CN113249235A - 一株产β-D-葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母及其应用 - Google Patents

一株产β-D-葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种费比恩毕赤酵母CGJ17(CyberlindnerafabianiiCGJ17)，其特征在于，所述费比恩毕赤酵母CGJ17保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020169。本发明技术中的一株高产β‑D‑葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母，丰富了β‑D‑葡萄糖苷酶产生菌的菌种资源，利用此菌的发酵功能实现了人参、虎杖发酵液功效的提升，生物利用度的提高，该产品可以应用到医药、食品、保健品、护肤品等诸多领域中，同时也为稀有人参皂苷、白藜芦醇等的工业化生产奠定基础，市场开发前景广阔。

Description

一株产β-D-葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株产β-D-葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母及其应用。
背景技术
β-D-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷水解酶、纤维二糖酶、龙胆二糖酶、苦杏仁酶，它可以水解结合于底物末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出葡萄糖和相应配基，常作用于β-D-(1,2)、β-D-(1,3)、β-D-(1,4)、β-D-(1,6)键，是纤维素酶系中一种重要的水解酶。
β-D-葡萄糖苷酶于1837年首次在苦杏仁汁中被发现，经过长期的研究发现，其在自然界中亦广泛分布于植物、微生物、动物体中，它参与生物体的糖代谢，维持生物体的正常生理功能，其中植物来源的β-D-葡萄糖苷酶非常丰富，但活性低、不稳定、产量不高，因此微生物来源成为目前主要的研究对象。
β-D-葡萄糖苷酶应用前景十分广阔，除主要用于降解纤维素以外，还可以应用于酒、茶叶、果汁中起到增香或脱苦的作用；可以制备高活性的苷元产品，例如稀有人参皂苷、大豆异黄酮苷元、白藜芦醇等；可以用于芳香基或烃基糖苷的合成，在医药方面，其浓度还可以作为肠损伤早期诊断的敏感指标；总的来说，β-D-葡萄糖苷酶对于人类的生产和生活具有重大意义。
人参为我国传统名贵中草药，被誉为“百草之王”，有效成分包括人参多糖、人参挥发油、氨基酸和人参皂苷，主要有效成分是人参皂苷。人参皂苷属于四环三萜皂苷，结构上由苷元与糖连接而成，分为原二醇型人参皂苷、原三醇型人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷，其中，Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rf等为含量丰富的天然人参皂苷，Rh1、Rh2、F1、F2、S-Rg3、Rb3、compound K、PPT等为稀有人参皂苷，稀有人参皂苷具有更高的药理活性，且更易被胃肠道吸收。因此，如何提高稀有人参皂苷的含量成为现代研究的热点，有研究表明，人参皂苷的性质和功能主要与苷元结构类型、糖基的数量和位置有关，例如人参皂苷的药理活性与其糖链结构关系如下：四糖苷＜三糖苷＜二糖苷＜苷元。目前，人参皂苷的体外转化方法主要包括物理方法、化学方法和微生物转化法，物理方法主要为加热法，此方法反应条件要求高、副产物多且耗能巨大；化学方法主要是酸碱法，此类方法反应剧烈难以控制，且效率低污染环境；微生物转化法主要包括酶解法和微生物发酵法，其主要原理在于微生物所分泌的β-D-葡萄糖苷酶为主的酶系对人参皂苷进行转化，然而酶法成本高，不稳定易失活不易保存，因此微生物液体发酵是目前工业生产皂苷的主要手段。
虎杖，中药名，为蓼科植物，因其主要有效成分虎杖苷(白藜芦醇以1,4-β-葡萄糖苷键连接一个β-D-葡萄糖构成)是白藜芦醇的前体物质，因此是白藜芦醇的一个重要植物来源。白藜芦醇，又名虎杖苷元，属多酚类物质，最早在红葡萄酒中发现，具有抗癌、抗氧化、抗自由基、抗菌、抗炎、抗过敏、保护心血管、降低血小板聚集、预防和治疗动脉粥样硬化、防衰老等多方面的活性，在医药、保健品、食品和护肤品领域应用前景广泛。因此如何将白藜芦醇从虎杖中高效、快速提取出来具有重要意义。目前常用于白藜芦醇提取的方法有有机溶剂提取法、超声波提取法、微波辅助提取、超临界CO2萃取技术、酶解法等，其中有机溶剂提取法效果最差,酶解法尤其是复合酶的提取效果最好,超声波提取效果次之,超临界CO2萃取技术和微波辅助提取因设备限制,相对研究的较少，又因酶解法反应条件温和、耗能低、产物单一、提取率高、绿色环保，因而是生产白藜芦醇较为适宜的方法。
发明内容
本发明解决的现有技术的问题是：本发明的目的是为了提供一株高产β-D-葡萄糖苷酶的新菌株，该β-D-葡萄糖苷酶具有良好的热稳定性、PH稳定性、乙醇耐受性，利用该菌株进行人参和虎杖的发酵，能够在发酵过程中将人参皂苷转化为稀有人参皂苷，将虎杖苷转化为白藜芦醇，，实现发酵液功效的提升。环境友好，所得的发酵产物具有高含量稀有人参皂苷或白藜芦醇产率高，应用前景广阔。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种费比恩毕赤酵母CGJ17(Cyberlindnera fabianii CGJ17)，其特征在于，所述费比恩毕赤酵母CGJ17(Cyberlindnera fabianii CGJ17)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020169。
本发明还提供了所述的费比恩毕赤酵母CGJ17在产β-D-葡萄糖苷酶中的应用。
