CN112458140A - 一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法和碎米荠硒多肽 - Google Patents

一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法和碎米荠硒多肽 Download PDF

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Abstract

本发明属于肽的制备领域，具体涉及一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法和碎米荠硒多肽。该方法包括：碎米荠蛋白粉的制备；固定化酶的构建；预酶解；超滤、补料；浓缩、干燥。本发明方法集反应、产品分离和酶回收再利用于一体，可以实现连续化操作。本发明通过固定化酶膜反应器连续酶解底物蛋白，可有选择性的移出反应产物，减少产物抑制现象，提高反应速率和底物转化率，通过膜的选择性，可以控制水解产物分子量大小；本发明方法获得的碎米荠硒多肽分子量集中分布在300～3000Da，水解度DH可到27％左右，比传统间歇酶解的DH值提高了8.4％。

Description

一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法和碎米荠硒多肽
技术领域
本发明属于肽的制备领域，更具体地，涉及一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法和碎米荠硒多肽。
背景技术
研究表明，酶促反应是从蛋白质中获取生物活性肽最为常见的一种策略。水解肽相比于蛋白质而言，更加易于吸收，且敏感性低、生物利用度高、副作用少。近年来，随着硒营养和生物活性肽研究的深入，发现硒多肽是膳食中有机硒的重要来源之一，天然富硒肽也可通过酶解原料中的富硒蛋白获得。目前，制备天然富硒肽的原材料种类繁多，已从富硒大豆、富硒玉米、富硒酵母中分离并鉴定了硒多肽。
为了更好的开发利用硒资源和提高药用植物的价值，研究人员以堇叶碎米荠为原料制备了富硒蛋白和硒多肽。从碎米荠中分离所得的硒肽含硒量要比其他植物高，这是因为董叶碎米荠是超富硒植物，其苗叶期的含硒量超过了国际上的超富硒植物的含硒临界标准1000mg/kg，远高于富硒酵母、富硒大豆、富硒小麦。
但目前工业上水解蛋白都是采用间歇式的生产方式，它是当蛋白达到预期水解程度后经过灭酶、脱盐和分离这几个工序后得到产品。间歇式水解蛋白有很多不足之处：如酶不能重复使用、生产成本高、每批次的产品品质难控制、反应时间长和生产效率低等。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种可连续化生产、酶可回收利用、成品品质可控的碎米荠硒多肽的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法，该方法包括如下步骤：
(1)碎米荠蛋白粉的制备：
将粉碎后的碎米荠以去离子水进行第一提取，再经离心得到第一提取液和第一沉淀物；
将第一沉淀物以NaOH溶液进行第二提取，离心，得到第二提取液；
将第一提取液和第二提取液合并得到碎米荠蛋白液；
向碎米荠蛋白液中加入中性盐至饱和度≥60％，盐析后进行离心，将离心后所得沉淀以去离子水复溶，然后于透析袋中进行透析，再将透析液冷冻干燥后得到碎米荠蛋白粉；
(2)固定化酶的构建：
将四氧化三铁纳米颗粒与单宁酸Tris-HCI缓冲溶液和聚乙烯亚胺Tris-HCI缓冲溶液的混合溶液混合后搅拌，得到带有固定涂层的基质；
将带有固定涂层的基质与蛋白酶缓冲溶液混合搅拌，得到固定化蛋白酶；
所述蛋白酶缓冲溶液为碱性蛋白酶的硼酸盐缓冲溶液；
