CN107543876A - 一种固相萃取‑液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激素类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种固相萃取‑液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激素类物质的方法。该方法包括：(1)水样预处理；(2)使用固相萃取小柱富集净化目标雌激素；(3)采用内标法使用高效液相色谱串联质谱仪定量检测水体中9种雌激素类物质的含量。该方法采用单因素试验，对固相萃取小柱的种类、固相萃取pH值、淋洗剂种类和用量、洗脱剂种类和用量等进行了优化；同时对液相色谱柱温、流速、进样量、流动量种类和梯度比例等进行了优化，得到出峰时间短、分离度好的离子流图。该方法将指示回收率的内标物加在固相萃取前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果更加真实可靠。

Description

一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激 素类物质的方法

技术领域

本发明属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测技术领域，涉及三种水环境中9种常规雌激素类物质的前处理方法和仪器检测分析技术，具体涉及一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激素类物质的方法。

技术背景

近些年来，环境内分泌干扰物(EDCs)已经引起人们的广泛关注，研究表明EDCs能够诱导雄鱼雌性化，影响水生生物机体的生长繁殖，会增加人类乳房癌的发病率。而天然和人工合成雌激素是最重要的EDCs，它们具有最强的内分泌干扰性，在纳克级水平就足以对水生生物造成不利影响。由人体和畜禽动物排泄产生的天然雌激素会经污水处理厂和畜禽动物养殖场排放进入水体环境，而人工合成雌激素作为激素类药物和动物饲料添加剂被使用从而进入水环境中，以及一些具有内分泌干扰效应的工业化学品在生产和使用过程释放到水环境当中。因此，水环境中雌激素污染不容忽视。

要对水环境中雌激素进行控制，雌激素的前处理方法和检测技术至关重要，因为它们是影响分析测定结果准确性的关键。随着人们对水环境中雌激素污染问题的日益重视，目前已有不少关于水环境雌激素检测方法的研究报道。例如，利用GC-MS方法检测雌激素具有良好的分辨度，但该方法具有局限性，它需要对物质进行衍生化处理才可分析测定，这无疑增加了处理难度和操作的复杂性。利用LC-MS/MS分析方法检测雌激素具有很多优势，如分析时间短，无需衍生化步骤，高灵敏度和低检出限等。这些方法的前处理方式大多以固相萃取为主，因为，它具有富集净化和降低基质效应的优势。但因水环境基质的多样性和复杂性以及分析物结构性质的差异，固相萃取的各个步骤参数的选择有所不同。另外，水样经过固相萃取富集的同时也会产生不同程度的损失，故对该前处理方法的优化成了当务之急。

随着人们对水质要求的提高，急需一种能够高效准确测定水环境中微量有机污染物质残留的分析方法。而固相萃取(SPE)结合高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析技术可以满足这一需求，它结合了HPLC的高效分离能力和MS/MS的强选择性和高灵敏度，具有应用范围广、分析速度快、分离能力强、灵敏度高和自动化程度高等特点，目前已成为微量乃至痕量有机污染物质分析检测的重要方法之一。但现有的固相萃取结合液相色谱-质谱法用于水环境中雌激素类物质的检测时，大多由于预处理不好，或固相萃取前处理条件、液相色谱条件和/或质谱条件选得不好，或多或少存在着检测结果不够准确、不稳定、干扰多、有机试剂消耗大、检测雌激素数量和范围有限等问题。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术的缺陷，提供一种检测结果准确、稳定、干扰少，能同时测定水环境(自来水、河水、畜禽场污水)中9种常见雌激素类物质的方法，即一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激素类物质的方法。该方法采用固相萃取作为水环境样品的前处理技术，并利用高效液相色谱-串联质谱仪检测分析。该方法能够对水环境中雌酮(E1)、17α-雌二醇(17α-E2)、17β-雌二醇(17β-E2)、雌三醇(E3)、炔雌醇(EE2)、己烯雌酚(DES)、双酚A(BPA)、壬基酚(NP)和辛基酚(OP)这9种天然和人工合成雌激素的含量进行共检测，并且耗时少，有机溶剂消耗少，适用对象广，测定结果灵敏度高，准确度高，干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明一种能同时测定水环境(自来水、河水、畜禽场污水)中9种常见雌激素类物质的方法，即一种富集、净化、分离和同时检测水环境中9种雌激素类物质(雌酮、17α-雌二醇、17β雌二醇、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚、双酚A、壬基酚、辛基酚)的方法，该方法包括固相萃取富集净化条件的优化和高效液相色谱-串联质谱分析方法的优化。该方法采用单因素试验，以使9种雌激素类物质得到最大加标回收率为目标，对固相萃取小柱的种类、固相萃取pH值、淋洗剂种类和用量、洗脱剂种类和用量等进行优化；以使9种雌激素类物质在液相色谱中达到同步分离为指标，对液相色谱柱温、流速、进样量、流动量种类和梯度比例等进行优化，以得到出峰时间短、分离度好的离子流图。