本发明还提供了一种发酵生产β-D-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17进行发酵生产。
其中，包括如下步骤：将所述费比恩毕赤酵母CGJ17接种在培养基中进行发酵培养，直至产生得到β-D-葡萄糖苷酶。
优选的，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为15-72h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-48h。
优选的，按重量份计，所述培养基包含以下组分：酵母浸粉0.5-10份，葡萄糖0.5-10份和蛋白胨0.5-10份。
优选的，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-48h。
本发明还提供了一种人参皂苷组合物，其采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对人参进行发酵得到，其包括人参皂苷Rb1，稀有人参皂苷S-Rg3，人参皂苷Rg1，和稀有人参皂苷PPT。
优选的，其中，按质量％计，所述人参皂苷Rb1的转化率为-70.83％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1300％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-71.92％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为1950％～2300％，
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-85.06％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1700％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-78.64％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为2200％％～2300％；
其中所述转化率是通过下面公式(1)计算得到的：
(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％(1)。
本发明还提供了一种人参皂苷组合物的制备方法，其特征在于，采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对人参进行发酵。
优选的，其中，按重量份计，所述培养基包含以下组分：在100份去离子水中，人参根粉0.1-20份，葡萄糖0.5-10份，蔗糖0.5-10份和硫酸铵0.5-10份，
优选的，所述培养基包含以下组分：人参根粉5-15份，葡萄糖5-10份，蔗糖5-10份和硫酸铵5-10份；更优选的，所述费比恩毕赤酵母CGJ17的接种量为2-4％vol。
优选的，其中，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为24-240h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-96。
优选的，其中，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-96h。
优选的，其中所述人参皂苷组合物包括人参皂苷Rb1，稀有人参皂苷S-Rg3，人参皂苷Rg1，和稀有人参皂苷PPT。
优选的，其中，所述人参皂苷Rb1的转化率为-70.83％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1300％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-71.92％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为1950％-2300％；
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-85.06％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1700％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-78.64％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为2200％％～2300％；其中所述转化率是通过下面公式(1)计算得到的：
(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％(1)。
本发明还提供了上述的一种人参皂苷组合物的制备方法得到的人参皂苷组合物。
本发明还提供了一种白藜芦醇的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对虎杖进行发酵。
优选的，其中，按重量份计，所述培养基包含以下组分：在100份去离子水中，虎杖粉0.1-20份，蔗糖0.5-10份，氯化铵0.5-10份和磷酸氢二钾0.01-10份，
优选的，所述培养基包含以下组分：虎杖粉3-10份，蔗糖0.5-5份，氯化铵0.5-5份和磷酸氢二钾0.01-5份；更优选的，所述费比恩毕赤酵母CGJ17的接种量为2-5％vol。
优选的，其中，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为24-240h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-96h。
优选的，其中，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-96h。
优选的，其中，所述白藜芦醇的转化率为91.5-93.55％，优选为，所述白藜芦醇的转化率为92.2-93.5％；