(3)预酶解：
将步骤(1)所得碎米荠蛋白粉溶于去离子水中，得到碎米荠蛋白液，将碎米荠蛋白液加入至酶膜反应器的酶解罐中，并加入步骤(2)所得固定化蛋白酶，在搅拌下进行酶解反应，得到碎米荠硒多肽初产物；
(4)超滤、补料：
控制酶膜反应器超滤的操作压力，对碎米荠硒多肽初产物进行酶解-膜分离耦合反应，得到透过液和截留液；
截留液回到酶解罐中继续反应；反应过程中，通过向酶解罐中加入碎米荠蛋白液以保持底物体积恒定，同时加入碱性调节剂维持体系pH为10±0.2；
(5)浓缩、干燥：
将所述透过液经旋转蒸发进行浓缩处理，得到碎米荠硒多肽浓缩液；
将所述浓缩液经高压喷雾干燥或低温冷冻干燥处理后，得到碎米荠硒多肽粉。
本发明采用的酶膜反应器是一种把酶催化反应和超滤膜分离过程耦合在一起的反应器，可通过商购获得。
本发明的固定化酶是通过将生物酶固定化到微球基质的表面，可以提高酶的稳定性及重复使用性。本发明提供的固定化碱性蛋白酶载酶量较高，并且酶的活性较高。
作为优选方案，步骤(1)中，粉碎后的碎米荠的粒径≤80目。
作为优选方案，步骤(1)中，粉碎后的碎米荠与去离子水的料液比为1g：(35-45)mL，第一提取的时间为6-10h。
作为优选方案，步骤(1)中，第一沉淀物与NaOH溶液的料液比为1g：(35-45)mL，第二提取的时间为6-10h。
作为优选方案，步骤(1)中，所述中性盐为硫酸铵。
作为优选方案，步骤(1)中，所述透析袋为3500Da透析袋。
作为优选方案，步骤(2)中，所述单宁酸Tris-HCI缓冲溶液中单宁酸的浓度为0.5～10g/L。
作为优选方案，步骤(2)中，所述聚乙烯亚胺Tris-HCI缓冲溶液中聚乙烯亚胺的浓度为2～10g/L。
作为优选方案，步骤(2)中，所述单宁酸Tris-HCI缓冲溶液和所述聚乙烯亚胺Tris-HCI缓冲溶液的体积比为(0.12～8)：1。
作为优选方案，步骤(2)中，所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径为200～300nm。
作为优选方案，步骤(2)中，硼酸盐缓冲溶液中碱性蛋白酶的浓度为0.1～2g/L。
作为优选方案，步骤(2)中，所述硼酸盐缓冲溶液的pH为9.0～11.0。
作为优选方案，步骤(2)中，带有固定涂层的基质与蛋白酶缓冲溶液混合搅拌的温度为25℃～65℃，时间为2～12h，混合搅拌的速率为100～300rpm/min。
作为优选方案，步骤(3)中，将碎米荠蛋白液加入至酶膜反应器的酶解罐后，还包括：调节体系pH至7～12，并将温度加热至30～60℃。
作为优选方案，所述酶解反应的时间为1～3h。
作为优选方案，步骤(3)中，所述碎米荠蛋白液中碎米荠蛋白粉的浓度为1.5-2.5g/L。
作为优选方案，步骤(3)中，相对于1g碎米荠蛋白粉，按加酶量1700～9700U/g将步骤(2)所得固定化蛋白酶加入至所述碎米荠蛋白液中。
作为优选方案，步骤(4)中，所述超滤膜的操作压力为0.05MPa～0.10MPa。
作为优选方案，步骤(4)中，所述酶解-膜分离耦合反应体系中反应物的平均停留时间为3～6h。
本发明的第二方面提供由上述的方法制备得到的碎米荠硒多肽。
本发明中，碎米荠均来源为富硒堇叶碎米荠。
本发明利用富硒堇叶碎米荠制备碎米荠硒多肽，原料易得、资源丰富，实现了对硒资源的高效利用，极大地提升了碎米荠的附加值。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、酶作为一种生物催化剂，对环境敏感且易失活，本发明通过将生物酶固定化到微球基质的表面，有效提高了酶的稳定性及重复使用性；本发明制备的固定化碱性蛋白酶的热稳定性、pH值稳定性和储藏稳定性均高于游离酶。
