为体积分数0.1%甲酸水溶液。初始流动相中水相比例85%，平衡10 min；2 min内降至50%，平衡3 min；2 min后继续降至10%，平衡3 min; 再由2 min内升至初始流动相85%，平衡6 min,至样品组分完全流出色谱柱，并进行随后的串联质谱检测；
(3.2) 质谱检测，使用正电喷雾电离源，干燥气温度为350℃；气体流为11 L/min ，毛细管电压为4000 kV；雾化器压力为15 psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测（SIM）模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
1. 选择Oasis HLB固相萃取柱对四大类共12种抗生素进行富集纯化，回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的；
2. 采用液质联用仪进行定量分析检测，灵敏度高，12种抗生素的检出限均低于10 ng/L，能够满足对水源水中痕量抗生素的检测要求。此外，串联三重四级杆质谱仪根据由对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定量分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰；
3. 采用内标标准曲线法测定抗生素的浓度，线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度；
4. 前处理过程操作简单，环境友好。
总之，本发明能够有效的分离富集并检测多个不同种类的抗生素物质，具有高回收率、高灵敏度、高选择性等优点 ，对水源水中12种抗生素的痕量分析检测效果显著。
【附图说明】
图1为固相萃取柱填料和水样pH值对目标物回收率的影响，其中，（A）为三种固相萃取填料在碱性条件下对目标物的回收率；（B）为三种固相萃取填料在中性条件下对目标物的回收率；（C）为三种固相萃取填料在酸性条件下对目标物的回收率。
图2. 萃取体积对回收率的影响。
图3. 12种抗生素混合标准溶液(100 μg/L)的总离子流图。
图4 .12种抗生素及替代物和内标物的提取色谱图。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法的具体实施方式。
实施例1：固相萃取条件
一、固相萃取柱填料和水样pH值
固相萃取柱的选择取决于柱填料与目标物上官能团的相互作用，由于本发明涉及物理化学性质不同的四大类抗生素的分离富集与检测，为实现每种抗生素富集效率最大化，本发明研究了三种不同柱填料（Isolute C18、Cleanert PEP和Oasis HLB）分别对三种不同pH值水样(酸性、中性和碱性）的萃取效果，每个正交实验均一式三份，结果见图1。
实验结果表明：当水样调节至酸性（pH=3-4），经过HLB固相萃取柱富集时，可保证每种抗生素的回收率均在60%-120%，可实现对12种抗生素的有效富集且满足环境样品加标回收率的控制限要求。
二、萃取体积
载样量过大或目标物浓度过高均可导致固相萃取过程中穿透现象的发生，萃取体积宜在保证固相萃取小柱不发生穿透的前提下尽量提高富集倍数。本发明选择纯水加标浓度100 ng/L(保守估计水源水中可能存在的最大浓度)，分别采用水样体积为0.5 L，1 L和2 L进行对比实验，每个萃取体积条件均设置三个平行，不同萃取体积下的回收率见图2。
实验结果表明：目标物回收率并未随萃取体积的增加而增加，相反，当萃取体积2 L时，所有目标物回收率均有很较大程度的损失。与萃取体积0.5 L相比，当萃取体积1 L时，可满足更多种类抗生素的回收率大于80%。
实施例2：前处理及固相萃取
准确量取1 L水样，经0.7 μm玻璃纤维滤膜过滤除去悬浮物。滤液用稀盐酸调pH至3-4，加入Na2EDTA作为螯合剂。固相萃取前，加入13C3-咖啡因指示回收率。
将Supelco12管固相萃取装置、Oasis HLB小柱、缓冲装置和真空泵按顺序连接好。依次用10 mL甲醇、超纯水和稀盐酸溶液活化Oasis HLB固相萃取小柱；将预处理后的1 L水样以2-3 mL/min的流速经过柱子；萃取完成后用甲醇-水溶液淋洗小柱，真空干燥10 min；用甲醇洗脱目标物，收集洗脱液在氮气流下吹干，用甲醇-水溶液溶解残留物并加入内标物西玛通，定容至1 mL；经0.22 μm PTFE针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
实验结果表明：所有12种抗生素在本发明所述前处理过程和固相萃取条件下均能被良好吸附，富集效果理想。
实施例3：检测方法的建立
（一）液相条件的优化
为了实现色谱峰分离并提高信号强度，本发明对流动相、流速、进样量及梯度洗脱程序等影响液相分离的关键因素分别做了优化。本发明采用的液相检测条件见表2。
表2. HPLC-MS/MS检测条件
（二）质谱条件的优化
液相色谱-串联质谱仪能够利用特征碎片离子准确定量，为此，需要优化碎裂电压和碰撞能，以获得最佳分子离子-碎片离子对，使后续对实际水样的检测分析更加精确。表3中列出了12种抗生素的碎裂离子分布，其它质谱条件见表2。
表3. 12种抗生素的碎裂离子分布
（三）定量方法
本发明选用西玛通（Simatone）作为12种抗生素的内标物，采用内标法定量。西玛通与目标物在相同的色谱时间段被洗脱，且在正电喷雾电离源模式下响应良好无明显基质干扰。因此，西玛通是本发明中十分理想的内标物质。12种抗生素混合标准溶液及内标溶液的总离子流图和提取色谱图分别见图3和图4。
此外，除了采用内标标准曲线外，串联质谱仪利用信号响应强度最大的特征碎片离子作为定量离子，各物质的定量离子见表3。
（四）灵敏度与线性相关性
评价灵敏度的两个常用指标即检出限和定量限。本发明方法对12种目标物的检出限在0.2-7.5 ng/L之间，定量限在0.7-26.4 ng/L之间，灵敏度高，能够满足对水源水中痕量抗生素的检测要求。本方法中12种目标物的线性范围为2-200 μg/L，线性相关系数均在0.99以上，线性关系良好。
（五）回收率
