CN110771876A - 一种用蛹虫草发酵人参的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用蛹虫草发酵人参的方法，包括：制备人参须和人参根基底；蛹虫草发酵人参；所述制备人参须和人参根基底是将人参须和人参根置于容器中并密封，121℃高温灭菌20min后冷却到室温；所述蛹虫草发酵人参包括蛹虫草固体发酵人参和蛹虫草液体发酵人参。通过本发明的方法发酵人参，提高了发酵人参产物中多糖和多肽的含量，以及产生了高生物活性稀有人参皂苷Rg3和CK。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，尤其涉及微生物发酵技术领域。
背景技术
蛹虫草则是著名的食用真菌，其药用价值可与冬虫夏草相媲美，但其性价比比冬虫夏草高，属于“经济实用型”。
人参则是我国传统名贵中药材，其中发挥药理作用的主要有效成份之一为人参皂苷。人参皂苷作为人参的活性成分，引起业界广泛关注，目前经过大量研究表明，其各种稀有人参皂苷对人体大有益处，比如稀有人参皂苷Rg3可以抑制癌细胞增殖，并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。稀有人参皂苷在人参中的含量很低或不存在。如何提高稀有人参皂苷在人参中的含量是一个较为迫切的课题。
发明内容
本发明的目的提供一种用蛹虫草发酵人参的方法，包括：制备人参须和人参根基底；蛹虫草发酵人参；
所述制备人参须和人参根基底是将人参须和人参根置于容器中并密封，121℃高温灭菌20min后冷却到室温；
所述蛹虫草发酵人参包括蛹虫草固体发酵人参和蛹虫草液体发酵人参。
进一步地，所述蛹虫草固体发酵人参是将固体培养基培养好的蛹虫草切成小块，分别接种于人参须和人参根基底中，封口，充分摇匀，22℃培养，每天振荡摇匀。
进一步地，所述蛹虫草液体发酵人参将培养好的蛹虫草液体培养基倒入人参须和人参根基底中，封口，充分摇匀，22℃培养，每天振荡摇匀。
通过本发明的方法发酵人参，提高了发酵人参产物中多糖和多肽的含量，以及产生了高生物活性稀有人参皂苷Rg3和CK。
具体实施方式
实施例1
首先，在最适条件下扩大培养蛹虫草，将其用于发酵人参，其发酵条件与扩大培养蛹虫草保持一致。发酵可分为固体发酵和液体发酵，发酵基底为人参须和人参根，通过发酵不同天数：7天、14天、21天、28天，测量其发酵后的多糖、多肽、人参总皂苷等含量变化。检测方法为苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝比色法等。最后用HPLC检测其发酵后的成分。
1.蛹虫草菌的产地为安徽。
人参须和人参根产地为吉林省。
2.培养基
1)制备蛹虫草培养基：
PDA固体培养基：称取37g PDA粉末，加入1L蒸馏水，搅拌、加热溶解15min，于121℃高温灭菌20min，取出后冷却到50℃在超净台中操作倒入培养皿，静置过夜。观察无杂菌长出，将培养皿封口放入4℃冰箱保存待用。
液体培养基：称取马铃薯浸出粉37g，加入1L蒸馏水，搅拌、加热溶解15min，于121℃高温灭菌20min，取出后室温保存，可在两周内使用。
发酵培养基(g/l)：蔗糖30g、蛋白胨2.5g、MgSO47H2O 1.5g、KH2PO4 1.5g、水1L，搅拌、加热溶解15min，于121℃高温灭菌20min，取出后室温保存，可在两周内使用。
3.试剂和缓冲液的配制
标准葡萄糖溶液制备：准确称取葡萄糖100mg于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为1mg/mL的标准葡萄糖溶液。
苯酚溶液(5％苯酚溶液)制备：称取2.5g苯酚，加入蒸馏水97.5mL，置于棕色瓶中，50℃水浴加热溶解后，待用。
考马斯亮蓝染色液制备：将50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL 95％乙醇中，再加入50mL的85％磷酸，用蒸馏水补充至100mL，制成的染色液可放于4℃冰箱保存6个月，保持稳定。使用时需要放置至室温，颠倒摇匀后再使用。