2、本发明方法集反应、产品分离和酶回收再利用于一体，可以实现连续化操作。
3、本发明通过固定化酶膜反应器连续酶解底物蛋白，可有选择性的移出反应产物，减少产物抑制现象，提高反应速率和底物转化率，通过膜的选择性，可以控制水解产物分子量大小；本发明方法获得的碎米荠硒多肽分子量集中分布在300～3000Da，水解度DH可到27％左右，比传统间歇酶解的DH值提高了8.4％。
4、本发明通过以Fe3O4为基质，以有机试剂对Fe3O4载体表面进行修饰后固定碱性蛋白酶，采用耦合膜反应器，可连续酶解底物蛋白，具有酶重复利用、酶解时间短、生产成本低、成品品质可控的优点；克服了传统间歇式酶解中酶不能重复使用、每批次的产品品质难以控制、生产效率低的问题；本发明可用于大规模连续化生产，在食品加工、化妆保健品、医药等领域具有良好的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1示出了本发明方法的一种工艺流程图。
图2示出了本发明提供的的一种固定化碱性蛋白酶的结构示意图。
附图标记说明：
1-基质；2-涂层；3-酶分子。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1
本实施例提供一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法，参见图1的工艺流程图，其步骤如下：
(1)碎米荠蛋白的制备：用高速多功能粉碎机将干燥的碎米荠粉碎，过80目筛，按料液质量比1g：40mL，先后用去离子水和0.1mol/L NaOH溶液分别提取8h，将提取液合并得到碎米荠蛋白液，于碎米荠蛋白液中加入硫酸铵至饱和度为60％，将离心后的沉淀加去离子水复溶，于3500Da透析袋中进行透析，透析液冷冻干燥后制得碎米荠蛋白粉。
(2)固定化酶的构建：将单宁酸溶解于10mM Tris-HCI缓冲溶液(pH＝8.5)中，得到浓度为2.5g/L的单宁酸缓冲溶液，将聚乙烯亚胺溶解于10mM Tris-HCI缓冲溶液(pH＝8.5)中，得到浓度为3g/L的聚乙烯亚胺缓冲溶液；然后将单宁酸缓冲溶液与聚乙烯亚胺缓冲溶液按溶液按体积比1：1混合，得到混合溶液；将四氧化三铁纳米颗粒置于上述混合溶液中，室温下175rpm/min搅拌2h后用去离子水冲洗得到带有固定涂层的基质；将上述带有固定涂层的基质置于1g/L的碱性蛋白酶溶液中(pH＝10.0 10Mm硼酸缓冲溶液)，50℃下150rpm/min搅拌4h后用去离子水冲洗，得到固定化碱性蛋白酶；图2示出了本发明提供的的一种固定化碱性蛋白酶的结构示意图。其中，基质1为四氧化三铁纳米颗粒，涂层2包括单宁酸和聚乙烯亚胺，酶分子为碱性蛋白酶。
(3)预酶解：将上述碎米荠蛋白粉溶于适量去离子水中，配置成一定浓度的碎米荠蛋白液，加入到酶膜反应器的酶解罐中，然后用NaOH溶液调节pH值为10.5，并将温度加热至50℃，按加酶量7000U/g将固定化碱性蛋白酶加到所述碎米荠蛋白液中，在搅拌下进行酶解反应1.5h；
(4)超滤、补料：开启所述酶膜反应器的膜分离装置，控制超滤的操作压力在0.08Mpa，进行酶解-膜分离耦合反应，得到透过液；截留液回到所述酶解罐中继续反应；反应过程中，需要向所述酶解罐中加入所述碎米荠蛋白液，以保持底物体积恒定，同时滴加2mol/L NaOH溶液维持反应体系pH恒定；其中，反应物的平均停留时间为4h；
(5)浓缩、干燥：将所述透过液经旋转蒸发进行浓缩处理，得碎米荠硒多肽浓缩液；所述浓缩液经高压喷雾干燥或低温冷冻干燥处理，得碎米荠硒多肽粉。
实施例2
与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，将上述带有固定涂层的基质置于1g/L的碱性蛋白酶溶液中室温下150rpm/min搅拌12h后用去离子水冲洗；
