CN108157579A - 一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法，包括如下步骤：S1、原料预处理：选取碎米荠干粉作为生产原料，经乙醇浸泡脱色，过滤、去除杂质，再经纤维素酶与果胶酶的混合物预处理后获得酶解产物、备用；S2、双酶复合酶解：向经过步骤S1预处理后的上清液中先加入碱性蛋白酶酶解，灭酶、冷却至50℃，用盐酸调节pH至，加入中性蛋白酶，酶解，获得酶解液；S3、灭酶、分离肽液：将酶解液煮沸，使酶灭活，静置，下层即为清亮透明的肽液。其优点是：以堇叶碎米荠为核心原料，使用纤维素酶与果胶酶在酶解前进行预处理，有效去除碎米荠中杂质，提高碎米荠的蛋白提取率；再用双酶分步酶解法酶解，硒多肽含量较高，分子量较小。

Description

一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法

技术领域

本发明生物技术领域，具体地说是一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法。

背景技术

硒是人体必需的微量元素，具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力、防癌抗癌等多种功能。目前，已经证实硒缺乏与克山病和大骨节病的发生紧密相关。此外，国内外大量流行病学研究发现硒缺乏与心血管疾病、肿瘤的发生发展以及肝脏疾病有潜在的相关性。硒的形态常分为有机硒和无机硒。无机硒包括亚硒酸盐、硒酸盐、硒化物和元素硒，有机硒包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代半胱氨酸、酵母硒、硒蛋白等。目前市场上的补硒制剂多以无机硒为主，无机硒超过一定剂量对身体会产生明显的毒性，导致头发与指甲脱落及肝肾毒性。而第二代补硒制剂以酵母硒为主的有机硒其毒性较无机硒明显降低，但是由于其主要成分是硒代蛋氨酸，含有较高的嘌呤，长期服用具有痛风的潜在风险。植物硒蛋白作为新一代的补硒产品具有明显的安全性优势和功能效果，然而其作为生物大分子在体内需要进行消化才能吸收，使其生物利用度收到限制。因此如何找到活性高、毒性低、吸收效率强的小分子补硒制剂成为目前研究的热点和硒产业升级急需解决的问题。大量的研究表明小分子多肽可以直接被人体肠道吸收，且比蛋白质和氨基酸的吸收效果更好。一是，克服了蛋白质分子的生物利用度问题，二是克服了补充氨基酸对肠道渗透压改变而引起的副作用问题。由此可见，对于硒蛋白来讲，小分子硒多肽更易被吸收利用。

堇叶碎米荠是十字花科碎米荠属植物，一年生或多年生草本，是一种天然的野菜资源。因产于有“世界硒都”之称的湖北省恩施市，且具有超富集硒的作用，可将无机硒转化为有机硒，而闻名遐迩，故也称之为恩施堇叶碎米荠，是恩施特色的聚硒植物资源。

堇叶碎米荠是恩施州地方百姓长期习用的蔬菜，它具有清热祛湿，健胃止泻、活血化痰之功效，民间多用于改善妇女经血不调，小儿咳嗽，腹泻等。由于其鲜嫩美味，营养丰富，有益健康，因此是原产地居民餐桌上非常珍惜的一种美味佳肴。

堇叶碎米荠含有丰富的水分、蛋白质、可溶性糖、氨基酸、维生素、纤维素以及多种人体必须的微量元素，其中蛋白质含量高达17-21.5％，含有17种氨基酸，必须氨基酸含量可达7.90-8.03％，钙磷等人体必须的常量元素含量高达2.87-3.42％、0.35-0.43％。堇叶碎米荠含有丰富的叶绿素，多酚类物质、维生素C，特别是堇叶碎米荠还具有超强的富硒能力，硒与碎米荠中有效成份能够有机结合，野生条件下，在富硒土壤中生长，其叶中的硒含量可达300mg/kg以上，使其在清除DPPH超氧自由基、羟自由基，抑制脂质过氧化方面有很好的能力和表现，是一种高效、优良的天然有机硒源，对人体营养与健康发挥重要的功能，它不仅是一种珍稀野生蔬菜，更是一种不可多得的功能性食品和硒补充剂，开发利用价值很大。