其中所述转化率是转化生成的白藜芦醇的物质的量与反应消耗的虎杖苷的物质的量的百分比。
本发明所取得的有益效果是：本发明技术中的一株高产β-D-葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母，丰富了β-D-葡萄糖苷酶产生菌的菌种资源，利用此菌的发酵功能实现了人参、虎杖发酵液功效的提升，生物利用度的提高，该产品可以应用到医药、食品、保健品、护肤品等诸多领域中，同时也为稀有人参皂苷、白藜芦醇等的工业化生产奠定基础，市场开发前景广阔。
菌株保藏信息
该菌种费比恩毕赤酵母CGJ17(Cyberlindnera fabianii CGJ17)于2020年06月02日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2020169，保藏地址：中国.湖北.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。
附图说明
图1横坐标为紫外分光光度计在400nm条件下的OD值，纵坐标为对-硝基苯酚的浓度绘制得到的标准曲线。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种费比恩毕赤酵母CGJ17(Cyberlindnera fabianiiCGJ17)，该菌株是安琪酵母股份有限公司选育一株费比恩毕赤酵母菌种，该菌株从黄酒酒曲中得到，而且通过光学显微镜观察，该酿酒酵母菌株，呈现椭球形，以出芽方式无性繁殖；在固体培养基平板上28℃培养24h后，为乳白色，不透明，圆形菌落。通过常规形态观察、生理生化试验，然后借助PCR技术通过鉴定26S rDNA D1/D2区基因序列，确定本发明菌株为费比恩毕赤酵母菌株。
该费比恩毕赤酵母菌Cyberlindnera fabianii CGJ17于2020年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学。保藏编号为CCTCCNO：M2020169。
在本发明另一种优选的实施方式中，提供了所述的费比恩毕赤酵母CGJ17在产β-D-葡萄糖苷酶中的应用。
在本发明另一种优选的实施方式中，还提供了一种发酵生产β-D-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17进行发酵生产。
其中，包括如下步骤：将所述费比恩毕赤酵母CGJ17接种在培养基中进行发酵培养，直至产生得到β-D-葡萄糖苷酶。
优选的，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为15-72h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-48h。
优选的，按重量份计，所述培养基包含以下组分：酵母浸粉0.5-10份，葡萄糖0.5-10份和蛋白胨0.5-10份。
优选的，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-48h。
在本发明另一种优选的实施方式中，提供了一种人参皂苷组合物，其采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对人参进行发酵得到，其包括人参皂苷Rb1，稀有人参皂苷S-Rg3，人参皂苷Rg1，和稀有人参皂苷PPT。
优选的，其中，按质量％计，所述人参皂苷Rb1的转化率为-70.83％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1300％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-71.92％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为1950％～2300％，
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-85.06％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1700％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-78.64％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为2200％％～2300％；
其中所述转化率是通过下面公式(1)计算得到的：
(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％(1)。
在本发明另一种优选的实施方式中，提供了一种人参皂苷组合物的制备方法，其特征在于，采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对人参进行发酵。
优选的，按重量份计，所述培养基包含以下组分：在100份去离子水中，人参根粉0.1-20份，葡萄糖0.5-10份，蔗糖0.5-10份和硫酸铵0.5-10份，优选的，所述培养基包含以下组分：人参根粉5-15份，葡萄糖5-10份，蔗糖5-10份和硫酸铵5-10份；更优选的，所述费比恩毕赤酵母CGJ17的接种量为2-4％vol。
优选的，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为24-240h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-96。
优选的，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-96h。
优选的，所述人参皂苷组合物包括人参皂苷Rb1，稀有人参皂苷S-Rg3，人参皂苷Rg1，和稀有人参皂苷PPT。