本发明一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激素类物质的方法，按以下步骤实施：

(1)水样预处理

采集一定体积水样，过滤除去细小颗粒状悬浮物，加酸调节水样pH至3-4，固相萃取前加入内标物指示回收率。

(2)固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程

先后用甲醇和纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱，富集；再用纯水和低浓度的甲醇水溶液淋洗，并在真空条件下抽干固相萃取小柱；之后，再用甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹至近干，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测。

(3)高效液相色谱-串联质谱联用测定9种雌激素类物质的含量

采用内标法，使用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测水体中9种雌激素类物质的含量。

液相色谱分离参数：色谱柱柱温40℃；进样量5μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1。流动相A为Milli-Q超纯水，B为乙腈。梯度洗脱程序：0-3.0min，30％B；3.0-4.0min，30％B-90％B；4.0-7.0min，90％B；7.0-8.0min，90％B-30％B；8.0-10.0min，30％B。

质谱检测条件为：采用电喷雾离子化源负离子模式(ESI-)和三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式(MRM)进行检测。离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气(CUR)为35psi，喷雾气(GS1)为50psi，辅助加热气(GS2)为50psi，碰撞气(CAD)为Medium，碰撞气为高纯氮气。

进一步的实施方案如下：

上述步骤(1)中，采集水样的体积：自来水和河水分别为1L；而畜禽场污水为0.1L，离心去除大颗粒悬浮物后，用Mliil-Q超纯水稀释到1L。

上述步骤(1)中，过滤水样使用的过滤膜为Whatman GF/F系列孔径为0.45um的玻璃纤维滤膜；使用4mol/L的稀盐酸调节水样pH至3-4。

上述步骤(1)中，固相萃取前分别加入100ng/L的17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率；即：选用17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)作为雌酮(E1)、17α-雌二醇(17α-E2)、17β-雌二醇(17β-E2)、雌三醇(E3)、炔雌醇(EE2)的内标物，选用己烯雌酚-D8(DES-D8)作为己烯雌酚(DES)的内标物，选用4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)作为双酚A(BPA)、壬基酚(NP)和辛基酚(OP)的内标物。

上述步骤(2)中，所用的固相萃取小柱为200mg/6mL的Oasishydrophilic-liphophilic balance(简称Oasis HLB)，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱。活化固相萃取柱所用的甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍。水样过柱流速为3-6mL/min，淋洗萃取小柱所用的纯水和低浓度甲醇水溶液用量各为萃取柱体积的1-2倍。淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％(一般为5％)的甲醇-水溶液。淋洗后的抽干时间为15-30min。洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇(即高效液相色谱法级别的甲醇)。洗脱萃取小柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。

上述步骤(2)中，得到的残渣用甲醇-水体积比为7:3的甲醇水溶液重新溶解，定容，超声10-15min，用孔径在0.22um以下的滤膜过滤，待进样测定。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明的优点如下：

(1)选择Oasis HLB固相萃取柱对三类(天然雌激素、人工合成雌激素、有雌激素效应的内分泌干扰物)共9种常见雌激素类物质进行富集纯化，回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的。