鉴于堇叶碎米荠较高的蛋白质含量和超聚硒能力及特殊的功能，因此对其活性硒蛋白和硒多肽的分离制备，将大大促进其应用和产业化进程，对整个硒产业的发展提升有更好的推动作用。而如何提高分离效率与有机硒含量，降低工业成本，是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明为了解决上述技术缺陷，提供可工业化生产、且碎米荠硒多肽提取率高的一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法。

一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法，包括如下步骤：

S1、原料预处理：选取蛋白含量在15％以上、且硒含量范围为1000-2000ug/g的碎米荠干粉作为生产原料，经乙醇浸泡脱色20-30min，过滤、去除杂质，再经纤维素酶与果胶酶的混合物预处理后获得酶解产物、备用；

优选地，步骤S1中，预处理具体方式如下：

S11、等比例称取纤维素酶与果胶酶后混合，然后将混合物置入去除杂质的原料中，获得混合液A；在PH为6.0的条件下酶解1h，再调节PH至7.0，加水，且使得此时获得的酶解产物与水按照1:20～1:40g/mL的比例混合，在45～55℃下提取3h，离心，收集上清液备用；

优选地，步骤S11中，去除杂质后的原料，先将碎米荠干粉与水按照1:20～1:40g/mL的比例混合，且在50℃条件下添加纤维素酶与果胶酶混合物，以获得混合液A；

优选地，步骤S11中，纤维素酶与果胶酶的总质量占混合液A质量的1％；

优选地，步骤S11中，4000rpm离心10min；

S12、向步骤S11的沉淀中加入0.1mol/L的NaOH溶液，且所述沉淀与NaOH溶液按照1:40g/mL的比例混合，45～55℃下提取3h，收集上清备用；

S13、分别将步骤S11、S12的上清液浓缩4倍，醇沉、静置过夜，离心后混合、获得酶解产物备用；

优选地，步骤S13中离心速度为4000rpm；

优选地，步骤S11、S12中，提取温度为50℃。

S2、双酶复合酶解：向经过步骤S1预处理后的上清液中先加入碱性蛋白酶酶解2～3h，灭酶、冷却至50℃，用盐酸调节pH至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，酶解2～3h，获得酶解液。

优选地，步骤S2中，碱性蛋白酶酶解反应在PH为8.5、55℃的条件下进行；

优选地，步骤S2中，

碱性蛋白酶、中性蛋白酶的加入量按照以下用量加入：即步骤S1中作为原料的碎米荠干粉内所含蛋白质与碱性蛋白酶、中性蛋白酶总体积的体积比为1:30。

优选地，步骤S2中，优选碱性蛋白酶、中性蛋白酶酶解时间均为2h；

S3、灭酶、分离肽液：将酶解液煮沸10min，使酶灭活，同时使汤液灭菌。然后静置30min，此时水解液分层，上层为未酶解的大分子变性蛋白和灭活的酶的浆状物，下层即为清亮透明的肽液。

将步骤S3获得的肽液经过进一步醇沉、上清液浓缩，喷雾干燥后即可获得植物硒肽粉。

本发明一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法，其优点是：

(1)、以高聚硒植物堇叶碎米荠为核心原料，使用纤维素酶与果胶酶在酶解前进行预处理，以有效去除碎米荠中杂质，提高碎米荠的蛋白提取率；

(2)、双酶分步酶解法酶解经过预处理后的原料，使得碎米荠中蛋白水解得较为完全，硒多肽含量较高，分子量较小；在且在加入碱性蛋白酶后，间隔加入中性蛋白酶使得水解更充分，以拿到更小的肽段；

(3)、本方法中，酶解条件，例如蛋白酶、温度、PH值等的选定，使得此方法适于工业化生产，致使多肽提取率在70％以上，多肽含量超过40％，并且获得分子量小于1000D的多肽产物占90％以上，总硒最高可达4400ppm,有机硒含量在95％以上。

附图说明

图1为实施例二中蛋白酶与提取率的关系图；

图2为实施例三中不同提取时间对碱性蛋白酶酶解多肽提取率的影响曲线图；

图3为实施例四中碎米荠干粉与水不同配比对多肽提取率的影响曲线图；

图4为实施例五中不同提取温度对提取率的影响曲线图；

图5为实施例六中不同pH对蛋白提取率的影响曲线图。

具体实施方式

以下就具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例一

S1、原料预处理：选取蛋白含量在15％以上、且硒含量为2000ug/g碎米荠干粉作为生产原料，经乙醇浸泡脱色20-30min，过滤、去除杂质,再经纤维素酶与果胶酶的混合物预处理后获得酶解产物、备用；

