CN101566575B - 一种检测2-酮基-l-古龙酸中蛋白质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本专利涉及一种2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析方法，采用优化的考马斯亮蓝定量蛋白法(Bradford法)，通过配制磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白质标准溶液、考马斯亮蓝G-250染色剂，在牛血清蛋白质标准溶液中加入考马斯亮蓝G-250染色剂，根据考马斯亮蓝与蛋白质结合后的吸光度增加值绘制标准曲线，然后取2-酮基-L-古龙酸加入考马斯亮蓝试剂，根据吸光度增加值与蛋白质浓度标准曲线斜率计算出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。该分析方法简便、灵敏，稳定性好，准确率高，重现性好，对检测设备要求低，非常适宜于工业生产中2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析检测。

Description

一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法

一、技术领域；

本发明涉及一种化学分析方法，特别是一种运用考马斯亮蓝比色法测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析方法。

二、背景技术；

维生素C又名L-抗坏血酸，是人体营养必需的维生素，用途非常广泛，常被用于食品、饲料及化妆品中，在医药和临床上亦有广泛应用，在国际医药贸易中长期占十分重要的地位。其主要的生产方法是莱氏法和两步发酵法。两步发酵法是我国首创，它是以生物氧化过程代替莱氏路线的部分化学合成过程，进而合成维生素C。

两步发酵法是以D-山梨醇为原料，经黑醋菌和假单孢菌两步发酵得到维生素C的重要中间体2-酮基-L-古龙酸钠发酵液。发酵液的提取工艺是维生素C生产行业中较为重视的问题，两步发酵后，发酵液的含量低，且残留有菌丝体、蛋白质和悬浮微粒等，其中蛋白质的存在对分离提纯带来了困难，并严重影响到2-酮基-L-古龙酸干品质量，对后续维生素C转化工艺也带来了严重影响。过去从来没有2-酮基-L-古龙酸蛋白质含量的测定方法。

生产中除蛋白质的方法有絮凝法、超滤膜、陶瓷膜，但是这些方法截流蛋白如何，由于没有合适检测蛋白的方法，一时无法客观评价，因为没有2-酮基-L-古龙酸蛋白质含量的测定方法，所以在生产实践中几乎只能完全凭借经验处理。因此，建立科学、准确、方便、快速的一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，对保证和指导正常生产具有重大的意义。

目前常用的几种经典的蛋白质的定量检测方法有凯氏定氮法、双缩脲法和紫外吸收法。凯氏定氮法是目前有机化合物含氮量常用的方法，但此法要求特制玻璃仪器，操作时间长、复杂，产生毒气；双缩脲法蛋白检测迅速，主要缺点灵敏度差；紫外吸收法不适于有色物质的检测。

近年出现了BCA法和考马斯亮蓝比色法，BCA法检测灵敏度很高，但是受杂质影响大，主要影响杂质包括具有还原性的醇和糖。考马斯亮蓝比色法检测过程简单、迅速，适于检测微量蛋白含量。

生产中的2-酮基-L-古龙酸发黄，溶液颜色很难处理掉，蛋白含量微量，干扰物质多，包括含氮物质尿素、还原性的山梨醇、山梨糖，并且2-酮基-L-古龙酸本身也具有还原性。针对2-酮基-L-古龙酸上述特征，选用考马斯亮蓝法检测2-酮基-L-古龙酸中的蛋白含量，并对检测条件进行优化。

三、发明内容；

本发明提供一种检测方法，其目的在于解决目前无法对2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量进行检测方面所存在的问题。

一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)配制磷酸盐缓冲液(pH7.0)：取磷酸二氢钾加氢氧化钠溶液配置pH为7.0的磷酸盐缓冲液，用水稀释至100m；

(2)配制0.1mg/mL牛血清蛋白质标准溶液：称取牛血清蛋白，用少量蒸馏水溶解定容至100mL，得到1mg/mL蛋白质溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步骤(1)的磷酸盐缓冲液，去离子水定容，即得0.1mg/mL蛋白质标准液，冰箱中保存，待用；

