CN103278587A - 一种分离富集水环境中三种头孢类抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

一种分离富集水环境中头孢西丁、头孢拉定和头孢哌酮三种头孢类抗生素的方法，包括如下步骤：用酸将水样pH调至2-4，过滤，得到预处理后的水样；依次用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB固相萃取柱，最后加超纯水保持HLB固相萃取柱中树脂处于活化状态，取水样过柱；富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测；定量检测三种头孢类抗生素的浓度。本发明水样预处理环境友好、易于操作、富集倍数高，使用适当仪器可以满足快速准确地分析水环境中三种痕量头孢类抗生素的要求。

Description

一种分离富集水环境中三种头孢类抗生素的方法

技术领域

本发明涉及一种水环境中痕量头孢类抗生素的检测前处理方法，具体地说是一种同时分离富集地表水和城市污水中三种痕量的头孢类抗生素(头孢西丁、头孢拉定和头孢哌酮)的方法。 

背景技术

头孢类抗生素(Cephalosporins)是以冠头孢菌培养得到的天然头孢菌素C作为原料，经半合成改造其侧链而得到的一类抗生素。头孢类抗生素与青霉素相比具有抗菌谱较广，耐青霉素酶，疗效高、毒性低，过敏反应少等优点，在抗感染治疗中占有十分重要的地位。头孢菌素已从第一代发展到第四代，其抗菌范围和抗菌活性也不断扩大和增强。 

据调查，近年来，我国医院中头孢类抗生素代替青霉素类抗生素，使用量占所有抗菌药的比例已超过45％，国内头孢类抗生素的增长速度达到30％左右，已经超过医药产品平均增长速度。在目前医院销售排名前20位药品中，头孢类抗生素及各类复合抗生素占一半以上。头孢类抗生素的滥用产生了很多耐药性致病菌，如绿脓杆菌对阿莫西林，头孢呋辛钠等8种抗生素的耐药性达100％；肺炎克雷伯菌对头孢呋辛钠、头孢他啶等16种抗生素的耐药性高达52％～100％。而耐药菌的产生，使难治性感染越来越多 

地表水和城市污水中的抗生素类药物残留主要来自于医院、养殖场和制药企业等废水的排放。研究结果表明，环境水样中的头孢类抗生素含量甚微，仅为ng/L或μg/L级。因此，检测水环境中痕量头孢类抗生素要求水样的预处理方法具有较高的富集倍数和较好的重复性；同时，预处理方法应该满足操作简单，耗时较少，使用药品环境友好，使用量少等要求。环境水样中提取抗生素的方法较多，包括液液萃取、冻干法、固相萃取、固相微萃取和分子印迹技术等。其中固相萃取技术由于其操作简便，处理样品量大，富集效率高，外来污染少，可重复性强，且可应用于自动装置而 成为富集抗生素等微污染物首选方式。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离富集水环境中三种头孢类抗生素的方法。 

为实现上述目的，本发明提供的分离富集水环境中三种头孢类抗生素的方法，包括如下步骤： 

(1)水样的预处理 

用酸将水样pH调至2-4，过滤，得到预处理后的水样； 

(2)分离富集 

依次用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB固相萃取柱，最后加超纯水保持HLB固相萃取柱中树脂处于活化状态，取水样过柱； 

富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测； 

(3)定量检测三种头孢类抗生素的浓度； 

所述三种头孢类抗生素为：头孢西丁、头孢拉定和头孢哌酮。 

所述的检测方法，其中，步骤1中水样过滤是用0.47μm的GF/F滤膜。 

所述的检测方法，其中，步骤1中是加入盐酸或硫酸调节水样pH。 

所述的检测方法，其中，步骤2中甲酸水溶液含有体积比0.1％的乙酸铵。 

所述的检测方法，其中，步骤2中的水样过柱控制流速为3.0-5.0mL/min。 

所述的检测方法，其中，步骤2中洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。 

所述的检测方法，其中，步骤2中的洗脱液为含有体积比1％甲酸的甲醇溶液。 

所述的检测方法，其中，步骤3是采用液相色谱-串联质谱法检测三种头孢类抗生素的浓度。 

本发明采用高效液相色谱-串联质谱联用对水体中三种头孢类抗生素同时进行定量测定，具有以下优点： 

1)该方法处理水样过程所用的试剂低毒，使用量少，环境友好。 

2)该方法对水样的富集倍数高达2500倍，同时富集效率较高，回收率在69.0％～100.4％之间。 

3)该方法操作较为简单，可重复性强，同一批样品的相对标准偏差低于5％，满足预处理方法要求。 

4)该方法能够同时富集同一类抗生素的多种药物适用范围较广，使用现代分析仪器检测用时较少，检测限低，线性范围宽，从10μg/L-1000μg/L，准确度较高，样品检测效率高。 

附图说明

图1为本发明100μg/L的三种头孢类抗生素混合标准品溶液的离子流图，出峰顺序为头孢西丁4.32min；头孢拉定4.45min头孢哌酮5.64min。 

图2为头孢西丁定量子离子标准曲线。 

图3为头孢拉定定量子离子标准曲线。 

图4为头孢哌酮定量子离子标准曲线。 

具体实施方式

本发明采用固相萃取法分离富集目标抗生素，最后使用高效液相-串联质谱对水环境样品中痕量头孢类抗生素浓度进行测定，验证该方法的富集分离效率，检测一个样品仅需5min左右，头孢类抗生素的检测限能够达到1μg/L，回收率在69.0％～100.4％之间，相对标准偏差低于5％，满足环境样品检测的要求。 