步骤(3)中，用NaOH溶液调节pH值为9。
实施例3
与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，将上述带有固定涂层的基质置于1g/L的碱性蛋白酶溶液中(pH＝9.010Mm硼酸缓冲溶液)
步骤(3)中，将温度加热至40℃。
实施例4
与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，将上述带有固定涂层的基质置于0.1g/L的碱性蛋白酶溶液中(pH＝10.0 10Mm硼酸缓冲溶液)；
步骤(3)中，在搅拌下进行酶解反应3h。
实施例5
与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，用NaOH溶液调节pH值为12；
步骤(4)中，控制超滤/纳滤的操作压力在0.05Mpa。
实施例6
与实施例1的区别在于：
步骤(4)中，反应物的平均停留时间为3h。
实施例7
与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，搅拌下进行酶解反应3h；
步骤(4)中，开启所述酶膜反应器的膜分离装置，控制超滤/纳滤的操作压力在0.1Mpa。
实施例8
与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，在搅拌下进行酶解反应2h；
步骤(4)中，反应物的平均停留时间为6h。
对比例1
(1)碎米荠蛋白的制备：用高速多功能粉碎机将干燥的碎米荠粉碎，过80目筛，按料液质量比1g：40mL，先后用去离子水和0.1mol/L NaOH溶液分别提取8h，将提取液合并得到碎米荠蛋白液，于碎米荠蛋白液中加入硫酸铵至饱和度为60％，将离心后的沉淀加去离子水复溶，于3500Da透析袋中进行透析，透析液冷冻干燥后制得碎米荠蛋白粉。
(2)酶解：将上述碎米荠蛋白粉溶于适量去离子水中，配置成一定浓度的碎米荠蛋白液，加入到酶解罐中，然后用NaOH溶液调节pH值为10.0，并将温度加热至50℃，按加酶量8000U/g将碱性蛋白酶加到所述碎米荠蛋白液中，在搅拌下进行酶解反应5.5h。
(3)灭活、超滤：将所述酶解液90℃下水浴15min灭活，冷却后开启所述酶膜反应器的膜分离装置，控制超滤的操作压力在0.08Mpa，得到透过液。
(4)浓缩、干燥：将所述透过液经旋转蒸发进行浓缩处理，得碎米荠硒多肽浓缩液；所述浓缩液经高压喷雾干燥或低温冷冻干燥处理，得碎米荠硒多肽粉。
对比例2
(1)碎米荠蛋白的制备：用高速多功能粉碎机将干燥的碎米荠粉碎，过80目筛，按料液质量比1g：40mL，先后用去离子水和0.1mol/L NaOH溶液分别提取8h，将提取液合并得到碎米荠蛋白液，于碎米荠蛋白液中加入硫酸铵至饱和度为60％，将离心后的沉淀加去离子水复溶，于3500Da透析袋中进行透析，透析液冷冻干燥后制得碎米荠蛋白粉。
(2)酶解：将上述碎米荠蛋白粉溶于适量去离子水中，配置成一定浓度的碎米荠蛋白液，加入到酶解罐中，然后用NaOH溶液调节pH值为12，并将温度加热至55℃，按加酶量7000U/g将碱性蛋白酶加到所述碎米荠蛋白液中，在搅拌下进行酶解反应5.5h。
(3)灭活、超滤：将所述酶解液90℃下水浴15min灭活，冷却后开启所述酶膜反应器的膜分离装置，控制超滤的操作压力在0.08Mpa，得到透过液。
(4)浓缩、干燥：将所述透过液经旋转蒸发进行浓缩处理，得碎米荠硒多肽浓缩液；所述浓缩液经高压喷雾干燥或低温冷冻干燥处理，得碎米荠硒多肽粉。
对比例3
