CN110771875A - 一种用乳杆菌发酵人参的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用乳杆菌发酵人参的方法，包括：制备人参须和人参根基底；乳杆菌发酵人参；所述制备人参须和人参根基底是将人参须和人参根置于容器中并密封，121℃高温灭菌20min后冷却到室温；所述乳杆菌发酵人参是将培养好的罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌发酵液分别倒入人参须和人参根基底中并密封，37℃恒温培养箱中培养。通过本发明的方法发酵人参，使得发酵产物中产生了高生物活性的稀有人参皂苷Rg3和CK，并且也增加了多糖和多肽的含量。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，尤其涉及微生物发酵技术领域。
背景技术
乳杆菌是益生菌，广泛存在于自然界中，在我们的生活中，可从肉制品、乳制品、啤酒、葡萄酒等中分离得到。因为有乳杆菌的作用，可以制得泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等中国传统食品。因此，在食品加工领域其已有广泛研究，大量研究表明：其能平衡胃肠道菌群正常，改善胃肠道功能，控制其他菌生长，降低血液中的胆固醇含量。
人参则是我国传统名贵中药材，其中发挥药理作用的主要有效成份之一为人参皂苷。人参皂苷作为人参的活性成分，引起业界广泛关注，目前经过大量研究表明，各种稀有人参皂苷生物活性高并且对人体大有益处，比如稀有人参皂苷Rg3可以抑制癌细胞增殖，并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。稀有人参皂苷在人参中的含量很低或不存在。如何提高稀有人参皂苷在人参中的含量是一个较为迫切的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用乳杆菌发酵人参的方法，包括：制备人参须和人参根基底；乳杆菌发酵人参；
所述制备人参须和人参根基底是将人参须和人参根置于容器中并密封，121℃高温灭菌20min后冷却到室温；
所述乳杆菌发酵人参是将培养好的罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌发酵液分别倒入人参须和人参根基底中并密封，37℃恒温培养箱中培养。
进一步地，所述的发酵液制备方法包括：取单个养罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌菌落，在37℃下培养，再按2％接种量扩大培养，取出发酵的乳杆菌液体，得到去除基底的发酵液。
通过本发明的方法发酵人参，使得发酵产物中产生了高生物活性的稀有人参皂苷Rg3和CK，并且也增加了多糖和多肽的含量。
具体实施方式
实施例1
首先，在最适条件下扩大培养乳杆菌，将其用于发酵人参，其发酵条件与扩大培养乳杆菌保持一致。发酵为液体发酵，通过发酵不同天数：2天、4天、6天、8天；测量其发酵后的多糖、多肽、人参总皂苷等含量变化。检测方法为苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝比色法等。最后用HPLC检测其发酵后的成分。
1.乳杆菌为罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌，由实验室提供。
发酵基底为人参须和人参根，人参须和人参根产地为吉林省。
2.培养基
制备乳杆菌培养基：
MRS固体培养基：(乳酸细菌培养基)(g/l)蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，K2HPO4·7H2O 2.0g，醋酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，MnSO4.4H2O 0.05g，琼脂15.0g，pH 6.5，加入1L蒸馏水，搅拌、加热溶解15min，于121℃高温灭菌20min，取出后冷却到50℃在超净台中操作倒入培养皿，静置过夜。观察无杂菌长出，将培养皿封口放入4℃冰箱保存待用。
MRS液体培养基按照以上比例除不加琼脂外，其余都一致配制，搅拌、加热溶解15min，于121℃高温灭菌20min，取出后室温保存。
3.试剂和缓冲液的配制
标准葡萄糖溶液制备：准确称取葡萄糖100mg于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为1mg/mL的标准葡萄糖溶液。
苯酚溶液(5％苯酚溶液)制备：称取2.5g苯酚，加入蒸馏水97.5mL，置于棕色瓶中，50℃水浴加热溶解后，待用。
考马斯亮蓝染色液制备：将50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL 95％乙醇中，再加入50mL的85％磷酸，用蒸馏水补充至100mL，制成的染色液可放于4℃冰箱保存6个月，保持稳定。使用时需要放置至室温，颠倒摇匀后再使用。
标准多肽(BSA)溶液制备：精密称取0.01g BSA粉末，加水至10mL，得浓度为1mg/mL得BSA溶液。
Tris-HCl缓冲液制备：精密称取Tris 1.2g，置于100mL容量瓶中，先加适量蒸馏水，用HCl调pH值至6.5，再加蒸馏水稀释至刻度，待用。
人参皂苷Re标准溶液的制备：精密称取人参皂苷Re 10mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至10mL，摇匀使其充分溶解，即得人参皂苷Re 1mg/mL标准溶液。