本发明包括如下步骤： 

(1)水样的预处理 

用酸将水样pH调至3.0左右，利用GF/F(Whatman，0.7μm)玻璃纤维滤膜过滤，得到预处理后的水样； 

(2)分离富集 

依次利用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇，6mL5mM乙酸铵 0.1％甲酸水溶液活化HLB(Waters，500mg，6cc)固相萃取柱，最后加5mL超纯水保持小柱中树脂处于活化状态，取1000mL水样过柱，控制流速3.0～5.0mL/min； 

富集完成后，将小柱在氮气保护下干燥20min，再利用10mL洗脱液洗脱HLB柱，控制流速小于1.0mL/min，洗脱液收集于10mL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400uL乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测； 

(3)根据实际水样目标抗生素的浓度选择适当方法对三种头孢类抗生素进行定量。 

为了满足水环境中抗生素残留的浓度范围，本实验利用高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪联用对三种头孢类抗生素进行定量，标线的范围为10ug/L-1000ug/L。 

外标法标准曲线的绘制：用分析天平精确称量适量头孢西丁、头孢拉定和头孢哌酮标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)用乙腈∶水＝1∶1(v∶v)溶解标准品，配制成浓度为1g/L的单标贮备液。然后用纯乙腈将储备液稀释成系列浓度的混合标准溶液，转移至进样瓶中，按上述条件用高效液相-串联质谱进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于测定样品中分析物的量。 

(4)样品测定结果和回收率计算 

采集待测水样，按步骤(1)和(2)对水样进行预处理和浓缩富集，再按步骤(3)进行液相色谱-串联质谱检测，并带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种头孢类抗生素的浓度。利用下式计算回收率： 

$R=\frac{C_2\×V_2-C_1\×V_1}{C_s\×V_s}\×100\%$

R-回收率，％； 

C₂-添加标准溶液水样的头孢类抗生素的浓度，μg/L； 

C₁-未添加标准溶液水样头孢类抗生素的浓度，μg/L； 

C_s-加入标准溶液的浓度，μg/L； 

V₂-添加标准溶液水样的体积，L； 

V₁-未添加标准溶液水样，L； 

V_s-添加标准溶液的体积，L。 

所述的三种头孢类抗生素为：头孢西丁、头孢拉定和头孢哌酮。 

下面结合附图和最佳实施例对本发明所述的水环境中三种头孢类抗生素浓度的检测方法予以说明。 

实施例1：回收率实验结果 

取1000ml超纯水于棕色玻璃瓶中，每瓶水样加入1ml100μg/L三种头孢类抗生素混合标准储备液，混匀后用酸将水样pH调至3.0左右，依次利用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇，6mL5mM乙酸铵0.1％甲酸水溶液活化HLB(Waters，500mg，6cc)固相萃取柱，最后加5mL超纯水保持小柱中树脂处于活化状态，取1000mL水样过柱，控制流速3.0～5.0mL/min；富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥20min，再利用10mL洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，控制流速小于1.0mL/min，洗脱液收集于10mL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400uL乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测； 

(3)用高效液相色谱-串联质谱联用测定三种头孢类抗生素浓度。图1为本实施例的三种头孢类抗生素混合标准品溶液的离子流图，出峰顺序为头孢西丁4.32min；头孢拉定4.45min头孢哌酮5.64min。 

外标法标准曲线的绘制：用纯乙腈将储备液稀释成10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L系列浓度的三种头孢类抗生素混合标准溶液，转移至进样瓶中，用高效液相-串联质谱进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线。图2为头孢西丁定量子离子标准曲线，图3为头孢拉定定量子离子标准曲线，图4为头孢哌酮定量子离子标准曲线。 

将超纯水结果带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种头孢类抗生素的浓度。计算回收率，结果如表1。 

实施例2北京奥运公园水样加标回收结果。 

取1000ml北京奥运公园河水水样于棕色玻璃瓶中，按照实施例1中的方法进行加标实验，同时取1000ml河水水样不加标，作为空白对照。 

将加标后水样的结果带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水 样中三种头孢类抗生素的浓度。计算回收率，结果如表2。 

实施例3：河北石家庄汪洋沟实际水样测定结果。 

用棕色玻璃瓶采集1000ml河北石家庄汪洋沟水样，加入大约3mL4M的盐酸调节pH到3.0左右，保存在4℃以下运回实验室。用GF/F(Whatman，0.7μm)玻璃纤维滤膜过滤，按步骤(2)～(3)对水样进行浓缩富集，再按步骤(4)进行液相色谱-串联质谱检测，并带入标准曲线方程中，通过计算最终得到实际水样中三种头孢类抗生素的浓度。其中头孢西丁和头孢拉定可能在汪洋沟中有残留，检出范围分别为9.8ng/L～14.0ng/L和30.5ng/L～74.6ng/L，头孢哌酮几乎没有残留。结果如表3。 

表1 

表2 

表3 

Nd＝not detect。 

Claims (8)

1.一种分离富集水环境中三种头孢类抗生素的方法，包括如下步骤：

(1)水样的预处理

用酸将水样pH调至2-4，过滤，得到预处理后的水样；

(2)分离富集

依次用丙酮、甲醇、含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB固相萃取柱，最后加超纯水保持HLB固相萃取柱中树脂处于活化状态，取水样过柱；

富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，再用洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测；

(3)定量检测三种头孢类抗生素的浓度；

所述三种头孢类抗生素为：头孢西丁、头孢拉定和头孢哌酮。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1中水样过滤是用0.47μm的GF/F滤膜。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1中是加入盐酸或硫酸调节水样pH。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中甲酸水溶液含有体积比0.1％的乙酸铵。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中的水样过柱控制流速为3.0-5.0mL/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中的洗脱液为含有体积比1％甲酸的甲醇溶液。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤3是采用液相色谱-串联质谱法检测三种头孢类抗生素的浓度。

Images