(3)配制考马斯亮蓝G-250染色剂，0.1g考马斯亮蓝G-250，50ml 95％乙醇，100ml 85％磷酸，用水定容至1L；冰箱中保存，待用；

(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08.、0.1mg/ml的牛血清蛋白质标准溶液，分别移取1ml的牛血清蛋白质标准溶液至5支试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250染色剂，制作595nm处考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后吸光度增加值(ΔA₍₅₉₅₎)与蛋白质浓度(c，mg/mL)关系标准曲线；

(5)供试品溶液的配制：

①2-酮基-L-古龙酸干品：称取5g 2-酮基-L-古龙酸干品，用去离子水将其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml 20％KOH稀碱溶液和10mlpH为7的缓冲溶液，调节供试品pH，去离子水定容；

②2-酮基-L-古龙酸钠醪液：2000r/min离心20min，移取上清液2ml至试管中，然后加入2ml40％KOH稀碱溶液，沸水中煮30min，去离子水将其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml pH为7的缓冲溶液，调节供试品pH，去离子水定容；

(6)测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量：

分别移取1ml去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5ml去离子水，120min内分别测定三支试管中的溶液和去离子水在595nm处吸光度；吸光度的增加量ΔA₍₅₉₅₎＝A₂-A₁-A₃+A₀，其中A₀为去离子水的吸光度，A₁为1ml去离子水和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度，A₂为1ml供试品和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度，A₃为1ml供试品和5ml去离子水的吸光度；根据吸光度增加值(ΔA₍₅₉₅₎)与蛋白质浓度(c，mg/mL)标准曲线斜率得出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。

该检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，适用于2-酮基-L-古龙酸醪液到2-酮基-L-古龙酸干品的整个过程中的产品。

在上述步骤(3)所说的考马斯亮蓝G-250染色剂含有乙醇体积百分浓度为4.75％，磷酸体积百分浓度为8.5％，考马斯亮蓝G-250质量百分浓度为0.1mg/mL。

在上述步骤(4)所说的595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线的绘制，每配制一次考马斯亮蓝G-250染色剂，就需要重新绘制595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线。

在上述步骤(5)稀碱溶液指可溶的氢氧化物类物质；稀碱的配制原则在于配制后的溶液应该是均匀混合物，常温下长时间存放无溶质析出。

在上述步骤(5)供试品溶液配置中，pH调节范围优化为3.5～7，0＜RSD＜3％。

在上述步骤(6)中所说的595nm处吸光度的测量时间优化为加入考马斯亮蓝染色剂后30～60min内完成，0＜RSD＜3％。

RSD为分析过程中的相对标准偏差。

本发明的优越性在于：

1、该发明可应用于检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量；

2、本发明包括595nm处吸收度增加值与蛋白量关系标准曲线的绘制和待测样品检测两部分，该过程中所配制的考马斯亮蓝溶液可一次大量配制多次使用，同一批次的考马斯亮蓝溶液可以只做一次595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线，这样就降低了劳动强度，简化了工作步骤；

3、该发明对计算公式进行了完善，对供试品溶液pH范围和检测时间进行了优化；

4、克服了其他蛋白质含量检测方法的缺点，例如数据重现性差，结果误差大，操作繁琐，受其他组分影响大等；

5、本发明方法简便、灵敏，酸性范围广，时间稳定性好，准确率高，重现性好，对检测设备要求低，适宜于工业生产上2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析检测。

四、附图说明；

图1、为标准蛋白质含量与吸光度增值关系标准曲线；

五、具体实施方式；

本发明采用优化的考马斯亮蓝法检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量，本发明具体包括以下步骤：

1、磷酸盐缓冲液(pH7.0)：

取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。

2、配制牛血清蛋白标准溶液：

精确称取牛血清蛋白100mg，用少量蒸馏水溶解定容至100mL，得到1mg/mL蛋白质溶液，移取10mL此蛋白溶液至100mL容量瓶，再加入10mlpH为7的缓冲液，去离子水定容，即得0.1mg/mL蛋白质标准液。冰箱中保存，待用。

