CN101177665B - 一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法。本发明方法采用筛选的菌株蛹虫草COB201、CGMCC No.1823进行优化培养，得到高含量虫草素的北冬虫夏草，经检测产品中虫草素含量达到1.7％，本发明方法简单，适于规模型的工业化生产。
Description
技术领域：
本发明属于食品技术领域。具体涉及一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法。
背景技术：
冬虫夏草为中外驰名的珍贵中草药，其主要成分为：虫草酸、虫草素、虫草多糖以及抗衰老、抗恶性肿瘤的活性物质等，具有滋肺补肾、益精定喘、扩展血管、降低血压、抗病毒等多种功效。于是冬虫夏草需求量不断增加，有限的天然资源，日趋枯竭，且人工栽培不易成功。
北虫草，又称北冬虫夏草。北虫草的药用成分及含量和药用价值可与冬虫夏草媲美，其中虫草素含量为冬虫夏草的3-5倍，其它主要成分的含量多数高于或相当于冬虫夏草。北虫草可以人工栽培，培养基的原料主要为大米。本发明通过对北虫草菌株的筛选，得到蛹虫草COB201，其虫草素含量平均为1.4％，最高可达1.7％。目前，其他北冬虫夏草菌株虫草素含量为0.5-0.7％，天然虫草中虫草素含量约为0.2％。关于高含量虫草素的北冬虫夏草，因各种原因尚无工业化生产。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于研究设计高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法。
本发明人经过长期研究，筛选到能用于工业化生产制备高含量虫草素的北冬虫夏草的菌株。
本发明所涉及的北冬虫夏草菌株是从沈阳棋盘山上的野生北冬虫夏草中分离驯化出来的。从棋盘山上采集来的野生北冬虫夏草先用75％的酒精清洗，再用1％HgCl2溶液浸泡2min，然后用无菌水洗4次。清洗干净的野生北冬虫夏草进行北虫草孢子分离，进而分离得到纯的菌株，经三个世代的培养驯化，筛选出虫草素含量较高的COB201株菌。该菌株为：虫草属菌种，蛹虫草(蛹虫草拟青霉)Cordyceps militaris。由上海高博特生物保健品有限公司筛选得到。菌种培养条件：PDA马铃薯葡萄糖琼脂培养基，避光温度20℃±1℃。
北冬虫夏草菌株COB201经北京微生物研究所进行菌种鉴定和毒力试验，鉴定为蛹虫草拟青霉，该菌株作为一个新的北冬虫夏草株已于2006年9月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。(地址：北京市海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所)。保藏号CGMCC No.1823，虫草属菌种，蛹虫草(蛹虫草拟青霉)Cordyceps militaris。
本发明提供了一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法
本发明方法包括下列步骤：
(1)菌种制备：从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，蛹虫草拟青霉，CGMCC No.1823接入改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，20℃±1℃，避光培养10-12天，再接入原种培养基中进行培养，20℃±1℃，摇床培养5天，培养好的北冬虫夏草菌液放入冰箱，备用；
改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方，每1000ml：
土豆190-210g 蔗糖19-21g 琼脂19-21g
加水补足1000ml
原种培养基配方，每1000ml：
土豆190-210g 蔗糖9-11g 蛋白胨0.9-1.1g 胡萝卜9-11g 洋葱9-11g 蘑菇9-11g 鸡蛋4-6g 明矾0.04-0.06g 碳酸氢钠0.9-1.1g加水补足1000ml
(2)配料装瓶
培养瓶体积为255ml，每个培养瓶中加入大米24g，水32ml，混匀后上盖，准备灭菌；
(3)灭菌
将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121℃下，高压蒸汽灭菌30分钟。冷却后，取出准备接种；
(4)接种
将步骤(1)里培养好的原种液，按每个培养瓶中加入2.5ml的原种液进行接种；
(5)培养
接好种的北虫草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度20℃±1℃，湿度控制在65％-95％，每天光照9小时，光照强度为1500lx-3500lx，每天通风1小时以上。培养45-60天，待北冬虫夏草成熟后(直径2mm，长8cm)，即可进行检验和包装成品。
本发明产品的检测结果
北冬虫夏草中腺苷和虫草素的检测方法
1.原理
虫草素和腺苷的酸碱性不同以及结构差异，导致他们与柱内载体吸附能力的不同，同时利用缓冲溶液加大虫草素和腺苷的洗脱时间差，从而达到分离的目的。腺苷在256nm处有最大吸收，虫草素在此波长接近最大吸收，且吸收值与浓度呈线形关系。
2.试剂
2.1磷酸二氢钾(分析纯)、乙醇(优级纯)、甲醇(优级纯)、腺苷标准品、虫草素标准品、双蒸水
2.2溶液的配制
腺苷标准溶液的配制：精确称取腺苷标准品0.0100g，加水溶解并定容到50ml，放置冰箱，备用。
虫草素标准溶液的配制：精密称取虫草素标准4.2mg，加水溶解并定容到100ml，放置冰箱，备用。
0.01mol/L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾1.3609g，加双蒸水溶解，定容至1000ml。
3.仪器
高效液相色谱仪、超声波清洗器、离心机
4.分析步骤
4.1样品溶液的制备
精密称取100目虫草粉0.2g，于50ml三角烧瓶中，加20ml提取液，超声提取15分钟，3000rpm离心5分钟，残渣重复操作一次，合并滤液，定容至50ml，再吸取5ml定容到100ml。
4.2色谱柱条件：
色谱柱：C18柱 4.6×150mm，5μm 柱温：室温
紫外检测器：检测波长256nm 流动相：甲醇：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液＝10∶90
流速：1.0mL/min
4.3测定
取20μL标准溶液和试样溶液注入色谱柱，以保留时间定性，以峰面积比较定量。
4.4标准曲线的制备
腺苷标准溶液：分别配制浓度为0.200、1.00、2.00、5.00、10.00μg/ml腺苷标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析，以峰面积对浓度做标准曲线。