(2)采用内标法定量，测定雌激素类物质的浓度更准确，线性关系好，相对标准偏差小，提高了分析的精密度。

(3)采用液质联用检测雌激素类物质含量，灵敏度高，检出限低。并且，三重四级杆质谱仪根据母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定量分析，专属性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰。另外，由于测定雌激素类物质需要使用电喷雾电离负离子模式，而负离子模式下的响应信号要弱于正离子模式，本发明使用美国AB公司的QTRAP5500系列的质谱仪，优化各项液相参数和质谱参数，克服了这一问题，完全可以满足对自来水、河水中微量乃至痕量雌激素和畜禽场污水中高基质干扰的雌激素的检测要求。

(4)本发明中有机试剂使用量少，一次进样可以同时检测出水体中的多种雌激素类物质(9种)，检测过程耗时少(10min)，节约人力物力成本。

(5)本发明中选用的三种内标物分别是：17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)，己烯雌酚-D8(DES-D8)，4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)，根据结构性质相似的原理，它们分别作为E1、17α-E2、17β-E2、E3、EE2的内标和DES的内标以及BPA、NP、OP的内标。3种内标物的加标量均为100ng/L。

本发明的方法将内标物质(指示回收率替代物)加在固相萃取前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，同时，考虑不同类别的雌激素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)，己烯雌酚-D8(DES-D8)，4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)作为E1、17α-E2、17β-E2、E3、EE2的内标物和DES的内标物以及BPA、NP、OP的内标物，由于内标物质选用得好，使得最终结果更加真实可靠。

附图说明

图1为三种水样中9种雌激素类物质加标回收率。

图2为111.11ug/L浓度的9种混合标准品雌激素溶液的总离子流图(TIC)，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为信号强度。

图3为9种雌激素类物质[雌酮(E1)、17α-雌二醇(17α-E2)、17β-雌二醇(17β-E2)、雌三醇(E3)、炔雌醇(EE2)、己烯雌酚(DES)、双酚A(BPA)、壬基酚(NP)和辛基酚(OP)]的标准曲线，横坐标为雌激素浓度与内标浓度的比值，纵坐标为雌激素峰面积与内标峰面积的比值。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下结合实施例进一步阐明本发明的实施方式和内容。

实施例1：本发明一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时测定水体中9种雌激素类物质的方法，具体按以下步骤实施：

步骤一、水样预处理

不同类型的水样所需体积有所差异，自来水和河水分别取1L；畜禽场污水取0.1L，离心去除大颗粒悬浮物后用Mliil-Q超纯水稀释10倍变为1L。使用Whatman GF/F系列孔径为0.45um的玻璃纤维滤膜过滤，收集过滤后的水样，分别加入100ng的17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)、己烯雌酚-D8(DES-D8)、4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)这三种指示回收率的内标物，混匀后用4mol/L的稀盐酸调节水样pH至3-4。

步骤二、固相萃取前处理：富集净化过程

(1)固相萃取柱的活化

使用Waters Oasis HLB 200mg/6mL规格的固相萃取柱进行水样雌激素的富集浓缩。水样过柱前，需要对萃取柱进行活化：先使用5mL甲醇淋洗固相萃取柱(SPE柱)，目的是使萃取填料碳氢键展开，以便后续对目标雌激素进行更好的吸附；再用5mL纯水淋洗SPE柱，目的是除去柱内多余的甲醇溶液以及对SPE柱进行平衡，为接下来水样过柱做好准备，而不至于导致柱内多余的甲醇对水样的富集带来损失。两者均在重力作用下完成活化。

(2)预处理水样过柱

每个过柱水样均为1L(自来水和河水取1L水样，畜禽场污水取0.1L水样稀释到1L)，过柱流速控制在3-6ml/min，约为1-2滴/秒。流速不能太快也不能太慢，太快会导致目标物不能很好的被SPE柱填料吸附，从而造成损失；太慢会增加水样中多余杂质被填料吸附的可能性，从而带来基质干扰。