3、配制考马斯亮蓝G-250染色剂：

考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95％乙醇中，加入100ml85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7％(W/V)乙醇。冰箱中保存，待用。

4、绘制吸收度增加值与蛋白浓度关系标准曲线：

分别精密移取0.1mg/mL标准蛋白质溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于六支试管中，分别加去离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL，混匀，30～60min内于595nm处测定吸光度值。建立吸光度增加值(ΔA₍₅₉₅₎)与蛋白浓度(c，mg/mL)关系标准曲线。

5、供试品溶液的配制：

(1)2-酮基-L-古龙酸干品：称取5g 2-酮基-L-古龙酸干品，用去离子水将其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml 20％KOH溶液和10mlpH为7的缓冲溶液，去离子水定容。

(2)2-酮基-L-古龙酸钠醪液：2000r/min离心20min，移取上清液2ml至试管中，然后加入2ml40％KOH溶液，水浴加热30min，去离子水将其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml pH为7的缓冲溶液，去离子水定容。

6、测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量：

分别移取1mL去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5mL去离子水，30～60min内测定三支试管中的溶液和去离子水在595nm处吸光度。吸光度的增加量ΔA₍₅₉₅₎＝A₂-A₁-A₃+A₀，其中A₀为去离子水的吸光度，A₁为1mL供试品加入5mL去离子水的吸光度，A₂为1mL供试品加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液在595nm处的吸光度，A₃为1mL去离子水加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度。由下面公式计算出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。

2-酮基-L-古龙酸干品中蛋白质量百分含量为： $\frac{\mathrm{\Δ}{A}_{\left(595\right)}-b}{10\mathrm{km}}\×100\%$

2-酮基-L-古龙酸钠醪液中蛋白浓度为： $\frac{50({\mathrm{\ΔA}}_{\left(595\right)}-b)}{k},(\mathrm{mg}/\mathrm{mL})$

其中：ΔA₍₅₉₅₎——595nm处考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后吸光度增加值；

k——吸光度增加值(L/(g.cm))与蛋白浓度(mg/ml)关系标准曲线斜率；

b——吸光度增加值(L/(g.cm))与蛋白浓度(mg/ml)关系标准曲线截距；

m——所称取的2-酮基-L-古龙酸干品质量，g；

下述实施例中所使用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例一：2-酮基-L-古龙酸钠发酵液中蛋白含量检测；

取生产中的2-酮基-L-古龙酸钠发酵液2000r/min离心20min，移取上清液2ml至试管中，然后加入2ml40％KOH溶液，沸水中煮30min，去离子水将其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml pH为7的缓冲溶液，去离子水定容。

分别移取1mL去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5mL去离子水，于595nm处检测去离子水和试管2吸光度分别为0.037、0.058L/(g.cm)，将试管1吸光度调为0，30～60min内检测试管3的吸光度为0.162L/(g.cm)，通过公式2计算可得2-酮基-L-古龙酸干品中蛋白含量为1.209mg/ml。

实施例二：2-酮基-L-古龙酸钠超滤液中蛋白含量检测

取岗位超滤液20ml至50ml容量瓶中，再加入10ml pH为7的缓冲溶液，去离子水定容。

分别移取1mL去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5mL去离子水，于595nm处检测去离子水和试管2吸光度分别为0.037、0.046L/(g.cm)，将试管1吸光度调为0，30～60min内检测试管3的吸光度为0.205L/(g.cm)，通过计算可得超滤液中蛋白含量为0.089mg/ml。

实施例三：2-酮基-L-古龙酸干品中蛋白含量检测

称取生产中的2-酮基-L-古龙酸干品5g，去离子水溶解后移入100ml容量瓶中，然后加入6.5ml 20％KOH溶液和10mlpH为7的缓冲溶液，去离子水定容。

分别移取1mL去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5mL去离子水，于595nm处检测去离子水和试管2吸光度分别为0.037、0.039L/(g.cm)，将试管1吸光度调为0，30～60min内检测试管3的吸光度为0.115L/(g.cm)，通过公式1计算可得2-酮基-L-古龙酸干品中蛋白含量为0.036％。

