CN103336080A - 一种同时检测水中四环素类抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

一种水中痕量四环素类抗生素的检测方法，其步骤包括：水样过滤除去悬浮物，调节水样pH为2-4；依次利用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液、超纯水活化HLB固相萃取柱，取步骤1中的水样过柱，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物；定量检测痕量四环素类抗生素的浓度。本发明水样预处理环境友好、易于操作、富集倍数高，且重现性好。此法具有快速、准确、灵敏度高、适用范围广等优点。

Description

一种同时检测水中四环素类抗生素的方法

技术领域

本发明属于水环境污染物的检测技术领域，具体地涉及一种水体中同时检测痕量四环素类抗生素的检测方法，更具体地是针对地表水(河水)中痕量四环素、土霉素、金霉素的检测方法。

背景技术

四环素类抗生素包括土霉素(OTC)、四环素(TC)和金霉素(CTC)等，属广普类抗生素药物，由于其具有良好的杀菌或抑菌作用而广泛用了防治动物和水产品的疾病感染。四环素类抗生素类物质低剂量使用能够促进畜禽的生长，高剂量使用能够起到治疗疾病的作用，因此在畜禽养殖中得到了广泛的应用。四环素类抗生素作为人畜共用的广谱性抗生素，在世界范围内使用量巨大。近年来，随着养殖者们对畜禽养殖的经济利益追求和畜禽耐药性的增加，抗生素类物质的使用剂量不断提高，甚至以不合理的高剂量使用。然而，滥用抗生素的不良影响和对人类的危害显现越来越严重的趋势，并逐渐成为人们普遍关注的一个社会热点问题。人畜服用四环素类药物后大部分以原形药物排出，随着粪便或其他途径进入环境。四环素类抗生素有水溶性较好，在环境中不易生物降解等特点，随着污水排放或地表径流进入地表水使其容易在水环境中储存和蓄积，是环境中主要抗生素污染源。由于其含量极低，检测难，因此，需要寻求简便、快速、准确检测水体中四环素类抗生素的检测方法，才能满足日趋严格的残留限量要求。

四环素类抗生素的残留检测方法有很多，如微生物法、酶联免疫法、紫外分光光度法、荧光光度法和薄层色谱法(TLC)等，其中微生物法和酶联免疫法存在特异性差，耗时长及操作繁琐等缺点，而光度法和TLC法的测量灵敏度难以达到要求。高效液相色谱-串联质谱在定量分析时可以根据特征离子和由此特征离子断裂产生的特征碎片作为某一目标化合物的指纹，将它从复杂机制的混合物样品中筛选出来进行定量，保证了检测的准确度和精确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水中痕量四环素类抗生素的检测方法，其步骤包括：

1)水样的预处理

水样过滤除去悬浮物，调节水样pH为2-4；

(2)浓缩富集

依次利用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液、超纯水活化HLB固相萃取柱，取步骤1中的水样过柱，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物；

(3)定量检测痕量四环素类抗生素的浓度；

所述的四环素类抗生素为土霉素、四环素和金霉素。

所述的检测方法，其中，步骤1中水样过滤是用0.47μm的GF/F滤膜。

所述的检测方法，其中，步骤1中是加入盐酸或硫酸调节水样pH。

所述的检测方法，其中，步骤2中甲酸水溶液含有5mmol/L的乙酸铵。

所述的检测方法，其中，步骤2中的水样过柱控制流速小于1mL/min。

所述的检测方法，其中，步骤2中洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。

所述的检测方法，其中，步骤2中的洗脱液为甲醇溶液。

所述的检测方法，其中，步骤3是采用液相色谱-串联质谱法检测四环素类抗生素的浓度，具体地是采用3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪定量检测，其中：色谱柱ZORBAX Eclipse XDB C₁₈，4.6mm×150mm×5μm；3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪质谱条件如下：电离方式：ES(+)，离子喷射电压：5500V，锥孔电压：34V，源温度：580℃。

本发明的有益效果是采用高效液相色谱-串联质谱联用对三种药物同时进行定量测定，操作简单易行，分析快速，一个样品仅需5min左右。对目标化合物的选择性强，定量精确，灵敏度高。尤其是一种环境友好、易于操作、富集倍数高、重现性好、能够快速同时分析水体中多种药物的方法。

附图说明

图1为本发明100ng/mL的三种四环素类抗生素混合标准品溶液的离子流图。

图2为四环素定量子离子标准曲线。

图3为土霉素定量子离子标准曲线。

图4为金霉素定量子离子标准曲线。

具体实施方式

本发明采用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法实现对地表水中三种四环素类抗生素(四环素、土霉素和金霉素)进行检测，与传统检测方法相比，实现了选择性好、灵敏度高、操作简单、分析时间短等特点。

本发明的的检测方法如下：

(1)水样预处理

水样品1.0L用0.47μm的GF/F滤膜过滤除去悬浮物，加入少量盐酸调节水样pH为3.0左右。

(2)浓缩富集

依次利用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇、6mL含5mmol/L乙酸铵的0.1％(m/v)甲酸水溶液、15-20mL超纯水活化Waters公司的HLB(500mg，6cc)固相萃取柱，控制流速小于1mL/min；富集完成后，将小柱在氮气保护下干燥20min，利用10mL色谱纯甲醇溶液洗脱HLB柱，控制流速小于1mL/min，洗脱液收集于10mL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400μL色谱纯乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测；