新鲜配制的香草醛-冰醋酸溶液：精密称取香草醛500mg，用冰醋酸定容至10mL，可得50mg/mL的香草醛-冰醋酸溶液。
标准人参皂苷样品：分别配制3mg/mL的Re、Rg1、Rg3、CK，分别取Re、Rg1、Rg3、CK3mg，各加入1mL甲醇使其溶解，待测。
4.乳杆菌扩大培养
将制备好的固体培养皿从4℃冰箱中取出冷却至室温，待用。
乳杆菌分别培养罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌。
打开超净台的日光灯，关闭紫外线灯，抬起窗5cm左右，散去其中臭氧后，用一次性接种环取单个菌落于已高温灭菌的具塞试管中培养，在37℃的培养箱中静置一夜，再按2％接种量扩大培养到500mL的MRS液体培养基中，各三组。
按照实验安排取出发酵2天、4天、6天、8天的乳杆菌液体培养样品，抽滤将发酵后的基底和发酵液分开，基底倒入培养皿中，打开盖子，置于40℃电热鼓风干燥机中24h，烘至恒重，粉碎，待用。
5.乳杆菌发酵人参
1)制备人参须和人参根基底：
各称取10g人参须和人参根置于100mL锥形瓶中，封口，121℃高温灭菌20min后冷却到室温待用。
2)乳杆菌发酵人参：
无菌操作，将培养好的罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌发酵液(菌含量2～5×108cfu/mL)分别倒入人参须和人参根基底中，每瓶50mL，封口置于37℃恒温培养箱中培养2天、4天、6天、8天，实验重复三次。
6.检测发酵后的人参多糖含量
1)标准曲线制备：
精准称取1mg/mL的葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL定容瓶中，加蒸馏水定容至刻度线。准确吸取各浓度的溶液0.1mL，另取0.1mL去离子水作为空白对照组，分别置于有刻度的试管中，进行比色反应，即各加0.05mL 5％苯酚溶液混匀，0.25mL浓硫酸混匀5min，封管沸水浴1h，取出后冷却至室温，在490nm处测吸光度值。处理数据，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程：Y＝5.365X-0.0042，R2＝0.9995。
2)检测发酵后的人参多糖含量
取0.015g样品于EP管中，加入1.5mL蒸馏水，沸水浴30min，超声20min，重复两次，离心8000r/min 10min，取上清，加入3倍体积的无水乙醇，摇匀，静置过夜，离心8000r/min10min，弃上清，沉淀加水复溶至1.5mL，得到待测液。取其上清0.1mL，另取0.1mL蒸馏水作为空白对照组，置于有刻度的试管中，加入0.05mL 5％苯酚溶液混匀，0.25mL浓硫酸混匀5min，封管沸水浴1h，取出后冷却至室温，在490nm处测吸光度值，实验重复三次。每个样品取3个样，测出吸光度值，根据标准回归曲线计算浓度。
检测发酵后的人参多糖含量精密称取0.1g样品，放入2mL离心管中，加入Tris-HCl缓冲液1mL，摇匀震荡5min，离心8000r/min 10min，弃沉淀，取上清转入10mL有刻度的试管中，加蒸馏水稀释至10mL，得到待测液。取样品试液0.1mL，加入0.5mL考马斯亮蓝染色液，混匀，室温下放置5min，以相应试剂作为对照组，在595nm处测量其吸光度，实验重复三次。每个样品取3个样，测出吸光度值，取平均值，根据标准回归曲线计算浓度。
首先，测量了对照组的人参须和人参根在490nm处的吸光度值分别为1.012和1.088，将其代入绘制的标准回归方程中，经过处理数据后，测得未发酵的人参须和人参根中的多糖含量为126.28mg/g和135.72mg/g。
同样对所测样品数据进行处理，所得结果如下表1所示。通过对比观察可知，经过罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌液体发酵后的人参须和人参根的基底中的多糖含量明显高于发酵前，植物乳杆菌液体发酵人参根8天后的基底中多糖含量高达145.66mg/g，含量随着发酵天数的增加，整体均成上升趋势。乳杆菌为细菌，培养时间短，发酵时间短，但其只适合液体发酵。发酵后的人参根中的多糖含量比发酵后的人参须中多。
表1样品发酵后多糖含量数据
7.发酵人参中稀有人参皂苷的分离纯化
发酵的人参100g加70％酒精500mL加热提取三次。提取液过滤减压浓缩至无醇味，再过大孔吸附树脂D101，经水洗，再经不同浓度的酒精梯度洗脱。80％酒精洗脱液浓缩后过硅胶柱，用氯仿：甲醇100：1至5：1梯度洗脱，得到高含量的稀有人参皂苷。
检测发酵后的人参总皂苷含量
1)标曲制备：用移液枪精确吸取人参皂苷Re标准溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42、0.48、0.56mL分别置于具塞试管中，各加入新鲜配制的50mg/mL香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀，以相应的试剂作为空白对照组，于60℃水浴加热15min，取出后流水冷却5min，再各加入冰醋酸5mL，震荡摇匀，测量其在544nm处的吸光度，每个浓度取3个样，以人参皂苷Re浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程：Y＝7.4504X-0.0028，R2＝0.9993。
