CN104388351A - 一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然无色生物防霉防腐菌剂的制备方法。首先将产酶溶杆菌C3接一环种子于锥形瓶中，置于摇床培养得产酶溶杆菌C3种子液；液体培养基装入发酵罐内，再接入产酶溶杆菌C3种子液进行培养得高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂；将高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂于60～100℃之间加热2～10min进行热处理；最后将改性活性炭加入菌剂中进行脱色反应，其加入量是浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂重量的0.5～3.0%，即得到天然的无色生物防霉防腐菌剂。本发明通过醋酸改性后使活性炭表面酸性含氧官能团具有极性的性质，加强吸附极性较强的化合物，增加其吸附力和对色素等特定杂质的选择性吸附能力。

Description

一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及防霉防腐菌剂的制备方法，属于轻工领域，具体涉及一种天然无色生物防霉防腐菌剂的制备方法。
背景技术
细菌和霉菌广泛分布于自然界中，其种类繁多，数量庞大，繁殖能力极强。它们对人类常造成不小的危害，引起竹、木、食品、衣物、花卉、纸质文物及各种器材等霉腐，或导致人、动物和农作物病害。据联合国粮食组织 (Food and Agriculture Organization，FAO)统计，全球每年农产品受霉菌污染高达25%，其繁殖产生威胁人和动植物安全的真菌毒素。迫切需要寻找防止和控制霉腐菌污染的方法，生物防霉防腐菌剂以其高效、环保优势前景广阔。
溶杆菌属存在于土壤和水体中，有较高的滑动性和G+C含量，能产生多种微生物活性物质，对细菌、真菌、单细胞藻类和线虫都有拮抗活性，主要为：胞外酶等一系列大分子活性物质，如α-蛋白水解酶、几丁质酶、β-l，3-葡聚糖酶、核酶、磷酸酶、脂解酶、β-内酰胺酶、肽链内切酶等；小分子活性物质如WAP-8294A，HSAF (heat stable antifungal factor)，Lysobactin，Cephabacins和Tripropeptins等。国内外研究表明，产酶溶杆菌C3(美国典型培养物保藏中心，菌株编号：ATCC29487，下同)采用贫瘠培养基发酵，可合成对多种细菌和真菌都具有抑制活性产物，主要活性物质为耐热性的热稳定抗真菌因子（HSAF）。然而，所有文献报道均表明，它只在寡营养条件下有活性而在丰富培养基上不能合成活性物质，但实际生产又必须采用丰富培养基以合成高浓度产物，从而降低生产成本，这一矛盾是其开发应用的主要障碍。为此，本实验室前期曾通过发酵工艺优化，发现饴糖或蔗糖可促其在丰富培养基发酵合成大量活性物质，稀释50倍仍具有较强抑菌活性，并制备成可用于竹材防霉的菌剂ZL201210302047.4（一种竹材和竹制品专用防霉菌剂的制备及应用）。但在应用过程中发现饴糖来源不稳定且生产成本较高，并且产酶溶杆菌发酵时会产生浅黄色色素，这种有色防霉菌剂应用时色素沉积附着在物品表面，影响美观度和品质。
有鉴于此，本发明采用单因子实验、均匀设计和响应面分析法优化发酵培养基，获得更为廉价且来源广泛的工业化丰富培养基配方。并且，产酶溶杆菌C3发酵后，通过优化的高效脱色剂和脱色工艺处理，制备高活性高品质的无色天然防霉腐菌剂，不仅可以防霉，还能防腐（控制细菌污染），而且无色透明，完全保持物品原有色泽和品质。所制备的菌剂无色高效、安全环保、成本低廉、原料简便且来源广泛，既可有效应用于木材、竹材、纸张、花卉、衣物和果蔬等防霉，又能保持物品本身特性。研究还发现脱色吸附剂存在灰分含量、孔容性、微孔分布、比表面积和吸附选择性能不足等缺陷，影响脱色效果，并且因选择性差造成活性组分损失严重而降低收率。通过对其结构和性质进行改性，可以有效提高其吸附能力和选择性。主要为物理和化学方法增加改性后吸附剂的比表面积、改变孔隙结构与分布，以及吸附表面基团结构，从而改变吸附剂的物理吸附性能和表面化学性质，提高对色素的选择性吸附和吸附容量，以保证良好脱色效果和活性损失最低，获得高活性的无色防霉防腐菌剂。