(1)碎米荠蛋白的制备：用高速多功能粉碎机将干燥的碎米荠粉碎，过80目筛，按料液质量比1g：40mL，先后用去离子水和0.1mol/L NaOH溶液分别提取8h，将提取液离心后得到碎米荠蛋白液，于碎米荠蛋白液中加入硫酸铵至饱和度为60％，将离心后的沉淀加去离子水复溶，于3500Da透析袋中进行透析，透析液冷冻干燥后制得碎米荠蛋白粉。
(2)酶解：将上述碎米荠蛋白粉溶于适量去离子水中，配置成一定浓度的碎米荠蛋白液，加入到酶解罐中，然后用NaOH溶液调节pH值为9.0，并将温度加热至45℃，按加酶量8000U/g将碱性蛋白酶加到所述碎米荠蛋白液中，在搅拌下进行酶解反应5.5h；
(3)灭活、超滤：将所述酶解液90℃下水浴15min灭活，冷却后开启所述酶膜反应器的膜分离装置，控制超滤的操作压力在0.06Mpa，得到透过液。
(4)浓缩、干燥：将所述透过液经旋转蒸发进行浓缩处理，得碎米荠硒多肽浓缩液；所述浓缩液经高压喷雾干燥或低温冷冻干燥处理，得碎米荠硒多肽粉。
测试例
对实施例1～8构建的固定化酶进行性能测试，对实施例1和对比例1～3进行水解度和总硒含量的测定，方法如下：
(1)酶固载率：
通过质量平衡计算固定化酶的量，并使用Bradford方法用紫外分光光度计在595nm处测定蛋白质浓度。
蛋白质加载量通过质量平衡方程计算：
酶固载率/％＝(C1-C2)/C2×100％
其中C1为加入载体中蛋白含量(mL/mg)；C2为残液中蛋白含量(mL/mg)。
(2)酶活力回收率：
将固定化碱性蛋白酶加入到20mL，0.2mM酪素溶液中，在40℃，pH为10.5的条件下下反应30min。然后，用10％三氯乙酸沉淀酶和未消化的酪素。在6000rpm离心30min后，取上清液在280nm处测定的吸光值。在测定条件下，一个单位蛋白酶活(U)表示为每分钟水解酪素产生1ug酪氨酸所需的酶量。通过实验组和空白组测得固定化蛋白酶酶活力回收率。
酶活力回收率/％＝A1/A2×100％
其中A1为固定化酶总活力(U/mL)；A2为原酶液总活力(U/mL)。
(3)水解度和硒含量的测定
蛋白质水解度(DH)测定：pH-stat法
Figure BDA0002831066890000111
DH:水解度，％；B:水解过程中所消耗的碱量(mL)；Nb:碱液的浓度(mol/L)；Mp:水解液中蛋白质的质量(g)；α:α-氨基的平均解离度；htot:为未水解时单位质量蛋白质所含肽键的总数，mmol/g。
硒含量的测定：按照GB 5009.93-2017第一法原子荧光光度计法测总硒含量；
表1实施例1～8固定化碱性蛋白酶的酶固载率和酶活力回收率
Figure BDA0002831066890000112
Figure BDA0002831066890000121
表2实施例1和对比例1～3碎米荠蛋白的水解度和硒多肽中总硒的含量
样品 水解度(％) 总硒含量(mg/kg)
实施例1 26.73 2340.74
对照例1 22.33 2102.26
对照例2 18.33 1812.34
对照例3 20.87 2077.17
由实施例的性能测试可知，本发明提供的固定化碱性蛋白酶具有较好的载酶量和酶活性；由实施例1和对比例1的对比可知，将碱性蛋白酶固定后，水解度略为下降；由实施例1和对比例2～3的对比可知，采用酶膜反应器连续酶解碎米荠蛋白液比传统间歇酶解的DH值提高了8.4％，总硒含量提升显著。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)碎米荠蛋白粉的制备：
将粉碎后的碎米荠以去离子水进行第一提取，再经离心得到第一提取液和第一沉淀物；
将第一沉淀物以NaOH溶液进行第二提取，离心，得到第二提取液；
将第一提取液和第二提取液合并得到碎米荠蛋白液；
向碎米荠蛋白液中加入中性盐至饱和度≥60％，盐析后进行离心，将离心后所得沉淀以去离子水复溶，然后于透析袋中进行透析，再将透析液冷冻干燥后得到碎米荠蛋白粉；
