CN101477038A - 硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及灵芝多糖的测定方法，具体地，涉及用硫酸－苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖的含量。一种硫酸－苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖的方法，先用80～85％的乙醇沉淀，除去单糖，双糖和低聚糖等小分子杂质，再用蒸馏水溶解提取多糖，而后用硫酸－苯酚测定灵芝产品中灵芝多糖含量，具有操作性强、测定结果准确、灵敏度高，重现性好，一般常规实验室即可进行测定等优点。
Description
技术领域
本发明涉及灵芝多糖的测定方法，具体地，涉及用硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖的含量。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。中华传统医学认为，灵芝味甘、性温、无毒、可补心、肝、肺、脾、肾五胀之气，具滋补强壮、固本扶正之功效。现代医学研究也表明，灵芝的主要有效成份是灵芝多糖，具有广泛的药理活性，具排毒、抗放射，提高肝脏、骨髓合成DNA、RNA的能力，抗肿瘤、增强机体免疫等效果。
灵芝多糖广泛存在于灵芝孢子、菌丝体和子实体中，从子实体和菌丝体中提取灵芝多糖已有许多报道，如公开号为CN1786033A(发明名称：灵芝多糖的制备方法)公开了一种从灵芝子实体中提取灵芝多糖的方法，该法将灵芝子实体经过前处理、微滤、冷冻分离、膜分离、膜浓缩、减压浓缩、减压干燥，得到灵芝粗多糖产品为纯天然成份，高营养，疗效好，所采用工艺环保、高效、节能。公开号为CN1307314(发明名称：酶解制备灵芝多糖的方法)巧妙地利用菌丝体自身酶系统和外加的混合酶系统在适宜的条件下对灵芝真菌发酵液进行酶解，酶解后得到的灵芝粗多糖中灵芝多糖的含量可达35-60％，灵芝多糖分子量在6000-50000之间的活性灵芝多糖占70-90％。近年来，人们也研究了利用菌丝体发酵产灵芝多糖的方法，如申请号为200810199102.5(发明名称为：一种从发酵液中提取灵芝多糖的方法)揭露了如何利用菌丝体发酵产灵芝多糖及灵芝多糖的提取方法。
随着灵芝多糖提取方法的深入研究，市场上灵芝多糖产品的种类和数量也日益繁多，其产品质量良莠不齐，导致市场混乱。尤其是国家对灵芝多糖产品的质量并无相应的检测标准，借鉴“GB/T15672-1995食用菌总糖含量的测定方法”进行测定，测定的结果为总糖含量，其结果不能准确反应灵芝中含有的活性有效成份灵芝多糖的含量。<<食品功效成份检测方法>>(王光亚主编，北京：中国轻工业出版社，2002.1)揭示了测定保健品功效成份的数种方法，其中“分光光度法测定枸杞子多糖含量”对测定灵芝孢子、子实体和菌丝体中灵芝多糖的含量，具有借鉴意义，然而，却不适用于测定灵芝产品中的灵芝多糖含量。
发明内容
本发明的目的是针对上述测定方法的不足，提供一种硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖的方法，具有可操作性强、测定结果准确、灵敏度高，重现性好，一般常规实验室即可进行测定等优点。
本发明是通过如下技术方案实现的：硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖含量的方法，由以下具体步骤组成：
1)称取m克的待测样品；
2)除去干扰成份：将步骤1)所述待测样品，溶于80～85％的乙醇中，59～61℃加热回流30min，3000～4500r/min离心10min，收集残渣；
3)提取多糖：用蒸馏水溶解上述残渣，并于94～96℃水浴加热回流1.5～2h，冷却后定容至V1毫升，得提取液，混匀，过滤，收集滤液，量取V2毫升滤液，稀释数倍，定容至V3毫升，得待测溶液；
4)硫酸-苯酚法测定灵芝多糖含量：取待测溶液V4毫升，补充蒸馏水至V5毫升，V5为1～5毫升，加入60g/L苯酚溶液1.6毫升，混匀，加入浓硫酸7.5毫升，混匀，室温放置25～30min，以空白试剂溶液做对照，用分光光度计在485nm波长处，测定吸光光度值，根据标准曲线得出待测液中多糖质量ml毫克，而后根据测液中多糖的质量计算出待测样品中多糖的含量。
计算公式如下：
式中，X代表待测样品中水溶性粗多糖含量，单位mg/g；
m1代表根据标准曲线计算出的待测液中的多糖质量，单位mg；
m代表待测样品质量，单位mg；
V1代表待测样品提取液总体积，单位ml；
V2代表所用待测样品提取液体积，单位ml；
V3代表待测液体积，单位ml；
V4代表样品测定所取待测液体积，单位ml；
V5代表所用测定液体积，单位ml。
取步骤2)所述残渣重复步骤2)1～3次。
步骤2)所述加热温度为60℃。
步骤3)所述水浴温度为95℃。
本发明提供的硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖的方法，具有可操作性强、测定结果准确、灵敏度高，重现性好，一般常规实验室即可进行测定等优点。
具体实施方式