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-70.83％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1300％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-71.92％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为1950％-2300％；
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-85.06％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1700％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-78.64％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为2200％％～2300％；其中所述转化率是通过下面公式(1)计算得到的：
(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％(1)。
在本发明另一种优选的实施方式中，提供了上述的一种人参皂苷组合物的制备方法得到的人参皂苷组合物。
在本发明另一种优选的实施方式中，提供了一种白藜芦醇的制备方法，其特征在于，采用所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对虎杖进行发酵。
优选的，按重量份计，所述培养基包含以下组分：在100份去离子水中，虎杖粉0.1-20份，蔗糖0.5-10份，氯化铵0.5-10份和磷酸氢二钾0.01-10份，
优选的，所述培养基包含以下组分：虎杖粉3-10份，蔗糖0.5-5份，氯化铵0.5-5份和磷酸氢二钾0.01-5份；更优选的，所述费比恩毕赤酵母CGJ17的接种量为2-5％vol。
优选的，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为24-240h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-96h。
优选的，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-96h。
优选的，其中，所述白藜芦醇的转化率为91.5-93.55％，优选为，所述白藜芦醇的转化率为92.2-93.5％；
其中所述转化率是转化生成的白藜芦醇的物质的量与反应消耗的虎杖苷的物质的量的百分比。
在本发明另一种优选的实施方式中，对该费比恩毕赤酵母菌Cyberlindnerafabianii CGJ17产β-D-葡萄糖苷酶的酶特性研究：对酶的定位、热稳定性、pH稳定性、乙醇对酶活的影响进行初步研究：此酶主要存在于细胞内，在40～50℃、pH4.0～7.0、0～3％乙醇浓度范围内，酶活不受影响。
在本发明另一种优选的实施方式中，使用该费比恩毕赤酵母菌Cyberlindnerafabianii CGJ17进行人参发酵。
优选的，步骤为：菌种活化：取一环斜面CGJ17接种于YPD液体培养基中活化，28～30℃摇床培养(摇床转速160～200rpm/min)至OD值≥1.0。配制发酵培养基：去离子水配制0.1～20％人参根粉、0.5～10％蔗糖、0.5～10％葡萄糖、0.5～10％硫酸铵，80～130℃高压蒸汽灭菌3s～120min。菌种发酵：将活化菌液以0.1～5％的接种量接种至发酵培养基中，28～30℃摇床培养24～240小时(摇床转速160～200rpm/min)。过滤：结束后用硅藻土精滤得到上清液即为人参发酵滤液。HPLC测试Rb1、S-Rg3等人参皂苷含量。
在本发明另一种优选的实施方式中，使用该费比恩毕赤酵母菌Cyberlindnerafabianii CGJ17进行虎杖发酵。
优选的，步骤为：菌种活化：取一环斜面CGJ17接种于YPD液体培养基中活化，28～30℃摇床培养(摇床转速160～200rpm/min)至OD值≥1.0。配制发酵培养基：去离子水配制0.1～20％虎杖粉、0.5～10％蔗糖、0.5～10％NH4Cl、0.5～10％K2HPO4，80～130℃高压蒸汽灭菌3s～120min。菌种发酵：将活化菌液以0.1～5％的接种量接种至发酵培养基中，28～30℃摇床培养24～240小时(摇床转速160～200rpm/min)。过滤：结束后用硅藻土精滤得到上清液即为虎杖发酵滤液。HPLC测试虎杖苷、白藜芦醇含量。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例和对比例中所用到的原料的信息如下表1所示。
表1本发明所用到的原料和仪器的信息
Figure BDA0003039750820000101
Figure BDA0003039750820000111
实施例
实施例1酶特性研究
(1)酶定位的研究：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0时，取1ml活化菌悬液，8000rpm离心10分钟，吸上清作为粗酶液A，细胞沉淀用1mlpH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液重悬作为粗酶液B，分别检测酶活。
对-硝基苯酚pNP标准曲线的制作：准确称取对-硝基苯酚13.90mg，溶解于蒸馏水并定容至1000mL，取6个10mL容量瓶，分别吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mLpNP溶液至1-6号瓶，用蒸馏水定容并混匀。则1-6号瓶对应的浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mmol/L。分别取不同浓度的pNP(对-硝基苯酚)溶液2mL再加入1mL1mol/L碳酸钠溶液充分混匀，以蒸馏水为对照，横坐标为紫外分光光度计在400nm条件下的OD值，纵坐标为对-硝基苯酚的浓度，绘制标准曲线，如图1。