(3)固相萃取柱的淋洗

水样过柱完成后，要对萃取柱进行淋洗，因为在水样吸附富集过程中，除了目标雌激素会被填料吸附，一些杂质也会被吸附于填充柱上，淋洗剂的选择取决于杂质的性质。故本发明通过实验发现：仅用纯水进行淋洗，仪器检测发现基线噪声干扰太强，而先后使用6mL纯水和6mL体积浓度为5％的甲醇水溶液淋洗SPE柱，能够去除一些吸附力相对弱的干扰杂质。淋洗之后，在抽真空条件下，干燥固相萃取柱15-30min后等待洗脱。

(4)固相萃取柱的洗脱

通过实验中发现，对三类雌激素的洗脱效果甲醇>乙酸乙酯>乙腈，因此本发明使用10ml甲醇(HPLC级甲醇)分两次洗脱，在重力作用下将固相萃取填料中吸附的雌激素洗脱出来，收集到玻璃试管中，最后打开真空泵在负压条件下使固相萃取柱中的甲醇全部流出并收集。

(6)洗脱液氮吹定容

在氮气作用下，将洗脱液吹至近干，加甲醇/水(体积比7:3)重新溶解，定容到1mL，超声10-15min，过0.22um尼龙滤膜，放4℃冰箱，待进样测定。

步骤三、液相色谱串联质谱法测定水环境中9种雌激素的含量

在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测水样中9种雌激素的含量(浓度)；9种雌激素类物质的测定采用内标法结合标准曲线进行定量。

(一)液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析方法的建立

(1)液相色谱条件的优化

本发明选用AB 5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪(美国AB公司)，配岛津30A液相色谱，对9种目标雌激素类物质进行检测。为使各雌激素的色谱峰达到同步分离，得到出峰时间短、分离度好的色谱峰，本发明对流动相、流速、柱温、进样量以及线性梯度洗脱程序进行了优化，其中，色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18(100mm×2mm，1.0μm)型号，流动相为Milli-Q超纯水(A)和乙腈(B)。9种雌激素类物质的梯度洗脱程序见表1。

表1 高效液相色谱串联质谱分析参数

(2)质谱监测条件的优化

质谱采用电喷雾离子源负离子模式(ESI-)和多反应监测模式(MRM)进行检测。利用特征碎片离子达到准确定量，带电母离子在碰撞电压作用下，产生子离子，通过最佳母离子/子离子对来对目标雌激素进行定量。9种雌激素类物质的质谱参数见表2.

表2 9种雌激素类物质的质谱监测参数

(3)定量方法

本发明中，9种雌激素类物质的测定采用内标法结合标准曲线进行定量。配制8组浓度范围为1.0～1000μg·L^-1的9种雌激素类物质的系列混合标准溶液，按3倍稀释得到8组浓度分别为1000μg/L、333.33μg/L、111.11μg/L、37.04μg/L、12.35μg/L、4.12μg/L、1.37μg/L、0.45μg/L。每个浓度混标中均加入100ng的三种内标物，本发明中选用的三种内标物分别是：17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)，己烯雌酚-D8(DES-D8)，4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)，根据结构性质相似的原理，它们分别作为E1、17α-E2、17β-E2、EE2、E3的内标和DES的内标以及BPA、NP、OP的内标。在选定的色谱和质谱条件下进行测定，以目标物和内标物浓度的比值为横坐标，以其峰面积的比值为纵坐标，得到9种雌激素类物质8点拟合校正标准曲线。其线性相关系数(r²)均大于0.997(表3)，表明所建立的线性关系良好。在该方法条件下，以3倍和10倍信噪比(S/N)对应的样品中雌激素浓度为方法检测限(LOD)和定量限(LOQ)，获得目标物的检测限LOD范围为0.20～1.71ng·L^-1，定量限LOQ范围为0.62～5.25ng·L^-1。表明本发明具有较低的检测限和良好的灵敏度，能够适用于水环境中痕量雌激素的测定。