S11、等比例称取纤维素酶与果胶酶后混合，然后在50℃下将混合物置入去除杂质的原料中(去除杂质后的原料，先将碎米荠干粉与水按照1:20～1:40g/mL的比例混合，再置入纤维素酶与果胶酶混合物)，获得混合液A，使得纤维素酶与果胶酶的总质量占混合液A质量的1％；在PH为6.0的条件下酶解1h，再调节PH至7.0，加水，且使得此时获得的酶解产物与水按照1:20～1:40g/mL的比例混合，在50℃下提取3h，4000rpm离心10min，收集上清液备用；

S12、向步骤S11的沉淀中加入0.1mol/L的NaOH溶液，且所述沉淀与NaOH溶液按照1:40g/mL的比例混合，再于50℃下提取3h，收集上清备用；

S13、分别将步骤S11、S12的上清液浓缩4倍，醇沉、静置过夜，4000rpm离心后混合、获得酶解产物备用；

S2、双酶复合酶解：向经过步骤S1预处理后的酶解产物中先加入碱性蛋白酶，且在PH为8.5、55℃的条件下酶解3h，灭酶、冷却至50℃，用盐酸调节pH至7.0，加入中性蛋白酶，酶解3h，获得酶解液；且碱性蛋白酶、中性蛋白酶的加入量按照以下用量加入：即步骤S1中作为原料的碎米荠干粉内所含蛋白质与碱性蛋白酶、中性蛋白酶总体积的体积比为1:30；

S3、灭酶、分离肽液：将酶解液煮沸10min，使酶灭活，同时使汤液灭菌。然后静置30min，此时水解液分层，上层为未酶解的大分子变性蛋白和灭活的酶的浆状物，下层即为清亮透明的肽液。

实施例二

采用实施例一方案分别做三组试验，

与实施例一不同至之处在于：

A组，采用实施例一方式(即步骤S2中，单独使用碱性蛋白酶酶解，无后续的中性蛋白酶酶解过程)

B组，采用实施例一方式(即步骤S2中，单独使用中性蛋白酶酶解，无前序的碱性蛋白酶酶解过程)

C组，采用实施例一方式(即步骤S2中，单独使用酸性蛋白酶酶解，不使用碱性蛋白酶、碱性蛋白酶酶解)

随后，采用常规方法分别检测三组获得物质中碎米荠蛋白的量，经A组、B组、C组提取后，提取率分别为51.8％、47.0％，34.6％(如图1所示)，可知碎米荠蛋白在碱性蛋白酶中提取率最高。所以采用碱性蛋白酶提取碎米荠中的蛋白。

实施例三

与实施例一不同之处在于：

步骤S2中：碱性蛋白酶酶解时间依次分为1、2、3、4h四组进行实验，用以判断步骤S2中不同酶解时间对蛋白提取率的影响

提取结果如图2所示，在加入碱性蛋白酶1～2h之内，提取率随着时间的增加而迅速增加，2h后提取率逐步降低，因碱性蛋白酶的过度水解导致提取率降低，3h后提取率不变，因碱性蛋白酶逐渐失活所导致，因此优选酶解反应2h为最佳提取时间。

实施例四

与实施例一不同之处在于：

步骤S11中，去除杂质后的原料，将碎米荠干粉与水的比例分为5个(依次为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60g/mL)组进行试验，从而确定碎米荠干粉与水的最佳使用比例；

结果如图3所示：

碎米荠干粉与水的比例逐渐升高，提取率不断升高，升高速率逐渐变缓，因随着碎米荠干粉与水的比例的增加，碎米荠干粉流动性逐渐增加，体系分布均匀，有利于后期碱性蛋白酶与碎米荠干粉的接触，提取率不断增加，当碎米荠干粉与水的比例达到1:40后，碱性蛋白酶与碎米荠干粉的浓度降低，碱性蛋白酶与碎米荠干粉接触机率变小，提取率增加变缓，因此，优选碎米荠干粉与水的比例为1:40。