实施例四：2-酮基-L-古龙酸母干中蛋白含量检测

称取生产中的2-酮基-L-古龙酸母干5g，去离子水溶解后移入100ml容量瓶中，然后加入6.5ml 20％KOH溶液和10mlpH为7的缓冲溶液，去离子水定容。

分别移取1mL去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5mL去离子水，于595nm处检测去离子水和试管2吸光度分别为0.037、0.052L/(g.cm)，将试管1吸光度调为0，30～60min内检测试管3的吸光度为0.260L/(g.cm)，通过公式1计算可得2-酮基-L-古龙酸母干中蛋白含量为0.092％。

实施例五：2-酮基-L-古龙酸中蛋白回收率

精密移取已配制的2-酮基-L-古龙酸溶液0.5mL，应用本发明所涉的方法测得蛋白质含量为0.0268mg/mL，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4mL蛋白标准溶液(0.1mg/mL)，应用本发明所涉的方法对于2-酮基-L-古龙酸中标准蛋白质回收率及误差分析结果可见下表：

表1  2-酮基-L-古龙酸中蛋白质回收率分析结果

Claims (6)

1.一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)配制磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾加氢氧化钠溶液配置pH为7.0的磷酸盐缓冲液，用水稀释至100ml；

(2)配制0.1mg/ml牛血清蛋白质标准溶液：称取牛血清蛋白，用少量蒸馏水溶解定容至100ml，得到1mg/ml蛋白质溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步骤(1)的磷酸盐缓冲液，去离子水定容，即得0.1mg/mL蛋白质标准液，冰箱中保存，待用；

(3)配制考马斯亮蓝G-250染色剂，0.1g考马斯亮蓝G-250，50ml 95％乙醇，100ml 85％磷酸，用水定容至1L；冰箱中保存，待用；

(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的牛血清蛋白质标准溶液，分别移取1ml的牛血清蛋白质标准溶液至5支试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250染色剂，制作595nm处考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线；

(5)供试品溶液的配制：

①2-酮基-L-古龙酸干品：称取5g 2-酮基-L-古龙酸干品，用去离子水将其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml 20％KOH稀碱溶液和10mlpH为7的缓冲溶液，调节供试品pH，去离子水定容；

②2-酮基-L-古龙酸钠醪液：2000r/min离心20min，移取上清液2ml至试管中，然后加入2ml40％KOH稀碱溶液，沸水中煮30min，去离子水将其洗入100ml 容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml pH为7的缓冲溶液，调节供试品pH，去离子水定容；

(6)测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量：

分别移取1ml去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5ml去离子水，120min内分别测定三支试管中的溶液和去离子水在595nm处吸光度；吸光度的增加量ΔA₍₅₉₅₎＝A₂-A₁-A₃+A₀，其中A₀为去离子水的吸光度，A₁为1ml去离子水和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度，A₂为1ml供试品和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度，A₃为1ml供试品和5ml去离子水的吸光度；根据吸光度增加值与蛋白质浓度标准曲线斜率得出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。

2.一种根据权利要求1所述的检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，该方法用于2-酮基-L-古龙酸醪液到2-酮基-L-古龙酸干品的整个过程中的蛋白质检测。

3.根据权利要求1所述的一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于步骤(4)所述的595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线的绘制，每配制一次考马斯亮蓝G-250染色剂，就需要重新绘制595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线。

4.根据权利要求1所述的一种2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析方法，其特征在于KOH稀碱溶液的配制原则在于配制后的溶液是均匀混合物，常温下长时间存放无溶质析出。

5.根据权利要求1所述的一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于步骤(5)供试品溶液配置中，pH调节范围优化为3.5～7，0＜RSD＜3％。 

6.根据权利要求1所述的一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于步骤(6)中所述的595nm处吸光度的测量时间优化为加入考马斯亮蓝染色剂后30～60min内完成，0＜RSD＜3％。 

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