以下将结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。
本发明的原理为多糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，单糖迅速脱水生成的糠醛其衍生物，糠醛其衍生物能与苯酚反应，生成一种橙红色化合物，该化合物在10-100mg范围内颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定多糖的含量。本法操作简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
以下将结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。
实施例1
1、除去干扰成份：称取紫芝菌粉5.0083g，5.0061g，5.0044g，5.0054g，溶于100ml的80％的乙醇中，60℃水浴加热回流30min，4500r/min离心10min，弃上清，收集残渣。溶于100ml的80％的乙醇中，重复上述步骤2次，以除去单糖、双糖和低聚糖等干扰性成份。
2、提取多糖：用200ml蒸馏水溶解上述残渣，并于95℃水浴加热回流2h，冷却后定容至250毫升(V1毫升)，得提取液，混匀，过滤，收集滤液即为样品溶液，量取10ml(V2毫升)样品溶液，稀释10倍，定容至100ml(V3毫升)，即为待测溶液。
3、硫酸-苯酚法测定灵芝多糖含量：
3.1、绘制标准曲线：
3.1.1、配置溶液
葡萄糖标准储备液：精密称取干燥至恒重的分析纯葡萄糖1.0g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，混匀，即得10.0mg/ml的葡萄糖标准储备液。
葡萄糖标准使用液：吸取1.0ml葡萄糖标准储备液，用蒸馏水稀释并定容至100毫升，混匀，即得浓度为0.10mg/ml的葡萄糖标准使用液。
苯酚溶液：称取分析纯苯酚6.0g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，混匀，即得60g/L苯酚溶液，置于棕色瓶中保存备用。
3.1.2、绘制标准曲线分别取浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准使用液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20ml，补水至2.0ml，加入60g/L苯酚溶液1.6毫升，混匀，加入浓硫酸7.5毫升，混匀，室温放置26min，以空白试剂溶液为对照，用分光光度计在485nm波长处，测定吸光光度值，如表1所示。
表1.葡萄糖浓度在485nm波长处的吸光光度值
| 葡萄糖浓度(单位mg) | 485nm波长处的吸光值A |
| 0.020 | 0.142 |
| 0.040 | 0.260 |
| 0.060 | 0.377 |
| 0.080 | 0.508 |
| 0.100 | 0.636 |
以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y＝-0.001+0.159X，R2＝0.9998。
3.2、测定样品中灵芝多糖的含量：取待测溶液1.0ml(V4毫升)，补充蒸馏水至2.0ml(V5毫升)，加入60g/L苯酚溶液1.6毫升，混匀，加入浓硫酸7.5毫升，混匀，室温放置26min，以空白试剂溶液为对照，用分光光度计在485nm波长处，测定吸光光度值，根据标准曲线得出待测液中多糖质量ml毫克，如表2所示。
表2 待测液中多糖质量和样品中多糖含量
| 样品质量m(单位：克) | 测定吸光值A | 待测液中多糖质量ml(单位：毫克) | 样品多糖含量X(单位：毫克/克) |
| 5.0061 | 0.599 | 0.0942 | 94.12mg/g |
| 5.0057g， | 0.614 | 0.0966 | 96.52mg/g |
| 5.0044g， | 0.628 | 0.0988 | 98.76mg/g |
| 5.0035g | 0.635 | 0.1000 | 99.89mg/g |
3.3计算结果待测液中多糖的质量计算出待测样品中多糖的含量，计算公式如下：
式中，X代表待测样品中水溶性粗多糖含量，单位mg/g；
m1代表根据标准曲线计算出的待测液中的多糖质量，单位mg；
m代表待测样品质量，单位mg；
V1代表待测样品提取液总体积，单位ml；
V2代表所用待测样品提取液体积，单位ml；
V3代表待测液体积，单位ml；
V4代表样品测定所取待测液体积，单位ml；
V5代表所用测定液体积，单位ml。
其结果如表2示。
实施例2
1、除去干扰成份：称取紫芝菌粉5.0061g，5.0057g，5.0044g，5.0035g，溶于100ml的85％的乙醇中，61℃水浴加热回流30min，3000r/min离心10min，弃上清，收集残渣。取残渣溶于100ml的85％的乙醇中，重复上述步骤2次，以除去单糖、双糖和低聚糖等干扰性成份。
2、提取多糖：用200ml蒸馏水溶解上述残渣，并于96℃水浴加热回流1.5h，冷却后定容至250毫升(V1毫升)，得提取液，混匀，过滤，收集滤液即为样品溶液，量取10ml(V2毫升)样品溶液，稀释10倍，定容至100ml(V3毫升)，即为待测溶液。