表3 目标化合物的线性关系、检测限和定量限

(二)、加标回收率的计算

针对三种不同水质的水体，量取不同体积的三种水样，按照实例1的预处理步骤和实例2的固相萃取富集方法对9种雌激素进行加标回收率实验，自来水和河水水样加标量均为100ng，畜禽场污水水样加标量为500ng。每种水样均设置3个平行样，3个空白样，按照实例3的仪器检测方法对加标回收率进行测定，结果见图1。加标回收率的计算公式如下：

式中：R为加标回收率，％；

C₀为加入混合标准溶液的浓度，mg/L；

V₀为加入混合标准溶液的体积，uL；

C₁为加标样品的检测浓度，μg/L；

V₁为加标样品进样前的定容体积，mL；

C₂为未加标样品的检测浓度，μg/L；

V₂为未加标样品进样前的定容体积，mL；

由图1可知，三种水样中目标物的回收率范围分别为74.5％-106.2％、67.8％-98.4％和58.3％-103.3％，相对标准偏差(RSD)分别小于10.5％、10.3％和13.7％，所建立的方法满足回收率控制限要求。三种水样在相同的实验方法下出现的回收率存在差异，表明水样存在基质干扰效应，而使用内标法定量可以对检测结果进行校正，能够在一定程度上降低基质干扰带来的影响。故本发明具有良好的准确度。

实施例2-3：实际环境样品测定

9种雌激素类物质在两种不同实际水体中的浓度的测定

采集上海市某畜禽场周边河流地表水样和某奶牛场污水出水，先采用实施例1步骤一的方法进行预处理，再采用实施例1步骤二的方法进行固相萃取富集净化前处理，之后采用实施例1步骤三所建立的检测方法对样品的实际浓度进行检测分析，以考察本发明实施例1步骤三所建立的检测方法的适用性。

实际检测所得两种水样中9种雌激素类物质含量如下表表4所示。实验结果表明，本发明的方法可以应用到常规地表水和畜禽场污水中雌激素含量的测定，具有良好的适用性。

表4 两种水样中9种雌激素类物质的检测含量

注：“ND”表示未检出，数据为平均值±标准偏差。n＝3

Claims (10)

1.一种固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中9种雌激素类物质的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)水样预处理

采集一定体积水样，过滤除去细小颗粒状悬浮物，加酸调节水样pH至3-4，固相萃取前加入内标物指示回收率；

(2)固相萃取前处理：富集净化过程

先后用甲醇和纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱，富集；再用纯水和低浓度的甲醇水溶液淋洗，并在真空条件下抽干固相萃取小柱；之后，再用甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹至近干，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；

(3)液相色谱串联质谱法测定9种雌激素类物质的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测水体中9种雌激素类物质的含量；所述的9种雌激素类物质分别是：雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚、双酚A、壬基酚和辛基酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，固相萃取前分别加入17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，固相萃取前分别加入100ng/L的17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采集水样的体积：自来水和河水分别为1L；而畜禽场污水为0.1L，离心去除大颗粒悬浮物后，用Mliil-Q超纯水稀释到1L；过滤水样使用的过滤膜为Whatman GF/F系列孔径为0.45um的玻璃纤维滤膜；使用稀盐酸调节水样pH至3-4。

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所用的固相萃取柱为Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱；活化固相萃取柱所用的甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，水样过柱流速为3-6mL/min；淋洗萃取柱所用的纯水和低浓度甲醇水溶液用量各为萃取柱体积的1-2倍；淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇水溶液；淋洗后的抽干时间为15-30min；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；洗脱萃取柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。

7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇是体积浓度为5％的甲醇水溶液；得到的残渣用甲醇-水体积比为7:3的甲醇水溶液重新溶解，定容到1mL，超声10-15min，用孔径在0.22um以下的滤膜过滤，待进样测定。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对9种目标雌激素类物质进行检测；色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号100mm×2mm，1.0μm；流动相A为Milli-Q超纯水，流动相B为乙腈。

9.根据权利要求1、2或3所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量5μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min^-1；流动相A为Milli-Q超纯水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0-3.0min，30％B；3.0-4.0min，30％B-90％B；4.0-7.0min，90％B；7.0-8.0min，90％B-30％B；8.0-10.0min，30％B。

10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。