CN107177586A - 一种生物转化用固定化蜗牛酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物转化用固定化蜗牛酶及其制备方法，属于固定化酶技术领域。本发明以蜗牛为酶来源，通过预处理精致活性蜗牛酶，再以六水合氯化铁和四水合氯化亚铁为原料，制得磁性Fe₃O₄纳米粒子，并用葡萄糖为碳源，在磁性Fe₃O₄纳米粒子表面包覆无定型碳层，再用壳聚糖和正硅酸乙酯改性，最后通过京尼平与活性蜗牛酶吸附交联固定化，制得生物转化用固定化蜗牛酶。本发明制备的生物转化用固定化蜗牛酶的活性热稳定性和操作稳定性好，酶活性高，可重复使用，具有广阔的应用前景。

Description

一种生物转化用固定化蜗牛酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物转化用固定化蜗牛酶及其制备方法，属于固定化酶技术领域。

背景技术

蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。蜗牛酶是很有价值的一种酶。它可以用于酵母细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究；它可做饲料添加剂，从而提高饲料的消化率；也可用作果汁澄清，橘子脱囊衣，果酱制作等。

蜗牛酶内含常见9种酶：从蜗牛消化腺中发现有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、阿尔法淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等多种具有生物活性的混合酶。蜗牛酶能降解几丁质内切酶分解的几丁质产物成单糖，从而使几丁质内切酶的活性得以通过显色反应来测定。

蜗牛酶是一种可以高效控制降解几丁质的一种生物催化剂，反应条件温和、专一性强、催化效率高、副反应少等，在医药、化工、食品、轻工和环境保护等行业应用十分广泛。但是游离蜗牛酶在使用中对环境要求十分苛刻，容易失活，稳定性差，难以重复利用，同时昂贵的价格也限制了其在酶催化领域的应用。

因此在实际应用中通常将蜗牛酶作固定化处理。固定化酶由于其高稳定性、可重用性、易分离等性质被广泛地应用于化学、生物、农业和医药等领域。

蜗牛酶固定化方法主要包括物理吸附法、共价结合法、包埋法和交联法。制备固定化蜗牛酶过程中所采用的固定化技术、载体、介质条件和所催化反应类别会在一定程度上导致酶失活、变性，从而使酶的催化性能或保留活性降低，其中载体所带来的分配效应、空间障碍效应和扩散限制效应是影响固定化酶催化效率的主要因素，因此，探寻可行、有效的固定化载体来增强固定化蜗牛酶的催化性能一直是固定化蜗牛酶研究的热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对固定化蜗牛酶过程中所采用的固定化技术和催化反应类别易导致酶失活、变性，从而使蜗牛酶的催化性能或保留活性降低的问题，本发明提供了一种生物转化用固定化蜗牛酶及其制备方法。

为解决技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种生物转化用固定化蜗牛酶，由磁性Fe₃O₄纳米粒子、隔离层、固定层组成，所述磁性Fe₃O₄纳米粒子表面包裹隔离层，再经固定层修饰隔离层表面并交联固化活性蜗牛酶。

所述磁性Fe₃O₄纳米粒子为10～12重量份六水合氯化铁，4.0～4.8重量份四水合氯化亚铁，25～50重量份质量分数为20%氨水，混合加热至80～90℃反应1～2h制得。

所述隔离层为葡萄糖经水热反应在磁性Fe₃O₄纳米粒子表面形成的碳包覆层。

所述固定层由2～3重量份壳聚糖，10～12重量份正硅酸乙酯，0.1～0.3重量份活性蜗牛酶，0.05～0.08重量份京尼平组成。

所述活性蜗牛酶为蜗牛嗉囊中消化道液的提取物。

一种生物转化用固定化蜗牛酶的制备方法，具体步骤为：

S1.提取活性蜗牛酶；

S2.制备磁性Fe₃O₄纳米粒子；

S3.将磁性Fe₃O₄纳米粒子加入质量分数为5%葡萄糖溶液中，在200～220℃下反应5～6h后过滤洗涤并配制成分散液；

S4.将分散液与壳聚糖、正硅酸乙酯混合搅拌1～2h后，再加入活性蜗牛酶与京尼平，在30～40℃下以300～400r/min搅拌20～30min，冷却至室温后过滤风干得生物转化用固定化蜗牛酶。