发明内容
本发明通过单因子实验、均匀设计和响应面分析法获得产酶溶杆菌C3工业化发酵的廉价丰富培养基配方和不影响活性的无色防霉防腐菌剂的制备方法。
为实现本发明的目的采用的技术方案：
1、产酶溶杆菌C3种子液的制备
（1）LB液体培养基的配方为：以100份水的重量计，蛋白胨10份，酵母提取物5份，NaCl　10份。
（2）制备
将活化好的产酶溶杆菌C3接一环种子于装有70ml LB液体培养基的500ml的锥形瓶，置于230 r／min、26～30℃的摇床培养30～48h，制备成产酶溶杆菌C3种子液。
2、高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂的制备
（1）以100份水的重量计，液体培养基的配方为：
NaCl                        0.5～1份
豆饼粉                     1.5～3.5份
玉米粉                        1～5份
CaCl2                     0.05～0.1份；
（2）制备
将液体培养基装入发酵罐内，并接入产酶溶杆菌C3种子液；液体培养基装料量为罐体积70%～80%，产酶溶杆菌C3种子液的接种量为液体培养基装料量的5～10%；搅拌，转速为200～350 r／min, 通气量为1:0.3～0.5(V／V·min)，培养38～52h，获得浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂。
3、高活性产酶溶杆菌C3无色生物防霉防腐菌剂的制备
（1）改性活性炭的预制备
为了提高活性炭对色素选择性吸附能力，而不吸附菌剂中的活性组分，采用醋酸对粉状或粒状活性炭进行改性处理。
改性反应体系：1mol/L醋酸          5～20重量份
              粉状或粒状活性炭   95～80重量份；
改性反应时间10～30min，反应温度50～70℃，改性后活性炭用水洗除去多余的醋酸直至出洗出水为中性为止得到改性活性炭。
（2）将步骤2制备得到的浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂于60～100℃之间加热2～10min进行热处理，经热处理后沉淀了部分色素和杂蛋白，而保留防霉防腐生物活性不损失。
（3）无色生物防霉防腐菌剂的制备
将预制备的改性活性炭加入热处理后的浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂中进行脱色反应，改性活性炭的加入量是浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂重量的0.5～3.0%；脱色反应温度15～30℃，搅拌，转速90～150 r／min，脱色反应时间30min～3h。此过程菌剂逐渐由浅棕色的转化到无色透明化，即得到本发明所述的天然的无色生物防霉防腐菌剂。经测定，本发明制备得到的天然的无色生物防霉防腐菌剂活性得率达到95%以上。
4. 高活性脱色防霉防腐菌剂应用
将本发明所制备的脱色防霉防腐菌剂直接或稀释1-50倍后，可采用喷洒、浸泡或涂抹等方法用于花卉、纸张、木材和竹材等物品防霉腐，效果显著且保持物品原有色泽和品质。