标准多肽(BSA)溶液制备：精密称取0.01g BSA粉末，加水至10mL，得浓度为1mg/mL得BSA溶液。
Tris-HCL缓冲液制备：精密称取Tris 1.2g，置于100mL容量瓶中，先加适量蒸馏水，用HCL调pH值至6.5，再加蒸馏水稀释至刻度，待用。
人参皂苷Re标准溶液的制备：精密称取人参皂苷Re 10mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至10mL，摇匀使其充分溶解，即得人参皂苷Re 1mg/mL标准溶液。
新鲜配制的香草醛-冰醋酸溶液：精密称取香草醛500mg，用冰醋酸定容至10mL，得50mg/mL的香草醛-冰醋酸溶液。
标准人参皂苷样品：分别配制3mg/mL的Re、Rg1、Rg3、CK，分别取Re、Rg1、Rg3、CK3mg，各加入1mL甲醇使其溶解，待测。
4.蛹虫草扩大培养
将制备好的固体培养皿从4℃冰箱中取出冷却至室温，待用。
固体培养：打开超净台的日光灯，关闭紫外线灯，抬起窗5cm左右，散去其中臭氧后，将蛹虫草母种切成2*2mm小块，接种于PDA固体培养基中，22℃，倒置避免水蒸气滴落污染培养基，静置培养7天。
液体培养：无菌操作将培养好的蛹虫草切成米粒大小，接种于蛹虫草发酵培养基中，22℃恒温摇床中，培养7天，待用。
5.蛹虫草发酵人参
1)制备人参须和人参根基底：
各称取10g人参须和人参根置于100mL锥形瓶中，封口，121℃高温灭菌20min后冷却到室温待用。
2)蛹虫草发酵人参：
固体发酵：将培养好的蛹虫草固体培养基取出，在超净台中操作将蛹虫草切成2*2mm小块，分别接种于人参须和人参根基底中，封口，充分摇匀，22℃培养7天、14天、21天、28天，每天振荡摇匀。实验重复三次。取出发酵7天、14天、21天、28天的蛹虫草固体培养样品，固体培养样品打开封盖，置于40℃电热鼓风干燥机中48h，烘至恒重，粉碎，待用。
液体发酵：无菌操作，将培养好的蛹虫草液体培养基倒入人参须和人参根基底中，每瓶50mL，封口，充分摇匀，22℃培养7天、14天、21天、28天，每天振荡摇匀。实验重复三次。按照实验安排取出发酵7天、14天、21天、28天的蛹虫草液体培养样品，液体培养样品进行抽滤处理，将发酵后的基底和发酵液分开，基底倒入培养皿中，打开盖子，置于40℃电热鼓风干燥机中24h，烘至恒重，粉碎，待用。
6.检测发酵后的人参多糖含量
1)标准曲线制备：
精准称取1mg/mL的葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL定容瓶中，加蒸馏水定容至刻度线。准确吸取各浓度的溶液0.1mL，另取0.1mL去离子水作为空白对照组，分别置于有刻度的试管中，进行比色反应，即各加0.05mL 5％苯酚溶液混匀，0.25mL浓硫酸混匀5min，封管沸水浴1h，取出后冷却至室温，在490nm处测吸光度值。处理数据，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程：Y＝5.365X-0.0042，R2＝0.9995。
2)检测发酵后的人参多糖含量
取0.015g样品于EP管中，加入1.5mL蒸馏水，沸水浴30min，超声20min，重复两次，离心8000r/min 10min，取上清，加入3倍体积的无水乙醇，摇匀，静置过夜，离心8000r/min10min，弃上清，沉淀加水复溶至1.5mL，得到待测液。取其上清0.1mL，另取0.1mL蒸馏水作为空白对照组，置于有刻度的试管中，加入0.05mL 5％苯酚溶液混匀，0.25mL浓硫酸混匀5min，封管沸水浴1h，取出后冷却至室温，在490nm处测吸光度值，实验重复三次。每个样品取3个样，测出吸光度值，根据标准回归曲线计算浓度。