本发明的有益技术效果是：

本发明通过六水合氯化铁和四水合氯化亚铁为原料，制得磁性Fe₃O₄纳米粒子作为内核，并用葡萄糖为碳源，在磁性Fe₃O₄纳米粒子表面包覆无定型碳层，再用壳聚糖和正硅酸乙酯水解的纳米二氧化硅修饰碳层表面，形成有利于大尺寸分子和基团的进入的多孔结构，可以增加酶固定化材料的比表面积、提高酶的稳定性和活性，吸附蜗牛酶的同时通过京尼平在酶分子间形成共价键将蜗牛嗉囊中消化道液提取的活性蜗牛酶交联固定。本发明制备的生物转化用固定化蜗牛酶的活性热稳定性和操作稳定性好，酶活性高，可重复使用，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

取50～100只重量达30～40g的蜗牛，并将蜗牛置于饲养盒中，每天用质量分数为0.01～0.02%的氯化铁溶液清洗1～3次，饥饿处理3～5天后，敲碎并剥去蜗牛壳，取出蜗牛软体并顺其消化道剪开蜗牛软体，剥离消化道后取出嗉囊，在5～8℃下，将嗉囊加入研钵中研磨破碎10～15min，得蜗牛消化道液，量取15～20mL质量分数为2%柠檬酸溶液，加入20～25mL质量分数为3%磷酸氢二钠溶液中，以300～400r/min搅拌混合均匀后加入蜗牛消化道液，并以300W超声波超声提取1～2h，得提取液，将提取液装入离心机中，以8000～10000r/min离心分离10～20min，取上清液，将上清液装入冷冻干燥箱中，在﹣30～﹣10℃下冷冻干燥10～12h，得活性蜗牛酶，称取10～12g六水合氯化铁，4.0～4.8g四水合氯化亚铁，加入300～500mL去离子水中，在氮气氛围下，以300～400r/min搅拌至固体完全溶解后，再以1mL/min滴加30～40mL质量分数为20%氨水，继续搅拌30～40min后加热至80～90℃反应1～2h，冷却至室温后用磁铁分离得黑色固体，用去离子水和无水乙醇洗涤黑色固体3～5次，得磁性Fe₃O₄纳米粒子，称取1～3g磁性Fe₃O₄纳米粒子，加入80～100mL质量分数为5%葡萄糖溶液中，以300W超声波超声分散10～15min后，转入水热反应釜中，在200～220℃下反应5～6h，冷却至室温后过滤，得碳包覆Fe₃O₄纳米粒子，用去离子水洗涤3～5次后加入80～100mL去离子水中，以300W超声波超声分散10～12min，得碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，称取2～3g壳聚糖，加入到75～100mL质量分数为1%醋酸溶液中，以300～400r/min搅拌至壳聚糖完全溶解，再加入10～12g正硅酸乙酯，10～20mL碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，继续搅拌1～2h，得反应液，称取0.1～0.3g活性蜗牛酶，0.05～0.08g京尼平，加入30～50mL去离子水中混合均匀后加入反应液中，在30～40℃下以300～400r/min搅拌20～30min，冷却至室温后过滤，将滤饼自然风干得生物转化用固定化蜗牛酶。

