CN112042469A - 一种含有中药药渣的食用菌发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食用菌的固体发酵培养基，它包括质量百分比80%的药渣，15%麸皮，3%棉籽壳，1%蔗糖，1%二水硫酸钙；发酵培养基的含水量60%。另外本发明将灵芝、平菇、云芝分别接种于80%药渣制成的固体发酵培养基，以玉米芯培养基为对照，观察菌丝生长情况，发明结果表明，不同药渣对灵芝、平菇、云芝的生长均有不同程度的促进作用，其中产后康膏的药渣对三种真菌的促进作用最为明显。

Description

一种含有中药药渣的食用菌发酵培养基

技术领域

本发明涉及一种食用菌发酵培养基，具体涉及采用中药药渣为主要原料的食用菌发酵培养基。

背景技术

中药药渣含有大量微量元素、蛋白质和纤维素，同时还含有一定量的生物活性成分，提取后的中药药渣废弃后不但污染环境，且造成资源浪费。

传统的食用菌栽培基质主要以棉籽壳、麸皮、玉米芯等为原料，而中药渣中富含纤维素以及粗蛋白等组分，可供微生物生长用的碳源、氮源、生长因子、无机盐等营养物质，可用于栽培食用菌。现代研究指出白芍、柴胡、甘草、香附、延胡索、枳壳等混合药渣为培养基质对平菇菌丝培养期和出菇期的影响，结果表明药渣基质栽培平菇，菌丝长势良好，均能正常出菇，无病变无畸形，生物学效率高，为中药渣生产平菇提供了依据。但是也有报道中药药渣含有特殊的生物碱或酸性成分不利于食用菌的生长。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，充分利用中药资源，以中药或中药复方提取后的药渣为主要材料制备得到培养基，发明结果表明，本发明提供的含有中药药渣的培养基对食用菌具有很好的促进生长作用，特别是对灵芝、云芝、猴头菇、大球盖菇具有很好的促生长的作用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种食用菌的发酵培养基，它包括含有药渣的PDA培养基。

一种食用菌的固体发酵培养基，它包括药渣，麸皮，棉籽壳，蔗糖，二水硫酸钙。

作为优选方案，以上所述的一种食用菌的固体发酵培养基，它包括质量百分比80％的药渣，15％麸皮，3％棉籽壳，1％蔗糖，1％二水硫酸钙；发酵培养基的含水量60％；

作为优选方案，以上所述的一种食用菌的固体发酵培养基，所述的药渣为丹参药渣、人参桂圆膏提取后的药渣、产后康膏提取后的药渣、白芷玫瑰阿胶膏提取后的药渣。

作为优选方案，以上所述的一种食用菌的固体发酵培养基，所述的食用菌为灵芝、云芝、猴头菇、大球盖菇、长根菇、平菇食用菌。

作为优选方案，以上所述的一种食用菌的固体发酵培养基，所述的丹参药渣为水提后的药渣或乙醇提取后的药渣；

人参桂圆膏由龙眼肉、枸杞、干制红枣、茯苓、人参、薏苡仁、山药、贡菊药材制成，由江苏海昇药业有限公司生产。

产后康膏由黄芪、炒党参、炒当归、丹参、益母草、焦神曲、陈皮、制香附、乌药、木香、生地黄、熟地黄、砂仁、炒杜仲、泽泻、炙甘草、炒白芍、焦山楂、炒谷芽、炒麦芽药材制成，由江苏海昇药业有限公司生产。

白芷玫瑰阿胶由膏枸杞、红枣、山药、龙眼肉、阿胶、玫瑰花、人参、白芷、玉竹药材制成，由江苏海昇药业有限公司生产。

有益效果：

本发明发明发现，中药药渣中含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、多糖、蛋白和多种微量元素，可以为真菌生长提供足够的营养成分。

本发明提供的中药药渣在10-30％的含量下，对5种真菌的生长均有促进作用，其中药渣对灵芝、平菇、云芝的生长促进作用最为明显。

另外本发明将灵芝、平菇、云芝分别接种于80％药渣制成的固体发酵培养基，以玉米芯培养基为对照，观察菌丝生长情况，发明结果表明，不同药渣对灵芝、平菇、云芝的生长均有不同程度的促进作用，其中产后康膏的药渣对三种真菌的促进作用最为明显。