采用实施例2的前处理方法和实施例3的检测方法，对水源水样品的加标回收率（加标浓度：100 ng/L，n=6）见表4。由此可见，本发明方法对12种目标物质的回收率在64-97%之间，相对标准偏差均低于5%，满足环境样品加标回收率的控制限要求。
表4. 12种抗生素的加标回收率
| 化合物名称 | 回收率(%) | 相对标准偏差（%） |
| TMP | 77.5 | 0.3 |
| SD | 86.6 | 2.2 |
| SMZ | 85.4 | 1.2 |
| SMX | 97.2 | 3.8 |
| SCP | 81.6 | 1.3 |
| ENR | 87.9 | 3.5 |
| OFL | 80.6 | 2.1 |
| NOR | 63.5 | 1.6 |
| CIP | 69.9 | 1.6 |
| TC | 81.6 | 1.9 |
| OTC | 86.2 | 2.3 |
| ROX | 67.2 | 1.5 |
实验结果表明：所有12种抗生素及替代物和内标物在该方法条件下峰形良好、回收率高、检测线低，能够实现对多种抗生素残留同时快速准确的分析检测。
实施例4：实际样品测定
选取华东地区某水源地水样，采用所发明前处理方法和检测方进行富集和分析，以考察所建立检测方法的适用性。所得水源水样品在本发明检测操作条件下的分析检测结果示于下表5。
表5. 水源水中12种抗生素的检测值
| 抗生素名称 | 浓度（ng/L） | 抗生素名称 | 浓度（ng/L） |
| TMP | - | OFL | 15.40 |
| SD | 3.36 | NOR | 33.90 |
| SMZ | 2.08 | CIP | 37.90 |
| SMX | 9.93 | TC | 39.40 |
| SCP | 0.81 | OTC | 37.62 |
| ENR | - | ROX | 0.03 |
注：“-”表示未检测到
实验结果表明：所建方法已成功应用于华东地区某水源地水体中抗生素残留的分析检测，在所有12种抗生素中，除了甲氧苄啶和恩诺沙星，其他抗生素均被检出，其中喹诺酮类和四环素类是该水源地主要抗生素残留种类。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，其具体步骤为：
（1）水样的预处理
取1 L水样过滤除去悬浮物，用酸调pH并加入螯合剂，固相萃取前加入替代物指示回收率；
（2）浓缩富集
依次用等体积甲醇，超纯水和稀酸溶液活化固相萃取小柱；将水样过柱，富集完成后用淋洗液淋洗小柱并在真空下干燥；洗脱液洗脱目标物，收集洗脱液在氮气流下吹干，用有机溶液溶解残留物并加入内标，定容；过滤后转移至棕色进样瓶中，待测；
（3）定量检测水源水中12种抗生素
(3.1) 液相色谱分离，有机相流动相为乙腈，水相流动相为体积分数0.1%甲酸水溶液；
初始流动相中水相比例85%，平衡10 min；2 min内降至50%，平衡3 min；2 min后继续降至10%，平衡3 min; 再由2 min内升至初始流动相85%，平衡6 min后运行下一个样品；
(3.2) 质谱检测，使用正电喷雾电离源，干燥气温度为350℃；气体流为11 L/min ，毛细管电压为4000 kV；雾化器压力为15 psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测（SIM）模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。
2.如权利要求1所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，
上述步骤（1）中，作为水样的预处理方式，取1 L水样，经滤膜过滤除去细小颗粒状悬浮物后用稀盐酸调节pH，加入Na2EDTA 作为螯合剂，固相萃取前加入替代物13C3-咖啡因（13C3-caffeine）指示回收率；
其中，得到过滤后的水样调节pH值时，所述pH值可为3-4；
其中，过滤水样所用玻璃纤维滤膜。
3.如权利要求1所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，
上述步骤（2）中，作为水样浓缩富集的一个实施方式，其步骤如下：依次用等体积甲醇、超纯水和稀盐酸溶液活化Oasis HLB固相萃取小柱；将预处理后的1 L水样以较慢流速经过固相萃取小柱；萃取完成后用甲醇的水溶液淋洗小柱，真空干燥10-20 min；用甲醇洗脱目标物，收集洗脱液在氮气流下吹至近干，用有机溶剂溶解残留物并加入内标物西玛通，定容至1 mL；经针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
4.如权利要求3所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，浓缩富集水样采用的固相萃取小柱为Oasis hydrophilic-liphophilic balance (简称Oasis HLB)，它是由亲水性的N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
5.如权利要求3所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，活化固相萃取小柱所用稀盐酸溶液的pH值并没有特别的限定，所述pH值可为3-4。
6.如权利要求3所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，水样流经固相萃取的水样流经速度不超过10 mL/min。
7.如权利要求3所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，淋洗所用水溶液中甲醇的比例最好不超过10%。
8.如权利要求3所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，溶解氮吹后残留物质的有机溶剂并没有特别的限定，可为甲醇、甲醇/水或乙腈。
9.如权利要求3所述的一种分离富集并同时检测饮用水源水中12种抗生素的方法，其特征在于，过滤所使用针式滤器的有机相膜为PTFE，其孔径可为0.45 μm或以下。
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