检测发酵后的人参多糖含量精密称取0.1g样品，放入2mL离心管中，加入Tris-HCl缓冲液1mL，摇匀震荡5min，离心8000r/min 10min，弃沉淀，取上清转入10mL有刻度的试管中，加蒸馏水稀释至10mL，得到待测液。取样品试液0.1mL，加入0.5mL考马斯亮蓝染色液，混匀，室温下放置5min，以相应试剂作为对照组，在595nm处测量其吸光度，实验重复三次。每个样品取3个样，测出吸光度值，取平均值，根据标准回归曲线计算浓度。
首先，测量了对照组的人参须和人参根在490nm处的吸光度值分别为1.012和1.088，将其代入绘制的标准回归方程中，经过处理数据后，测得未发酵的人参须和人参根中的多糖含量为126.28mg/g和135.72mg/g。
同样对所测样品数据进行处理，所得结果如下表1所示。通过对比观察可知，经过蛹虫草固体、液体发酵后的人参须和人参根的基底中的多糖含量明显高于发酵前，其中蛹虫草液体发酵人参根28天后多糖含量为145.41mg/g，含量随着发酵天数的增加，整体均成上升趋势。液体发酵整体而言相对于固体发酵效果好。观察发酵第28天和第8天的发酵后的人参须和人参根，发酵后的人参根中的多糖含量比发酵后的人参须中多。
表1样品发酵后多糖含量数据
7.发酵人参中稀有人参皂苷
发酵的人参100g加70％酒精500mL加热提取三次。提取液过滤减压浓缩至无醇味，再过大孔吸附树脂D101，经水洗，再经不同浓度的酒精梯度洗脱。80％酒精洗脱液浓缩后过硅胶柱，用氯仿：甲醇100：1至5：1梯度洗脱，得到高含量的稀有人参皂苷。
检测发酵后的人参总皂苷含量
1)标曲制备：用移液枪精确吸取人参皂苷Re标准溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42、0.48、0.56mL分别置于具塞试管中，各加入新鲜配制的50mg/mL香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀，以相应的试剂作为空白对照组，于60℃水浴加热15min，取出后流水冷却5min，再各加入冰醋酸5mL，震荡摇匀，测量其在544nm处的吸光度，每个浓度取3个样，以人参皂苷Re浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程：Y＝7.4504X-0.0028，R2＝0.9993。
2)检测发酵后的人参总皂苷含量
称取1g样品于具塞试管中，加入10mL甲醇，超声30min，60℃水浴10min，重复两次，过滤，取滤液用旋蒸仪蒸干，蒸干后加入1mL去离子水和1mL正丁醇，摇匀，使沉淀复溶于正丁醇，蒸出的甲醇回收处理，超声20min，离心8000r/min 10min，取上清液，40℃烘干过夜，加甲醇复溶，定容至10mL，得到待测液。
吸取0.1mL于具塞试管中，加入新鲜配制的50mg/mL香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀，以相应的的试剂作为空白对照组，于60℃水浴加热15min，取出后流水冷却5min，再各加入冰醋酸5mL，震荡摇匀，测量其在544nm处的吸光度，实验重复三次。每个样品取3个样，测出吸光度值，取平均值，根据标准回归曲线计算浓度。
3)HPLC检测发酵后的人参单体皂苷含量
高效液相色谱条件：进样量为10μL；层析柱为Symmetry C18柱(4.6×250nm，Waters)；梯度洗脱40-100％乙腈水；时间为30min；波长203nm；30min后设定100％乙腈洗10min，再用40％乙腈水洗10min。
HPLC检测标准样品：用洗净烘干后的针头吸取0.7mL待测液，从过滤头打入到HPLC检测小瓶子中。
HPLC检测发酵处理后的样品：检测样品即为人参总皂苷的待测液，用洗净烘干后的针头吸取0.7mL待测液，通过过滤头打入到HPLC检测小瓶子中。