β-葡萄糖苷酶的活性测定方法：p-NPG法是以对-硝基苯酚-β-葡萄糖苷(p-NPG)为反应物，β-葡萄糖苷酶可以使其在酸性条件下水解为葡萄糖和对-硝基苯酚(pNP)，产物对-硝基苯酚为有色物质，用比色法来确定β-葡萄糖苷酶的活性。取0.1mL粗酶液A或B，加入0.9mL pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，于37℃水浴预热10分钟，加入已预热10分钟的1mL5mmol/L的pNPG溶液，精确计时10分钟后立即加入1mL 1mol/L碳酸钠溶液终止反应，室温放置5分钟冷却，用0.45μm滤膜过滤后，于400nm处测OD值，以加热失活的酶液为空白对照，酶活(U)被定义为酶每分钟分解pNPG产生1μmolpNP需要的酶量。菌液上清粗酶液A的OD400nm值是0.224，而菌体重悬液粗酶液B的OD400nm值是2.683，说明酶活基本都来自菌体，从而证明此酶主要存在于细胞内，而不是细胞上清液中。结果表明，此酶主要存在于细胞内。
(2)酶的热稳定性的研究：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0时，取1ml活化菌悬液，分别在40℃、50℃、60℃水浴条件下保温，在0、30分钟、60分钟时测定酶活。pNPG法测定酶活，测定方法同前。结果表明，在40℃、50℃条件下，酶活不受影响，在60℃条件下，酶活基本丧失。
(3)酶的pH稳定性考查：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0时，取30ml活化菌悬液，用冰醋酸或饱和氢氧化钠溶液调节PH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,4℃保存24小时后测定酶活。pNPG法测定酶活，测定方法同前。结果表明pH为4.0～7.0对酶活影响不大，pH3.0条件下酶活基本丧失。
(4)乙醇对酶活性的影响：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0时，取20ml活化菌悬液，将乙醇浓度调节至0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0％，37℃下保温1小时后测定酶活。pNPG法测定酶活，测定方法同前。结果表明，乙醇浓度在0～3％范围内，酶活不受影响。
实施例2酶特性研究
酶定位的研究：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，28℃摇床培养(摇床转速160rpm/min)，OD值＝1.3时，取1ml活化菌悬液，8000rpm离心10分钟，吸上清作为粗酶液A，细胞沉淀用1mlPH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液重悬作为粗酶液B，分别检测酶活。测酶活方法同上，结果表明，此酶主要存在于细胞内，在40～50℃、pH4.0～7、0～3％乙醇浓度范围内，酶活不受影响。
实施例3人参发酵
(1)菌种活化：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0。
(2)配制发酵培养基：去100g离子水、10g人参根粉、5g蔗糖、5g葡萄糖、10g硫酸铵，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
(3)菌种发酵：将活化菌液以2％vol的接种量接种至步骤(2)的发酵培养基中，30℃摇床培养96小时(摇床转速200rpm/min)，发酵pH值为6.0。
(4)过滤：发酵结束后用硅藻土精滤得到上清液即为人参发酵滤液，其中包含人参皂苷组合物。
(5)HPLC检测：通过HPLC分析检测其中的人参皂苷Rb1、S-Rg3和稀有人参皂苷Rg1、PPT的含量，采用Agilent 1200型高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentEclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(ACN)-0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，如下表2所示，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm，以人参皂苷标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的人参皂苷Rb1、S-Rg3、Rg1、PPT进行分析，发酵前的测量的是步骤(2)中的发酵培养基，发酵后测量的是步骤(4)得到的发酵后得到的人参发酵滤液。检测结果如下表3：
表2实施例3的梯度洗脱表
Time ACN 0.1磷酸水
0 19.5 80.5
25 19.5 80.5
40 32 68
60 33.5 66.5
65 38 62
70 62 38
75 62 38
90 65 35
95 95 5
100 95 5
100.1 19.5 80.5
105 19.5 80.5
表3人参皂苷组分的转化率
人参皂苷 发酵前(mg/mL) 发酵后(mg/mL) 转化率
Rb1 0.154 0.023 -85.06％
S-Rg3 0.003 0.054 1700％
Rg1 0.144 0.030 -79.17％
PPT 0.001 0.024 2300％
(6)计算转化率：转化率定义为(发酵后人参皂苷的量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％，经计算，Rb1转化率为-85.06％，S-Rg3转化率为1700％，Rg1转化率为-79.17％，PPT转化率为2300％。
实施例4人参发酵
(1)菌种活化：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0。