(2)固定化酶的构建：
将四氧化三铁纳米颗粒与单宁酸Tris-HCI缓冲溶液和聚乙烯亚胺Tris-HCI缓冲溶液的混合溶液混合后搅拌，得到带有固定涂层的基质；
将带有固定涂层的基质与蛋白酶缓冲溶液混合搅拌，得到固定化蛋白酶；
所述蛋白酶缓冲溶液为碱性蛋白酶的硼酸盐缓冲溶液；
(3)预酶解：
将步骤(1)所得碎米荠蛋白粉溶于去离子水中，得到碎米荠蛋白液，将碎米荠蛋白液加入至酶膜反应器的酶解罐中，并加入步骤(2)所得固定化蛋白酶，在搅拌下进行酶解反应，得到碎米荠硒多肽初产物；
(4)超滤、补料：
控制酶膜反应器超滤的操作压力，对碎米荠硒多肽初产物进行酶解-膜分离耦合反应，得到透过液和截留液；
截留液回到酶解罐中继续反应；反应过程中，通过向酶解罐中加入碎米荠蛋白液以保持底物体积恒定，同时加入碱性调节剂维持体系pH为10±0.2；
(5)浓缩、干燥：
将所述透过液经旋转蒸发进行浓缩处理，得到碎米荠硒多肽浓缩液；
将所述浓缩液经高压喷雾干燥或低温冷冻干燥处理后，得到碎米荠硒多肽粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，
粉碎后的碎米荠与去离子水的料液比为1g：(35-45)mL，第一提取的时间为6-10h；
第一沉淀物与NaOH溶液的料液比为1g：(35-45)mL，第二提取的时间为6-10h。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述中性盐为硫酸铵；
所述透析袋为3500Da透析袋。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，
所述单宁酸Tris-HCI缓冲溶液中单宁酸的浓度为0.5～10g/L；
所述聚乙烯亚胺Tris-HCI缓冲溶液中聚乙烯亚胺的浓度为2～10g/L；
所述单宁酸Tris-HCI缓冲溶液和所述聚乙烯亚胺Tris-HCI缓冲溶液的体积比为(0.12～8)：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，
所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径为200～300nm；
硼酸盐缓冲溶液中碱性蛋白酶的浓度为0.1～2g/L；
所述硼酸盐缓冲溶液的pH为9.0～11.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，
带有固定涂层的基质与蛋白酶缓冲溶液混合搅拌的温度为25℃～65℃，时间为2～12h，混合搅拌的速率为100～300rpm/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，
将碎米荠蛋白液加入至酶膜反应器的酶解罐后，还包括：调节体系pH至7～12，并将温度加热至30～60℃；
所述酶解反应的时间为1～3h。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，
所述碎米荠蛋白液中碎米荠蛋白粉的浓度为1.5-2.5g/L；
相对于1g碎米荠蛋白粉，按加酶量1700～9700U/g将步骤(2)所得固定化蛋白酶加入至所述碎米荠蛋白液中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，
所述超滤膜的操作压力为0.05MPa～0.10MPa；
所述酶解-膜分离耦合反应体系中反应物的平均停留时间为3～6h。
10.权利要求1-9中任意一项所述的方法制备得到的碎米荠硒多肽。
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