首先，测量了对照组的人参须和人参根在544nm处的吸光度值分别为0.452和0.483，将其代入绘制的标准回归方程中，经过处理数据后，测得未发酵的人参须和人参根中的总皂苷含量为37.24mg/g和39.77mg/g。
同样对所测样品数据进行处理，所得结果如下表2所示。通过对比观察可知，经过蛹虫草固体、液体发酵8天或者28天后的人参须和人参根的基底中的总皂苷含量低于发酵前。
表2样品发酵后人参总皂苷含量数据
首先，使用HPLC方法测量了对照组的人参须的Rg1、Re、Rg3、CK含量为1.67mg/g、2.75mg/g、0mg/g、0.01mg/g；人参根的Rg1、Re、Rg3、CK含量为1.87mg/g、2.89mg/g、0mg/g、0.01mg/g。根据如下表3分析来看，Rg3、CK在发酵前含量极少或者没有，但是在发酵过后均增加，Rg3、CK都是稀有人参皂苷，通过微生物转化法而形成。用蛹虫草固体发酵人参须后，Rg3含量可高达0.27mg/g；蛹虫草固体发酵人参须后，CK含量可达0.68mg/g。
发酵人参经硅胶柱层析分离纯化得稀有人参皂苷，经HPLC检测，稀有人参皂苷Rg3和CK的含量达680mg/g。
表3样品发酵后人参单体皂苷含量数据
蛹虫草液体发酵人参根28天后多糖含量为145.41mg/g，
蛹虫草发酵人参后的多肽含量也高于发酵前，蛹虫草是在发酵第21天达到最大值，81.73mg/g。
稀有人参皂苷Rg3、CK在发酵前含量极少或者没有，但是在发酵过后均增加，说明此发酵方法可以有效增加稀有人参皂苷含量。
8.检测发酵后的人参多肽含量
标准曲线制备：取1mg/mL的BSA溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1mL加到有刻度的试管中，再加入0.9、0.7、0.5、0.3、0.1、0mL Tris-HCl缓冲液，再各加入已经制备好的考马斯亮蓝G-250染色液5mL，以相应的试剂作为空白对照组，摇匀，放置2min后，测量在595nm处测量吸光度。每个浓度取3个样，以BSA浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程：Y＝1.139X+0.0131，R2＝0.9993。
首先，测量了对照组的人参须和人参根在595nm处的吸光度值分别为0.582和0.576，将其代入绘制的标准回归方程中，经过处理数据后，测得未发酵的人参须和人参根中的多肽含量为49.95mg/g和49.42mg/g。
同样对所测样品数据进行处理，所得结果如下表4所示。通过对比观察可知，经过蛹虫草固体、液体发酵后的人参须和人参根的基底中的多肽含量明显高于发酵前。蛹虫草发酵的整体趋势为多肽含量先增再降，在第21天达到最高，其中用蛹虫草固体发酵人参根后基底多肽含量高达81.73mg/g。从整体来看，在相同发酵温度、pH值、发酵时间等因素相同的情况下，发酵后人参根中的多肽含量高于人参须中的多肽含量；液体发酵人参效果比固体发酵好；第28天的多肽含量虽有所下降，但是也比发酵前高。
表4样品发酵后多肽含量数据
Claims (3)
1.一种用蛹虫草发酵人参的方法，其特征在于，包括：
制备人参须和人参根基底；蛹虫草发酵人参；
所述制备人参须和人参根基底是将人参须和人参根置于容器中并密封，121℃高温灭菌20min后冷却到室温；
所述蛹虫草发酵人参包括蛹虫草固体发酵人参和蛹虫草液体发酵人参。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛹虫草固体发酵人参是将固体培养基培养好的蛹虫草切成小块，分别接种于人参须和人参根基底中，封口，充分摇匀，22℃培养，每天振荡摇匀。
3.依据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛹虫草液体发酵人参将培养好的蛹虫草液体培养基倒入人参须和人参根基底中，封口，充分摇匀，22℃培养，每天振荡摇匀。
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