(2)配制发酵培养基：去100g离子水、10g人参根粉、5g蔗糖、5g葡萄糖、10g硫酸铵，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
(3)菌种发酵：将活化菌液以4％vol的接种量接种至发酵培养基中，30℃摇床培养72小时(摇床转速200rpm/min)，发酵pH值为7.0。
(4)过滤：发酵结束后用硅藻土精滤得到上清液即为人参发酵滤液，其中包含人参皂苷组合物。
(5)HPLC检测：通过HPLC分析检测其中的人参皂苷Rb1、Rg1和稀有人参皂苷S-Rg3、PPT含量，采用Agilent 1200型高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentEclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(ACN)-0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，如下表4所示，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm，以人参皂苷标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的人参皂苷Rb1、S-Rg3、Rg1、PPT进行分析，发酵前的测量的是步骤(2)中的发酵培养基，发酵后测量的是步骤(4)得到的发酵后得到的人参发酵滤液。检测结果如下表5：
表4实施例4的梯度洗脱表
Figure BDA0003039750820000151
Figure BDA0003039750820000161
表5人参皂苷组分的转化率
人参皂苷 发酵前(mg/mL) 发酵后(mg/mL) 转化率
Rg1 0.203 0.057 -70.83％
PPT 0.002 0.041 1300％
Rb1 0.24 0.070 -71.92％
S-Rg3 0.006 0.084 1950％
(6)计算转化率：转化率定义为(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％，经计算，Rb1转化率为-70.83％，S-Rg3转化率为1300％，Rg1转化率为-71.92％，PPT转化率为1950％。
实施例5人参发酵
(1)菌种活化：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0。
(2)配制发酵培养基：按重量份计，100g去离子水，8g人参根粉，8g蔗糖，8g葡萄糖，10g份硫酸铵，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
(3)菌种发酵：将活化菌液以4％vol的接种量接种至发酵培养基中，30℃摇床培养96小时(摇床转速200rpm/min)，发酵pH值为6.5。
(4)过滤：发酵结束后用硅藻土精滤得到上清液即为人参发酵滤液，其中包含人参皂苷组合物。
(5)HPLC检测：通过HPLC分析检测其中的人参皂苷Rb1、Rg1和稀有人参皂苷S-Rg3、PPT含量，采用Agilent 1200型高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentEclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(ACN)-0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，如下表6所示，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm，以人参皂苷标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的人参皂苷Rb1、S-Rg3、Rg1、PPT进行分析，发酵前的测量的是步骤(2)中的发酵培养基，发酵后测量的是步骤(4)得到的发酵后得到的人参发酵滤液，检测结果如下表7：
表6实施例5的梯度洗脱表
Time ACN 0.1磷酸水
0 19.5 80.5
25 19.5 80.5
40 32 68
60 33.5 66.5
65 38 62
70 62 38
75 62 38
90 65 35
95 95 5
100 95 5
100.1 19.5 80.5
105 19.5 80.5
表7人参皂苷组分的转化率
人参皂苷 发酵前(mg/mL) 发酵后(mg/mL) 转化率
Rg1 0.103 0.022 -89.23％
PPT 0.001 0.023 2600％
Rb1 0.130 0.014 -78.64％
S-Rg3 0.002 0.054 2200％
(6)计算转化率：转化率定义为(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％，经计算，Rb1转化率为-89.23％，S-Rg3转化率为2600％，Rg1转化率为-78.64％，PPT转化率为2200％。
实施例6虎杖发酵
(1)菌种活化：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0。
(2)配制发酵培养基：100g去离子水，8g虎杖粉，5g蔗糖，0.6gNH4Cl，0.04gK2HPO4，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
(3)菌种发酵：将活化菌液以4％vol的接种量接种至发酵培养基中，30℃摇床培养96小时(摇床转速200rpm/min)，发酵pH值为6.5。
(4)过滤：发酵结束后用硅藻土精滤得到上清液即为虎杖发酵滤液。