虫草素标准曲线：分别配制浓度为0.42、1.005、5.025、10.050、15.075μg/ml腺苷标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析，以峰面积对浓度做标准曲线。
5.结果计算A＝峰面积/100
虫草素％＝(0.0017A+0.0142)*20*50/1000/(M*1000)*100
本发明方法采用筛选的菌株蛹虫草COB201、CGMCC No.1823进行优化培养，得到高含量虫草素的北冬虫夏草，经检测产品中虫草素含量达到1.7％，本发明方法简单，适于规模型的工业化生产。
具体实施方式
实施例一
(改良PDA培养基)：
土豆190g
蔗糖21g
琼脂20g
加水补足1000ml
从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，接入改良PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基中，20℃±1℃，避光培养10-12天，即得到原种液。
(原种培养基)：
土豆200g
蔗糖10g
蛋白胨1.0g
胡萝卜10g
洋葱10g
蘑菇10g
鸡蛋5g
明矾0.05g
碳酸氢钠1.0g
加水补足1000ml
每个培养瓶中加入大米24g，水32ml，混匀后上盖，灭菌；按每个培养瓶中加入2.5ml的原种液进行接种。接好种的北虫草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度20℃±1℃，湿度控制在65％-95％，每天光照9小时，光照强度为1500lx-3500lx，每天通风1小时以上。培养45-60天，待北冬虫夏草成熟后(直径2mm，长8cm)，即可进行检验和包装成品。经检测，虫草素含量为1.7％。
实施例二
(改良PDA培养基)：
土豆200g
蔗糖20g
琼脂20g
加水补足1000ml
从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，接入改良PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基中，20℃±1℃，避光培养10-12天，即得到原种液。
(原种培养基)：
土豆204g
蔗糖9g
蛋白胨1.0g
胡萝卜9g
洋葱9g
蘑菇9g
鸡蛋5g
明矾0.05g
碳酸氢钠1.0g
加水补足1000ml
每个培养瓶中加入大米24g，水32ml，混匀后上盖，灭菌；按每个培养瓶中加入2.5ml的原种液进行接种。接好种的北虫草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度20℃±1℃，湿度控制在65％-95％，每天光照9小时，光照强度为1500lx-3500lx，每天通风1小时以上。培养45-60天，待北冬虫夏草成熟后(直径2mm，长8cm)，即可进行检验和包装成品。经检测，虫草素含量为1.5％。
实施例三
(改良PDA培养基)：
土豆190g
蔗糖21g
琼脂20g
加水补足1000ml
从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，接入改良PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基中，20℃±1℃，避光培养10-12天，即得到原种液。
(原种培养基)：
土豆196g
蔗糖11g
蛋白胨1.0g
胡萝卜11g
洋葱11g
蘑菇11g
鸡蛋5g
明矾0.05g
碳酸氢钠1.0g
加水补足1000ml
每个培养瓶中加入大米24g，水32ml，混匀后上盖，灭菌；按每个培养瓶中加入2.5ml的原种液进行接种。接好种的北虫草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度20℃±1℃，湿度控制在65％-95％，每天光照9小时，光照强度为1500lx-3500lx，每天通风1小时以上。培养45-60天，待北冬虫夏草成熟后(直径2mm，长8cm)，即可进行检验和包装成品。经检测，虫草素含量为1.4％。
Claims (3)
1.一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)菌种制备：从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，蛹虫草(Cordyceps militaris)COB201 CGMCC No.1823，接入改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，20℃±1℃，避光培养10-12天，再接入原种培养基中进行培养，20℃±1℃，摇床培养5天，培养好的北冬虫夏草菌液放入冰箱，备用；
所述改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方，每1000ml：
土豆190-210g 蔗糖19-21g 琼脂19-21g
加水补足1000ml；
所述原种培养基配方，每1000ml：
土豆190-210g 蔗糖9-11g 蛋白胨0.9-1.1g 胡萝卜9-11g 洋葱9-11g 蘑菇9-11g 鸡蛋4-6g 明矾0.04-0.06g 碳酸氢钠0.9-1.1g
加水补足1000ml；
(2)配料装瓶
培养瓶体积为255ml，每个培养瓶中加入大米24g，水32ml，混匀后上盖，准备灭菌；
(3)灭菌
将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121℃下，高压蒸汽灭菌30分钟，冷却后，取出准备接种；
(4)接种
将步骤(1)里培养好的原种液，按每个培养瓶中加入2.5ml的北冬虫夏草菌液进行接种；
(5)培养
接好种的北虫草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度20℃±1℃，湿度控制在65％-95％，每天光照9小时，光照强度为1500lx-3500]x，每天通风1小时以上，培养45-60天，待北冬虫夏草成熟后直径2mm，长8cm时，即可进行检验和包装成品。
2.根据权利要求1所述的一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法，其特征在于该方法制得的北冬虫夏草中，虫草素含量为1.4％-1.7％。
3.一种北冬虫夏草菌株蛹虫草(Cordyceps militaris)COB201 CGMCC No.1823，其特征在于该菌株为：虫草属菌种，蛹虫草拟青霉。
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