2)检测发酵后的人参总皂苷含量
称取1g样品于具塞试管中，加入10mL甲醇，超声30min，60℃水浴10min，重复两次，过滤，取滤液用旋蒸仪蒸干，蒸干后加入1mL去离子水和1mL正丁醇，摇匀，使沉淀复溶于正丁醇，蒸出的甲醇回收处理，超声20min，离心8000r/min 10min，取上清液，40℃烘干过夜，加甲醇复溶，定容至10mL，得到待测液。
吸取0.1mL于具塞试管中，加入新鲜配制的50mg/mL香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀，以相应的的试剂作为空白对照组，于60℃水浴加热15min，取出后流水冷却5min，再各加入冰醋酸5mL，震荡摇匀，测量其在544nm处的吸光度，实验重复三次。每个样品取3个样，测出吸光度值，取平均值，根据标准回归曲线计算浓度。
3)HPLC检测发酵后的人参单体皂苷含量
高效液相色谱条件：进样量为10μL；层析柱为Symmetry C18柱(4.6×250nm，Waters)；梯度洗脱40-100％乙腈水；时间为30min；波长203nm；30min后设定100％乙腈洗10min，再用40％乙腈水洗10min。
HPLC检测标准样品：用洗净烘干后的针头吸取0.7mL待测液，从过滤头打入到HPLC检测小瓶子中。
HPLC检测发酵处理后的样品：检测样品即为人参总皂苷的待测液，用洗净烘干后的针头吸取0.7mL待测液，通过过滤头打入到HPLC检测小瓶子中。
首先，测量了对照组的人参须和人参根在544nm处的吸光度值分别为0.452和0.483，将其代入绘制的标准回归方程中，经过处理数据后，测得未发酵的人参须和人参根中的总皂苷含量为37.24mg/g和39.77mg/g。
同样对所测样品数据进行处理，所得结果如下表2所示。通过对比观察可知，经过罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌液体发酵8天后的人参须和人参根的基底中的总皂苷含量低于发酵前。
表2样品发酵后人参总皂苷含量数据
首先，使用HPLC方法测量了对照组的人参须的Rg1、Re、Rg3、CK含量为1.67mg/g、2.75mg/g、0mg/g、0.01mg/g；人参根的Rg1、Re、Rg3、CK含量为1.87mg/g、2.89mg/g、0mg/g、0.01mg/g。根据如下表3分析来看，Rg3、CK在发酵前含量极少或者没有，罗伊氏乳杆菌发酵6天后均增加。Rg3、CK都是稀有人参皂苷，通过微生物转化法而形成。
从发酵人参中分离纯化的稀有人参皂苷，经HPLC检测，稀有人参皂苷Rg3和CK的含量可达750mg/g。
表3样品发酵后人参单体皂苷含量数据
植物乳杆菌液体发酵人参根8天后的基底中多糖含量可达145.66mg/g。
乳杆菌发酵人参后的多肽含量也高于发酵前。
稀有人参皂苷Rg3、CK在发酵前含量极少或者没有，但是在发酵过后均增加，说明此发酵方法可以有效增加稀有人参皂苷含量。
8.检测发酵后的人参多肽含量
标准曲线制备：取1mg/mL的BSA溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1mL加到有刻度的试管中，再加入0.9、0.7、0.5、0.3、0.1、0mL Tris-HCl缓冲液，再各加入已经制备好的考马斯亮蓝G-250染色液5mL，以相应的的试剂作为空白对照组，摇匀，放置2min后，测量在595nm处测量吸光度。每个浓度取3个样，以BSA浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程：Y＝1.139X+0.0131，R2＝0.9993。
首先，测量了对照组的人参须和人参根在595nm处的吸光度值分别为0.582和0.576，将其代入绘制的标准回归方程中，经过处理数据后，测得未发酵的人参须和人参根中的多肽含量为49.95mg/g和49.42mg/g。
同样对所测样品数据进行处理，所得结果如下表4所示。通过对比观察可知，经过罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌液体发酵后的人参须和人参根的基底中的多肽含量明显高于发酵前。在相同发酵温度、pH值、发酵时间等因素相同的情况下，发酵后人参根中的多肽含量高于人参须中的多肽含量。
表4样品发酵后多肽含量数据
Claims (2)
1.一种用乳杆菌发酵人参的方法，其特征在于，包括：
制备人参须和人参根基底；乳杆菌发酵人参；
所述制备人参须和人参根基底是将人参须和人参根置于容器中并密封，121℃高温灭菌20min后冷却到室温；
所述乳杆菌发酵人参是将培养好的罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌发酵液分别倒入人参须和人参根基底中并密封，37℃恒温培养箱中培养。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌发酵液的制备方法包括：
取单个养罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌菌落，在37℃下培养，再按2％接种量扩大培养，取出发酵的乳杆菌液体，得到去除基底的罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌发酵液。
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