附图说明

图1为灵芝在各药性平板上的生长情况柱状图。

图2为平菇在各药性平板上的生长情况柱状图。

图3为云芝在各药性平板上的生长情况柱状图。

图4为长根菇在各药性平板上的生长情况柱状图。

图5为大球盖菇在各药性平板上的生长情况柱状图。

图6为在30％产后康膏平板上生长的5种真菌的菌落图。

图7为在固体培养基中生长的3种真菌的状态图。

图8为灵芝在固体发酵培养基中的生长情况的柱状图。

图9为平菇在固体发酵培养基中的生长情况的柱状图。

图10为云芝在固体发酵培养基中的生长情况的柱状图。

其中图1～5中柱状图中每组依次为PDA、10％DSDF、20％DSDF、30％DSDF、10％RSG、20％RSG、30％RSG、10％BZG、20％BZG、30％BZG、10％CHKG、20％CHKG、30％CHKG；图8～10中柱状图中每组依次为DSDF、RSG、BZG、CHKG和玉米芯。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、材料与方法

1.1菌株和药渣

灵芝、云芝、猴头菇、大球盖菇、长根菇、平菇均为本发明室保藏。

4种中药渣均采用水浸提后的中药药渣，分别为丹参单方(DSDF)、人参桂圆膏(RSG)、产后康膏(CHKG)、白芷玫瑰阿胶膏(BZG)，其主要成分及来源如表1所示。

表1药渣成分及来源

1.2仪器与试剂

1.2.1发明仪器

表2实验仪器

1.2.2发明试剂

表3实验试剂

1.2.3培养基

PDA固体培养基：马铃薯200g，去皮切块，加入1000ml水煮30min，过滤除去马铃薯渣，滤液中加入20g葡萄糖，2.5g琼脂粉，定容至1L。115℃灭菌30min。

PDA液体培养基：马铃薯200g，去皮切块，加入1000ml水煮30min，过滤除去马铃薯渣，滤液中加入20g葡萄糖，定容至1L，115℃灭菌30min。

10％药性培养基：在PDA固体培养基中添加10％各药渣(w/v)。

20％药性培养基：在PDA固体培养基中添加20％各药渣(w/v)。

30％药性培养基：在PDA固体培养基中添加30％各药渣(w/v)。

固体发酵培养基：80％药渣(空白用玉米芯代替)，15％麸皮，3％棉籽壳，1％蔗糖，1％二水硫酸钙，含水量60％。115℃灭菌30min。

1.2.4菌株培养

1.2.4.1菌株活化

用灭过菌的镊子从斜面上夹出一块菌丝至PDA固体培养基，28℃静置培养箱培养7d，至菌丝铺满平板。

1.2.4.2药性平板培养

用灭过菌的打孔器取一块菌块至不同浓度的药性培养基，28℃静置培养。

1.2.4.3发酵培养

用灭过菌的打孔器(直径6mm)取一块菌块平铺于PDA液体培养基，28℃静置培养7d，至菌丝铺满。

用灭过菌的组织粉碎器磨碎菌丝，倒入新的PDA液体培养基，28℃，150r振荡培养5天。

待真菌形成菌球，接种于固体发酵培养基，接种量10％(w/v)。28℃静置培养。

1.2.5分析检测方法

1.2.5.1药渣中纤维素、半纤维素、木质素检测

本发明采用美国国家可再生能源发明室(NREL)方法测量药渣中纤维素、半纤维素及木质素的含量。药渣粉碎过40目筛，烘干备用。

1)糖混合标准溶液的配制

准确称取葡萄糖、木糖和阿拉伯糖各100mg,用0.005M H2SO4溶解并定容于100mL容量瓶中,配制成1.0g/L贮备液,逐级稀释备用。

2)色谱条件

色谱分离柱:AminexHPX-87H(300×7.8mm，5μm)，色谱采用的是安捷伦公司的Agilent Q-TOF6540，RI示差检测器，流动相：0.005M H2SO4，进样体积：20μL，流动相流速:0.6mL/min，柱温:65℃。