3、硫酸-苯酚法测定灵芝多糖含量：
3.1、绘制标准曲线：
3.1.1、配置溶液
葡萄糖标准储备液：精密称取干燥至恒重的分析纯葡萄糖1.0g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，混匀，即得10.0mg/ml的葡萄糖标准储备液。
葡萄糖标准使用液：吸取1.0ml葡萄糖标准储备液，用蒸馏水稀释并定容至100毫升，混匀，即得浓度为0.10mg/ml的葡萄糖标准使用液。
苯酚溶液：称取分析纯苯酚6.0g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，混匀，即得60g/L苯酚溶液，置于棕色瓶中保存备用。
3.1.2、绘制标准曲线分别取浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准使用液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20ml，补水至2.0ml，加入60g/L苯酚溶液1.6毫升，混匀，加入浓硫酸7.5毫升，混匀，室温放置30min，以空白试剂溶液为对照，用分光光度计在485nm波长处，测定吸光光度值，如表3所示，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y＝-0.001+0.150X，R2＝0.9998。
表3.葡萄糖浓度在485nm波长处的吸光光度值
| 葡萄糖浓度(单位mg) | 485nm波长处的吸光值A |
| 0.020 | 0.141 |
| 0.040 | 0.275 |
| 0.060 | 0.397 |
| 0.080 | 0.538 |
| 0.100 | 0.675 |
3.2、测定样品中灵芝多糖的含量：取待测溶液1.0ml(V4毫升)，补充蒸馏水至5.0ml(V5毫升)，加入60g/L苯酚溶液1.6毫升，混匀，加入浓硫酸7.5毫升，混匀，室温放置26min，以空白试剂溶液做对照，用分光光度计在485nm波长处，测定吸光光度值，根据标准曲线得出待测液中多糖质量ml毫克，如表4所示。3.3计算结果待测液中多糖的质量计算出待测样品中多糖的含量，计算公式如下：
式中，X代表待测样品中水溶性粗多糖含量，单位mg/g；
m1代表根据标准曲线计算出的待测液中的多糖质量，单位mg；
m代表待测样品质量，单位mg；
V1代表待测样品提取液总体积，单位ml；
V2代表所用待测样品提取液体积，单位ml；
V3代表待测液体积，单位ml；
V4代表样品测定所取待测液体积，单位ml；
V5代表所用测定液体积，单位ml。
其结果如表4示。
表4 待测液中多糖质量和样品中多糖含量
| 样品质量m(单位：克) | 测定吸光值A | 待测液中多糖质量ml(单位：毫克) | 样品多糖含量X(单位：毫克/克) |
| 5.0054g | 0.644 | 0.0956 | 95.5mg/g |
| 5.0053g | 0.626 | 0.0929 | 92.8mg/g |
| 5.0026g | 0.597 | 0.0885 | 88.5mg/g |
| 5.0039g | 0.645 | 0.0958 | 95.7mg/g |
上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。
Claims (4)
1、硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖含量的方法，其特征在于，由以下步骤组成：
1)称取m克的待测样品；
2)除去干扰成份：将步骤1)所述待测样品，溶于80～85％的乙醇中，59～61℃加热回流30min，3000～4500r/min离心10min，收集残渣；
3)提取多糖：用蒸馏水溶解上述残渣，并于94～96℃水浴加热回流1.5～2h，冷却后定容至V1毫升，得提取液，混匀，过滤，收集滤液，量取V2毫升滤液，稀释数倍，定容至V3毫升，得待测溶液；
4)硫酸-苯酚法测定灵芝多糖含量：取待测溶液V4毫升，补充蒸馏水至V5毫升，V5为1～5毫升，加入60g/L苯酚溶液1.6毫升，混匀，加入浓硫酸7.5毫升，混匀，室温放置25～30min，以空白试剂溶液做对照，用分光光度计在485nm波长处，测定吸光光度值，根据标准曲线得出待测液中多糖质量ml毫克，而后根据测液中多糖的质量计算出待测样品中多糖的含量。
2、如权利要求1所述的硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖含量的方法，其特征在于，取步骤2)所述残渣重复步骤2)1～3次。
3、如权利要求1所述的硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖含量的方法，其特征在于，步骤2)所述加热温度为60℃。
4、如权利要求1所述的硫酸-苯酚法测定灵芝产品中灵芝多糖含量的方法，其特征在于，步骤3)所述水浴温度为95℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090708 |