(5)HPLC检测：通过HPLC分析检测其中的虎杖苷、白藜芦醇含量，采用Agilent1200型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇：水为40:60，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长305nm，进样量20μL，以虎杖苷、白藜芦醇标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的虎杖苷、白藜芦醇进行分析，发酵前的测量的是步骤(2)中的发酵培养基，发酵后测量的是步骤(4)得到的发酵后得到的虎杖发酵滤液，检测结果如下表8：
表8虎杖苷和白藜芦醇发酵前后的量
物质名称 发酵前(mg/mL) 发酵后(mg/mL)
虎杖苷 0.81 0.17
白藜芦醇 0.06 0.39
(6)计算转化率：转化率定义为转化生成的白藜芦醇(分子量228)的物质的量与反应消耗的虎杖苷(分子量408)的物质的量的百分比，经计算，转化率为92.2％。
实施例7虎杖发酵
(1)菌种活化：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)中活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0。
(2)配制发酵培养基：100g去离子水，5g虎杖粉，3g蔗糖，0.6gNH4Cl，0.04份K2HPO4，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
(3)菌种发酵：将活化菌液以2％vol的接种量接种至发酵培养基中，30℃摇床培养72小时(摇床转速200rpm/min)，发酵pH值为6.8。
(4)过滤：发酵结束后用硅藻土精滤得到上清液即为虎杖发酵滤液。
(5)HPLC检测：通过HPLC分析检测其中的虎杖苷、白藜芦醇含量，采用Agilent1200型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇：水为40:60，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长305nm，进样量20μL，以虎杖苷、白藜芦醇标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的虎杖苷、白藜芦醇进行分析，发酵前的测量的是步骤(2)中的发酵培养基，发酵后测量的是步骤(4)得到的发酵后得到的虎杖发酵滤液，检测结果如下表9：
表9虎杖苷和白藜芦醇发酵前后的量
物质名称 发酵前(mg/mL) 发酵后(mg/mL)
虎杖苷 0.53 0.09
白藜芦醇 0.04 0.265
(6)计算转化率：转化率定义为转化生成的白藜芦醇(分子量228)的物质的量与反应消耗的虎杖苷(分子量408)的物质的量的百分比，经计算，转化率为91.5％。
实施例8虎杖发酵
(1)菌种活化：取一环费比恩毕赤酵母CGJ17接种于YPD液体培养基中(在100g去离子水中，2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母浸粉)活化，30℃摇床培养(摇床转速200rpm/min)，OD值＝1.0。
(2)配制发酵培养基：100g去离子水中，3g虎杖粉，3g蔗糖，0.6gNH4Cl，0.04gK2HPO4，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
(3)菌种发酵：将活化菌液以5％vol的接种量接种至发酵培养基中，30℃摇床培养40小时(摇床转速200rpm/min)，发酵pH值为5.8。
(4)过滤：发酵结束后用硅藻土精滤得到上清液即为虎杖发酵滤液。
(5)HPLC检测：通过HPLC分析检测其中的虎杖苷、白藜芦醇含量，采用Agilent1200型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇：水为40:60，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长305nm，进样量20μL，以虎杖苷、白藜芦醇标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的虎杖苷、白藜芦醇进行分析，发酵前的测量的是步骤(2)中的发酵培养基，发酵后测量的是步骤(4)得到的发酵后得到的虎杖发酵滤液，检测结果如下表10：
表10虎杖苷和白藜芦醇发酵前后的量
物质名称 发酵前(mg/mL) 发酵后(mg/mL)
虎杖苷 0.40 0.046
白藜芦醇 0.02 0.205
(6)计算转化率：转化率定义为转化生成的白藜芦醇(分子量228)的物质的量与反应消耗的虎杖苷(分子量408)的物质的量的百分比，经计算，转化率为93.5％。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种费比恩毕赤酵母CGJ17(Cyberlindnerafabianii CGJ17)，其特征在于，所述费比恩毕赤酵母CGJ17(Cyberlindnerafabianii CGJ17)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2020169。
2.权利要求1所述的费比恩毕赤酵母CGJ17在产β-D-葡萄糖苷酶中的应用。
3.一种发酵生产β-D-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的费比恩毕赤酵母CGJ17进行发酵生产。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述费比恩毕赤酵母CGJ17接种在培养基中进行发酵培养，直至产生得到β-D-葡萄糖苷酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为15-72h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-48h。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，按重量份计，所述培养基包含以下组分：酵母浸粉0.5-10份，葡萄糖0.5-10份和蛋白胨0.5-10份。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-48h。