(3)利用3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪定量检测三种四环素类抗生素的浓度。

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C₁₈，4.6mm×150mm×5μm；

3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪质谱条件如下：

电离方式：ES(+)，离子喷射电压：5500V，锥孔电压：34V，源温度：580℃，采集方式：多反应监测(MRM)：

其中，*表示为定量离子。

(4)绘制标准曲线，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：用分析天平精确称量适量四环素、土霉素、金霉素标准品(Dr.E)用乙腈∶水＝1∶1(v∶v)溶解标准品，配制成浓度为1mg/mL的单标贮备液。然后用纯乙腈将储备液稀释成系列浓度的混合标准溶液，转移至进样瓶中，按上述条件用高效液相-串联质谱进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于测定样品中分析物的量。

(5)样品的测定及回收率计算

采集待测水样，按步骤1和2对水样进行预处理和浓缩富集，再按步骤3进行液相色谱-串联质谱检测，并带入步骤4的标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中3种四环素类抗生素的浓度。利用下式计算回收率：

$R=\frac{C_2\×V_2-C_1\×V_1}{C_s\×V_s}\×100\%$

R-回收率，％；

C₂-添加标准溶液水样的四环素类抗生素的浓度，μg/L；

C₁-未添加标准溶液水样四环素类抗生素的浓度，μg/L；

C_s-加入标准溶液的浓度，μg/L；

V₂-添加标准溶液水样的体积，L；

V₁-未添加标准溶液水样，L；

V_s-添加标准溶液的体积，L。

所述的3种药物为：。

步骤(1)中，所述的酸为硫酸或盐酸。

步骤(2)中，富集完成后，将小柱在氮气保护下干燥20min。

步骤(2)中，所述的洗脱液所述的洗脱液为色谱纯甲醇溶液。

下面结合实施例和附图对本发明所述的水环境中三种四环素类抗生素浓度的检测方法予以说明。

实施例1：回收率实验结果

(1)取1000ml超纯水于棕色玻璃瓶中，每瓶水样加入1ml 100μg/L三种四环素类抗生素混合标准储备液，混匀后加入少量盐酸调节水样pH为3.0左右。

(2)浓缩富集

依次利用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇、6mL含5mmol/L乙酸铵的0.1％(m/v)甲酸水溶液、15-20mL超纯水活化Waters公司的HLB(500mg，6cc)固相萃取柱，控制流速小于1mL/min；富集完成后，将小柱在氮气保护下干燥20min，利用10mL色谱纯甲醇溶液洗脱HLB柱，控制流速小于1mL/min，洗脱液收集于10mL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400μL色谱纯乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测；

(3)利用3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪定量检测三种四环素类抗生素的浓度。

图1为本实施例的三种四环素类抗生素混合标准品溶液的离子流图。

外标法标准曲线的绘制：用纯乙腈将储备液稀释成10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L系列浓度的三种四环素类抗生素混合标准溶液，转移至进样瓶中，用高效液相-串联质谱进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线，图2为四环素定量子离子标准曲线，图3为土霉素定量子离子标准曲线，图4为金霉素定量子离子标准曲线。

将加标超纯水结果带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种磺胺类抗生素的浓度。计算回收率，结果如表1。

实施例2：北京奥运公园水样加标回收结果

取1000ml北京奥运公园河水水样于棕色玻璃瓶中，按照实施例1中的方法进行加标实验，同时取1000ml河水水样不加标，作为空白对照。

将加标后水样的结果带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种四环素类抗生素的浓度。计算回收率，结果如表2。

实施例3：河北石家庄汪洋沟实际水样测定结果。

1000mL子牙河汪洋沟(37°35′36″N；114°25′15″E)的水样，经玻璃纤维滤膜(Whatman，0.45μm)进行负压抽滤，滤液经事先用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇、6mL含5mmol/L乙酸铵的0.1％(m/v)甲酸水溶液、15-20mL超纯水活化HLB小柱，控制流速在2～5mL/min。富集结束后真空抽干1min，10mL纯甲醇溶液洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL尖底玻璃比色管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400μL色谱纯乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测。

利用高效液相色谱串联质谱测定上述待测样品中三种四环素类抗生素的浓度。计算结果得到，检出水体检出三种抗生素即四环素6.92ng/L；土霉素40.40ng/L；金霉素未检出。

表1

表2

Claims (9)

1.一种水中痕量四环素类抗生素的检测方法，其步骤包括：

1)水样的预处理

水样过滤除去悬浮物，调节水样pH为2-4；

(2)浓缩富集

依次利用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液、超纯水活化HLB固相萃取柱，取步骤1中的水样过柱，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物；

(3)定量检测痕量四环素类抗生素的浓度；

所述的四环素类抗生素为土霉素、四环素和金霉素。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1中水样过滤是用0.47μm的GF/F滤膜。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1中是加入盐酸或硫酸调节水样pH。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中甲酸水溶液含有5mmol/L的乙酸铵。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中的水样过柱控制流速小于1mL/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中的洗脱液为甲醇溶液。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤3是采用液相色谱-串联质谱法检测四环素类抗生素的浓度。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其中，是采用3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪定量检测，其中：

色谱柱ZORBAX Eclipse XDB C₁₈，4.6mm×150mm×5μm；

3200QTrap型液相色谱-串联质谱仪质谱条件如下：

电离方式：ES(+)，离子喷射电压：5500V，锥孔电压：34V，源温度：580℃。

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