本发明通过单因素试验确定最佳碳源、氮源。分别选取麦芽汁、玉米粉、饴糖、玉米淀粉、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、壳聚糖、葡萄糖、麦芽糖为产酶溶杆菌C3发酵培养基碳源，实验确定玉米粉较适；再选取蛋白胨、花生饼粉、玉米浆粉、豆粕粉、鱼胨、麸皮、酵母浸膏、黄豆粉、燕麦粉、豆饼粉等为产酶溶杆菌C3发酵培养基氮源，实验确定豆饼粉较适。因玉米粉和豆饼粉均来源广泛，成本低廉，适于工业化。进一步采用响应面分析法优化培养基配方，确定最佳配方。然后，进一步通过对脱色剂和脱色工艺优化研究，在保持防霉防腐活性基础上将棕黄色发酵液制备成无色的脱色防霉防腐菌剂。
同时还通过大量单因素实验综合比较硅藻土、活性炭、阴阳离子交换树脂、高岭土、聚酰胺等对产酶溶杆菌C3菌剂活性影响和脱色效果，再进行均匀设计优化脱色工艺，结果粉状或粒状活性炭经醋酸活化改性处理10～30min，以0.5～3.0%添加量、脱色温度15～30℃、脱色时间0.5～3.0h、pH5～8条件下脱色，可获得活性损失极少的无色菌剂。
对于活性炭，本发明通过醋酸改性后使活性炭表面酸性含氧官能团具有极性的性质，加强吸附极性较强的化合物，增加其吸附力和对色素等特定杂质的选择性吸附能力，故具有良好脱色效果又不影响产品活性。因此，通过脱色后的菌剂与未脱色的菌剂的抑菌活性对比，发现活性相当甚至有些反而抑菌活性有增大的现象。
本发明与已有技术相比的显著优点是：本发明制备产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂的培养基配方为玉米粉和豆饼粉，其来源广泛，价格低廉，营养极其丰富，可大量合成高浓度活性产物，适用于大规模工业生产，克服了此前所有文献报道产酶溶杆菌C3需要贫乏营养条件才能合成活性产物的难题；本发明充分利用菌剂活性产物耐热和其他理化特性，采用加热处理发酵液和化学活性剂醋酸改性活性炭再脱色，既保留活性组分又选择性高效去除菌剂中的发色成分，脱色效果显著且保持了产酶溶杆菌C3菌剂的高活性，使脱色菌剂可应用于高品质木材、纸张、花卉、竹材和衣物等的防霉防腐。
附图说明
    图1是不同防霉防腐菌剂色度效果对比图。
图2是不同防霉防腐菌剂活性效果比较图。
图3 是采用未经脱色的1号防霉防腐菌剂处理白色纸张霉斑效果图。
图4 是采用活性炭直接脱色制备的2号防霉防腐菌剂处理白色纸张霉斑效果图。
图5 是采用本发明方法制备的3号防霉防腐菌剂处理白色纸张霉斑效果图。
图6 是不同防霉防腐剂对松木的防霉防腐效果比较图。
具体实施例
为了对本发明有更好的理解，现结合附图以实施例的方式做进一步的说明。
图1中，1是未经脱色的1号防霉防腐菌剂色度效果；2是采用活性炭直接脱色制备的2号防霉防腐菌剂色度效果；3是采用本发明方法制备的3号防霉防腐菌剂色度效果。从图中可以看出，1号防霉防腐样品未采用脱色工艺，菌剂偏黄色且浑浊；2号防霉防腐菌剂样品采用的是活性炭直接脱色，虽然色度不如1号样品深，但仍然较深；3号防霉防腐菌剂是采用本发明所述的方法制备的，呈无色透明状。
1号防霉防腐菌剂是采用本发明方法的步骤1和步骤2制备方法得到的。2号防霉防腐菌剂是在1号防霉防腐菌剂的基础上采用未经改性的活性炭脱色得到的。下同。
图2中，1是采用未脱色1号防霉防腐菌剂对霉菌的防霉抑菌圈；2是采用活性炭直接脱色制备的2号防霉防腐菌剂对霉菌的防霉抑菌圈；3是采用本发明方法制备的3号防霉防腐菌剂对霉菌的防霉抑菌圈。从对比图可以看出，本发明制备的3号防霉防腐菌剂的抑菌效果与未脱色处理的1号防霉防腐菌剂基本相当，说明脱色过程对活性基本无影响；而活性炭直接脱法制备的2号防霉防腐菌剂，不仅脱色不完全，而且抑菌效果显著下降，表明脱色过程中的活性损失较大。
图3、图4、图5中，菌剂处理白色纸张的处理方式和环境条件是：白色纸张浸泡10分钟，环境湿度为80%rh，放置20天。图3中的白色纸张明显长霉；图4中的白色纸张未见明显长霉但已开始发黑变暗；图5未见异常，所以在纸张上没有色斑出现，也完全没有霉菌污染，效果极佳。
图6中，左边图是在环境湿度为80%rh，放置30天后的未采用防霉防腐菌剂处理的松木，从图中明显看出，由于未采用菌剂保护，所以在松木上有大量明显的黑色霉菌斑点；右边图是采用本发明方法制备的防霉防腐菌剂浸泡3小时处理后，在环境湿度为80%rh，放置30天后的松木，由于防霉防腐菌剂的作用，完全防止霉菌生长，所以在松木上没有色斑出现。