3)测量方法

取0.5g药渣，用200mL乙醇于95℃水浴中索氏抽提并风干，去除药渣表面的树脂、色素等。将试样转移至10mL离心管，加入3mL 72％的浓硫酸水解1h。将浓酸水解液转移至100mL烧杯中，并稀释酸至4％的，所加蒸馏水(含洗液)共97mL，121℃水解45min。水解完成后，用带砂芯的漏斗抽滤，取5mL滤液，调节pH至2，用HPLC测单糖(葡萄糖，木糖，阿拉伯糖)含量。滤渣洗至中性，烘干至恒重计样品和漏斗总质量为m1，550℃灰化后得灰分与漏斗总质量为m2。

4)计算方法

纤维素％＝(Cglu×100×10-3)/0.5×100％

半纤维素％＝[(Cxyl+Cara)×100×10-3]/0.5×100％

酸不溶木质素％＝(m1-m2)/0.5×100％

式中：

m1：酸水解后药渣和漏斗总质量(干重)；m2：灰化后灰分和漏斗总质量

Cglu：葡萄糖含量；Cxyl：木糖含量；Cara：阿拉伯糖含量

1.2.5.2药渣中多糖含量的检测

利用DNS法测药渣中可溶性多糖的含量[122]。药渣称20g/L，121℃保温20min。取滤液测多糖含量。

1)葡萄糖标准溶液配置

精确称取葡萄糖100mg，溶于100mL蒸馏水并定容，配成浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液，置于4℃冰箱中储存备用。

2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂

精确称取DNS6.3g，配置2M NaOH溶液，取262mL该溶液与DNS一起加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入结晶酚5g和亚硫酸钠5g，搅拌至完全溶解，溶液冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，置于4℃储存备用。

3)DNS法标准曲线的制作

取7支10ml具塞试管，分别加入葡萄糖标准溶液、纯水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应溶液，如表4所示。

表4葡萄糖标准曲线制作

将各试管于漩涡震荡器上震荡1min后在水浴中煮沸加热5min，冷却至室温后，用去离子水定容至10ml并混匀，在540nm下测其吸光值。用0号管做空白对照，测出其他试管的吸光值。以吸光值为横坐标，葡萄糖浓度(mg/mL)为纵坐标，即可得到葡萄糖浓度与吸光值之间的关系的标准曲线。

2.2.5.3药渣中可溶性蛋白含量的检测

利用Brandford法测药渣中水溶性蛋白的含量[123]。称取药渣20g/L，121℃保温20min。取滤液测蛋白含量。

1)配制考马斯亮蓝溶液

精确称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95％的乙醇中并定容，再加入100mL85％(v/v)的磷酸，最后用蒸馏水稀释定容至1L，滤纸过滤后可即可使用。

2)配置BSA母液

0.9％的生理盐水的配制：精确称取0.9gNaCl溶于100mL蒸馏水中。精确称取0.01g的标准牛血清蛋白(BSA)，溶于100mL生理盐水溶液中，配制成0.1g/L的BSA母液。

3)蛋白标准曲线的制作：

取10支试管，按表5数据在每个试管中分别加入各试剂。振荡混匀，反应10min。以第0管为空白，在595nm波长下测定其吸光度，以吸光值为横坐标，以蛋白质含量(μg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。

表5不同浓度的牛血清蛋白溶液的配制

4)样品的测定

将样品溶液蛋白浓度调整到测定范围，在比色皿中加入2mL考马斯亮蓝，再加入样品500μL，混匀反应10min，用酶标仪测定595nm波长处吸光值。计算各样品溶液中蛋白的浓度，并计算其蛋白含量。

1.2.5.4多种真菌对不同药渣的敏感性

每天观察多种真菌在不同药渣平板上的生长情况，测量菌丝长度，分析长势。

1.2.5.5真菌在固体发酵体系中的生长情况

每天观察真菌在固体发酵体系中的生长情况，测量菌丝长度，分析长势。

2.3结果与讨论

2.3.1 4种药渣中纤维素、半纤维素、木质素的含量

植物源的药渣中含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、多糖、蛋白和多种微量元素，可以为真菌生长提供足够的营养成分。为了检测药渣中三大素的含量，采用美国国家可再生能源发明室(NREL)方法对其处理后采用HPLC进行检测。经检测，药渣中三大素的含量如表6所示四种药渣中酸不溶木质素均含量较高，适宜真菌的生长。