实例1

取50只重量达30g的蜗牛，并将蜗牛置于饲养盒中，每天用质量分数为0.01%的氯化铁溶液清洗1次，饥饿处理3天后，敲碎并剥去蜗牛壳，取出蜗牛软体并顺其消化道剪开蜗牛软体，剥离消化道后取出嗉囊，在5℃下，将嗉囊加入研钵中研磨破碎10min，得蜗牛消化道液，量取15mL质量分数为2%柠檬酸溶液，加入20mL质量分数为3%磷酸氢二钠溶液中，以300r/min搅拌混合均匀后加入蜗牛消化道液，并以300W超声波超声提取1h，得提取液，将提取液装入离心机中，以8000r/min离心分离10min，取上清液，将上清液装入冷冻干燥箱中，在﹣30℃下冷冻干燥10h，得活性蜗牛酶，称取10g六水合氯化铁，4.0g四水合氯化亚铁，加入300mL去离子水中，在氮气氛围下，以300r/min搅拌至固体完全溶解后，再以1mL/min滴加30mL质量分数为20%氨水，继续搅拌30min后加热至80℃反应1h，冷却至室温后用磁铁分离得黑色固体，用去离子水和无水乙醇洗涤黑色固体3次，得磁性Fe₃O₄纳米粒子，称取1g磁性Fe₃O₄纳米粒子，加入80mL质量分数为5%葡萄糖溶液中，以300W超声波超声分散10min后，转入水热反应釜中，在200℃下反应5h，冷却至室温后过滤，得碳包覆Fe₃O₄纳米粒子，用去离子水洗涤3次后加入80mL去离子水中，以300W超声波超声分散10min，得碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，称取2g壳聚糖，加入到75mL质量分数为1%醋酸溶液中，以300r/min搅拌至壳聚糖完全溶解，再加入10g正硅酸乙酯，10mL碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，继续搅拌1h，得反应液，称取0.1g活性蜗牛酶，0.05g京尼平，加入30mL去离子水中混合均匀后加入反应液中，在30℃下以300r/min搅拌20min，冷却至室温后过滤，将滤饼自然风干得生物转化用固定化蜗牛酶。

实例2

取75只重量达35g的蜗牛，并将蜗牛置于饲养盒中，每天用质量分数为0.01%的氯化铁溶液清洗2次，饥饿处理4天后，敲碎并剥去蜗牛壳，取出蜗牛软体并顺其消化道剪开蜗牛软体，剥离消化道后取出嗉囊，在7℃下，将嗉囊加入研钵中研磨破碎13min，得蜗牛消化道液，量取18mL质量分数为2%柠檬酸溶液，加入23mL质量分数为3%磷酸氢二钠溶液中，以350r/min搅拌混合均匀后加入蜗牛消化道液，并以300W超声波超声提取1h，得提取液，将提取液装入离心机中，以9000r/min离心分离15min，取上清液，将上清液装入冷冻干燥箱中，在﹣20℃下冷冻干燥11h，得活性蜗牛酶，称取11g六水合氯化铁，4.4g四水合氯化亚铁，加入400mL去离子水中，在氮气氛围下，以350r/min搅拌至固体完全溶解后，再以1mL/min滴加35mL质量分数为20%氨水，继续搅拌35min后加热至85℃反应1h，冷却至室温后用磁铁分离得黑色固体，用去离子水和无水乙醇洗涤黑色固体4次，得磁性Fe₃O₄纳米粒子，称取2g磁性Fe₃O₄纳米粒子，加入90mL质量分数为5%葡萄糖溶液中，以300W超声波超声分散13min后，转入水热反应釜中，在210℃下反应5h，冷却至室温后过滤，得碳包覆Fe₃O₄纳米粒子，用去离子水洗涤4次后加入90mL去离子水中，以300W超声波超声分散11min，得碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，称取2g壳聚糖，加入到87mL质量分数为1%醋酸溶液中，以350r/min搅拌至壳聚糖完全溶解，再加入11g正硅酸乙酯，15mL碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，继续搅拌1h，得反应液，称取0.2g活性蜗牛酶，0.07g京尼平，加入40mL去离子水中混合均匀后加入反应液中，在35℃下以350r/min搅拌25min，冷却至室温后过滤，将滤饼自然风干得生物转化用固定化蜗牛酶。