8.一种人参皂苷组合物，其采用权利要求1所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对人参进行发酵得到，其包括人参皂苷Rb1，稀有人参皂苷S-Rg3，人参皂苷Rg1，和稀有人参皂苷PPT。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中，按质量％计，所述人参皂苷Rb1的转化率为-70.83％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1300％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-71.92％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为1950％～2300％，
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-85.06％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1700％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-78.64％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为2200％％～2300％；
其中所述转化率是通过下面公式(1)计算得到的：
(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％(1)。
10.一种人参皂苷组合物的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对人参进行发酵。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，按重量份计，所述培养基包含以下组分：在100份去离子水中，人参根粉0.1-20份，葡萄糖0.5-10份，蔗糖0.5-10份和硫酸铵0.5-10份，
优选的，所述培养基包含以下组分：人参根粉5-15份，葡萄糖5-10份，蔗糖5-10份和硫酸铵5-10份；更优选的，所述费比恩毕赤酵母CGJ17的接种量为2-4％vol。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为24-240h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-96。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-96h。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述人参皂苷组合物包括人参皂苷Rb1，稀有人参皂苷S-Rg3，人参皂苷Rg1，和稀有人参皂苷PPT。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述人参皂苷Rb1的转化率为-70.83％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1300％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-71.92％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为1950％-2300％；
优选的，所述人参皂苷Rb1的转化率为-85.06％～-89.23％，稀有人参皂苷S-Rg3的转化率为1700％～2600％，人参皂苷Rg1的转化率为-78.64％～-79.17％，和稀有人参皂苷PPT的转化率为2200％％～2300％；其中所述转化率是通过下面公式(1)计算得到的：
(发酵后人参皂苷量-发酵前人参皂苷的量的差)/发酵前人参皂苷的量×100％(1)。
16.权利要求10-15任一项所述的一种人参皂苷组合物的制备方法得到的人参皂苷组合物。
17.一种白藜芦醇的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的费比恩毕赤酵母CGJ17对虎杖进行发酵。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，按重量份计，所述培养基包含以下组分：在100份去离子水中，虎杖粉0.1-20份，蔗糖0.5-10份，氯化铵0.5-10份和磷酸氢二钾0.01-10份，
优选的，所述培养基包含以下组分：虎杖粉3-10份，蔗糖0.5-5份，氯化铵0.5-5份和磷酸氢二钾0.01-5份；更优选的，所述费比恩毕赤酵母CGJ17的接种量为2-5％vol。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述发酵培养温度为25-35℃，发酵pH值为5.0-7.0，发酵培养时间为24-240h，优选的，所述发酵培养温度为28-30℃；发酵pH值为6.0-7.0；发酵培养时间为24-96h。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，发酵培养过程中还包括摇床培养，优选的，所述摇床转速为160-220r/min；摇床培养时间为24-96h。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中，所述白藜芦醇的转化率为91.5-93.55％，优选为，所述白藜芦醇的转化率为92.2-93.5％；其中所述转化率是转化生成的白藜芦醇的物质的量与反应消耗的虎杖苷的物质的量的百分比。
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