表6 4种药渣中纤维素、半纤维素和木质素含量

2.3.2 4种药渣中可溶性还原糖和蛋白的含量

可溶性还原糖和蛋白组分易于吸收和代谢，是微生物的快速利用营养物，其含量对于评价中药渣的应用方向具有重要意义。为了解药渣中还原糖和蛋白含量，对其进行了检测。各药渣中还原糖及可溶性蛋白含量如表7所示。其中丹参单方、人参桂圆膏和白芷玫瑰阿胶膏中还原糖含量相对较高，可达30mg/g，但4种药渣中蛋白含量均较低(<10μg/g)，证明一次水提对药材中的可溶性还原糖提取率较低，而对蛋白提取率较高，导致药渣中还原糖含量较高而蛋白含量较低。由于真菌生长过程对氮源要求较低，对碳源含量要求较高，4种药渣适合真菌生长。

表7各药渣中可溶性还原糖和蛋白含量

2.3.3多种真菌对不同药渣的敏感性

将4种药渣分别制成浓度10％、20％、30％的药性平板，将5种真菌分别接种于药性平板，以PDA为对照，观察药渣对不同真菌是否有抑制作用，结果如图1-5所示，4种药渣在10-30％的含量下，对5种真菌的生长均有促进作用，5种真菌生长形态对比如图6所示。药渣对灵芝、平菇、云芝的生长促进作用最为明显。由于长根菇和大球盖菇相对其他菌株而言，生长速度较慢，影响发明进展，所以后续发明采用灵芝、平菇、云芝三种生长周期较短的真菌作为发酵菌株。

2.3.4不同真菌在固体发酵基质中的生长情况

将灵芝、平菇、云芝分别接种于80％药渣制成的固体发酵培养基，以玉米芯培养基为对照，观察菌丝生长情况，如图7所示(①：丹参单方培养基，②：人参桂圆膏培养基，③：白芷玫瑰阿胶膏培养基，④产后康膏培养基，⑤玉米芯对照。)，记录菌丝生长情况。如图8～10所示，与空白对照(玉米芯培养基)相比，不同药渣对灵芝、平菇、云芝的生长均有不同程度的促进作用。本发明中丹参、人参桂圆膏药渣、白芷玫瑰阿胶膏药渣和产后康膏药渣所含的可溶性还原糖、蛋白含量、纤维素、半纤维素和木质素含量均不同，但是综合实验发现其中产后康膏对三种真菌的促进作用最为明显，取得更优的技术进步。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种食用菌的发酵培养基，其特征在于，它包括含有药渣的PDA培养基。

2.一种食用菌的固体发酵培养基，其特征在于，它包括药渣，麸皮，棉籽壳，蔗糖，二水硫酸钙。

3.根据权利要求2所述的一种食用菌的固体发酵培养基，其特征在于，它包括质量百分比80%的药渣，15%麸皮，3%棉籽壳，1%蔗糖，1%二水硫酸钙；发酵培养基的含水量60%。

4.根据权利要求1~3任一项所述的一种食用菌的固体发酵培养基，其特征在于，所述的药渣为丹参药渣、人参桂圆膏提取后的药渣、产后康膏提取后的药渣、白芷玫瑰阿胶膏提取后的药渣。

5.根据权利要求4所述的一种食用菌的固体发酵培养基，其特征在于，所述的食用菌为灵芝、云芝、猴头菇、大球盖菇、长根菇、平菇食用菌。

6.根据权利要求4所述的一种食用菌的固体发酵培养基，其特征在于，所述的丹参药渣为水提后的药渣或乙醇提取后的药渣；

人参桂圆膏由龙眼肉、枸杞、干制红枣、茯苓、人参、薏苡仁、山药、贡菊药材制成；

产后康膏由黄芪、炒党参、炒当归、丹参、益母草、焦神曲 、陈皮、制香附、乌药、木香、生地黄、熟地黄、砂仁、炒杜仲、泽泻、炙甘草、炒白芍、焦山楂、炒谷芽、炒麦芽药材制成；

白芷玫瑰阿胶由膏枸杞、红枣、山药、龙眼肉、阿胶、玫瑰花、人参、白芷、玉竹药材制成。

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