实施例五

与实施例一不同之处在于：

步骤S1中，两次提取温度相同，且将步骤S1中两次提取温度均依次、同时设置为30、40、50、60、70℃四组进行实验，以确定不同提取温度对实验后期提取率的影响；

结果如图4所示：

随着温度的逐渐升高，多肽的提取率也不断的提高，并在50℃时达到最高值，之后提取率下降，所以优选50℃为最佳提取温度。

实施例六

与实施例一不同之处在于：

比较步骤S2中碱性蛋白酶在不同PH条件下的试验结果，以判断碱性蛋白酶在不同pH环境下对蛋白提取率的影响；

结果如图5所示：

随着pH的增高，蛋白提取率逐渐增大，pH大于8.5后，提取率略有降低，因pH逐渐远离碱性蛋白酶的最适pH值，导致碱性蛋白酶活降低，所以优选8.5为最适pH。

实施例七

对实施例一获得的碎米荠蛋白肽分子量分布安装常规方法进行测定，如下表1所示：

表1双酶分步酶解得到碎米荠蛋白肽分子量分布表

	名称	时间	Mn	Mw	面积％
						1	>5000	13.305	5263	5269	0.18
2	5000-3000	13.561	3850	3938	0.33
						3	3000-2000	15.160	2358	2390	0.52
4	2000-1000	16.441	1274	1319	3.61
						5	1000-500	17.498	637	654	18.43
6	500-180	18.978	272	290	40.98
						7	<180	20.868	79	99	35.96

采用本发明方法使得分子量分布小于1000D的小分子肽段占据90％以上。根据国标测定肽含量在40％以上。

实施例八

对实施例一获得的产物中总硒含量及有机硒含量的测定，如下表2所示：

表二测定双酶分步法制备堇叶碎米荠多肽有机硒含量

根据湖北省地标有机硒的测定方法，测定双酶分布法制备堇叶碎米荠多肽硒含量，由表1可知，总硒最高可达4400ppm，有机硒含量在95％以上。

以上未详细说明的测定方法与仪器等为常规技术，再次不做赘述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高有机硒含量的堇叶碎米荠硒多肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤

S1、原料预处理：选取蛋白含量在15％以上、且硒含量范围为1000-2000ug/g的碎米荠干粉作为生产原料，经乙醇浸泡脱色20-30min，过滤、去除杂质，再经纤维素酶与果胶酶的混合物预处理后获得酶解产物、备用；

S2、双酶复合酶解：向经过步骤S1预处理后的酶解产物中先加入碱性蛋白酶酶解2～3h，灭酶、冷却至50℃，用盐酸调节pH至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，酶解2～3h，获得酶解液；

S3、灭酶、分离肽液：将酶解液煮沸10min，使酶灭活，同时使汤液灭菌，然后静置30min，此时水解液分层，上层为未酶解的大分子变性蛋白和灭活的酶的浆状物，下层即为清亮透明的肽液。

2.根据权利要求1所述，其特征在于：步骤S2中，碱性蛋白酶酶解反应在PH为8.5、55℃的条件下进行。

3.根据权利要求1所述，其特征在于：步骤S2中，碱性蛋白酶、中性蛋白酶的加入量按照以下用量加入：即步骤S1中作为原料的碎米荠干粉内所含蛋白质与碱性蛋白酶、中性蛋白酶总体积的体积比为1:30。

4.根据权利要求1所述，其特征在于：步骤S1中，预处理具体方式如下：

S11、等比例称取纤维素酶与果胶酶后混合，然后将混合物置入去除杂质后的原料中，获得混合液A；在PH为6.0的条件下酶解1h，再调节PH至7.0，加水，且使得此时获得的酶解产物与水按照1:20～1:40g/mL的比例混合，在45～55℃下提取3h，离心，收集上清液备用；

S12、向步骤S11的沉淀中加入0.1mol/L的NaOH溶液，且所述沉淀与NaOH溶液按照1:40g/mL的比例混合，45～55℃下提取3h，收集上清备用；

S13、分别将步骤S11、S12的上清液浓缩4倍，醇沉、静置过夜，离心后混合、获得酶解产物备用。

5.根据权利要求4所述，其特征在于：步骤S11中，去除杂质后的原料，先将碎米荠干粉与水按照1:20～1:40g/mL的比例混合，再在50℃条件下添加纤维素酶与果胶酶混合物，以获得混合液A。

6.根据权利要求4所述，其特征在于：步骤S11中，纤维素酶与果胶酶的总质量占混合液A质量的1％。

7.根据权利要求4所述，其特征在于：步骤S13中离心速度为4000rpm。