实例3

取100只重量达40g的蜗牛，并将蜗牛置于饲养盒中，每天用质量分数为0.02%的氯化铁溶液清洗3次，饥饿处理5天后，敲碎并剥去蜗牛壳，取出蜗牛软体并顺其消化道剪开蜗牛软体，剥离消化道后取出嗉囊，在8℃下，将嗉囊加入研钵中研磨破碎15min，得蜗牛消化道液，量取20mL质量分数为2%柠檬酸溶液，加入25mL质量分数为3%磷酸氢二钠溶液中，以400r/min搅拌混合均匀后加入蜗牛消化道液，并以300W超声波超声提取2h，得提取液，将提取液装入离心机中，以10000r/min离心分离20min，取上清液，将上清液装入冷冻干燥箱中，在﹣10℃下冷冻干燥12h，得活性蜗牛酶，称取12g六水合氯化铁，4.8g四水合氯化亚铁，加入500mL去离子水中，在氮气氛围下，以400r/min搅拌至固体完全溶解后，再以1mL/min滴加40mL质量分数为20%氨水，继续搅拌40min后加热至90℃反应2h，冷却至室温后用磁铁分离得黑色固体，用去离子水和无水乙醇洗涤黑色固体5次，得磁性Fe₃O₄纳米粒子，称取3g磁性Fe₃O₄纳米粒子，加入100mL质量分数为5%葡萄糖溶液中，以300W超声波超声分散15min后，转入水热反应釜中，在220℃下反应6h，冷却至室温后过滤，得碳包覆Fe₃O₄纳米粒子，用去离子水洗涤5次后加入100mL去离子水中，以300W超声波超声分散12min，得碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，称取3g壳聚糖，加入到100mL质量分数为1%醋酸溶液中，以400r/min搅拌至壳聚糖完全溶解，再加入12g正硅酸乙酯，20mL碳包覆Fe₃O₄纳米分散液，继续搅拌2h，得反应液，称取0.3g活性蜗牛酶，0.08g京尼平，加入50mL去离子水中混合均匀后加入反应液中，在40℃下以400r/min搅拌30min，冷却至室温后过滤，将滤饼自然风干得生物转化用固定化蜗牛酶。

按质量比3：1，分别采用实例1～3制得的生物转化用固定化蜗牛酶和微球固定化蜗牛酶（对比例）对质量浓度为0.5mg/mL的淫羊藿苷进行生物转化，并对转化效果进行测定，其测定结果如下表1：

表1

综上所述，本发明制得的生物转化用固定化蜗牛酶操作稳定性较好，同时酶活性较好，具有较好的催化性能。

Claims (6)

1.一种生物转化用固定化蜗牛酶，由磁性Fe₃O₄纳米粒子、隔离层、固定层组成，其特征在于，所述磁性Fe₃O₄纳米粒子表面包裹隔离层，再经固定层修饰隔离层表面并交联固化活性蜗牛酶。

2.如权利要求1所述的一种生物转化用固定化蜗牛酶，其特征在于，所述磁性Fe₃O₄纳米粒子为10～12重量份六水合氯化铁，4.0～4.8重量份四水合氯化亚铁，25～50重量份质量分数为20%氨水，混合加热至80～90℃反应1～2h制得。

3.如权利要求1所述的一种生物转化用固定化蜗牛酶，其特征在于，所述隔离层为葡萄糖经水热反应在磁性Fe₃O₄纳米粒子表面形成的碳包覆层。

4.如权利要求1所述的一种生物转化用固定化蜗牛酶，其特征在于，所述固定层由2～3重量份壳聚糖，10～12重量份正硅酸乙酯，0.1～0.3重量份活性蜗牛酶，0.05～0.08重量份京尼平组成。

5.如权利要求1所述的一种生物转化用固定化蜗牛酶，其特征在于，所述活性蜗牛酶为蜗牛嗉囊中消化道液的提取物。

6.如权利要求1～5任一项所述的一种生物转化用固定化蜗牛酶的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

S1.提取活性蜗牛酶；

S2.制备磁性Fe₃O₄纳米粒子；

S3.将磁性Fe₃O₄纳米粒子加入质量分数为5%葡萄糖溶液中，在200～220℃下反应5～6h后过滤洗涤并配制成分散液；

S4.将分散液与壳聚糖、正硅酸乙酯混合搅拌1～2h后，再加入活性蜗牛酶与京尼平，在30～40℃下以300～400r/min搅拌20～30min，冷却至室温后过滤风干得生物转化用固定化蜗牛酶。