实施例1
（1）产酶溶杆菌C3种子液的制备
1）LB液体培养基的配方为：以100克水的重量计，蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl　10克。
2）制备
将活化好的产酶溶杆菌C3接一环种子于装有70ml LB液体培养基的500ml的锥形瓶，置于230 r／min、28℃的摇床培养40h，制备成产酶溶杆菌C3种子液。
（2）高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂的制备
1）以10000克水的重量计，液体培养基的配方为：
NaCl           50克
豆饼粉        350克
玉米粉        200克
CaCl2        　10克
2）制备
将液体培养基装入5L发酵罐内，并接入产酶溶杆菌C3种子液。液体培养基装料量为罐体积80%，产酶溶杆菌C3种子液的接种量为8%；搅拌，转速为250 r／min, 通气量为1:0.5(V／V·min)，培养48h，获得浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂，如图１中1所示。
（3）高活性产酶溶杆菌C3菌剂脱色菌剂的制备
1）改性活性炭的预制备
为了提高活性炭对色素选择性吸附能力，而不吸附菌剂中的活性组分，采用醋酸对粉状或粒状活性炭进行改性处理。
改性反应体系：1mol/L醋酸          5克
              粉状或粒状活性炭   80克；
改性反应时间15min，反应温度70℃，改性后活性炭用水洗除去多余的醋酸直至出洗出水为中性为止得到改性活性炭。
2）将步骤（2）制备得到的浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂于80℃加热6min进行热处理，经热处理后沉淀了部分色素和杂蛋白，而保留防霉防腐生物活性不损失。
（3）无色生物防霉防腐菌剂的制备
取24克预制备的改性活性炭加入热处理后的800ml浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂中进行脱色反应；脱色反应温度25℃，搅拌，转速120 r／min，脱色反应时间3 h。此过程菌剂逐渐由浅棕色的转化到无色透明化，即得到本发明所述的天然的无色生物防霉防腐菌剂。经测定，本发明制备得到的天然的无色生物防霉防腐菌剂活性得率达到94.7%以上。
（4）脱色防霉防腐菌剂应用
    分别将采用活性炭直接脱色的菌剂和本发明制备的无色菌剂稀释20倍，浸泡处理普通纸张，均具有良好的防止霉变效果，但直接脱色菌剂防霉同时在纸张上残留下黄色污渍，如附图4所示。而本发明制备的脱色菌剂在防霉腐基础上，仍保持纸张原有品质，效果极佳，如附图5所示。
实施例2
（1）产酶溶杆菌C3种子液的制备
1）LB液体培养基的配方为：以100克水的重量计，蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl　10克。
2）制备
将活化好的产酶溶杆菌C3接一环种子于装有70ml LB液体培养基的500ml的锥形瓶，置于230 r／min、30℃的摇床培养30h，制备成产酶溶杆菌C3种子液。
（2）高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂的制备
1）以10000克水的重量计，液体培养基的配方为：
NaCl           50克
豆饼粉        150克
玉米粉        500克
CaCl2        　10克
2）制备
将液体培养基装入5L发酵罐内，并接入产酶溶杆菌C3种子液。液体培养基装料量为罐体积70%，产酶溶杆菌C3种子液的接种量为5%；搅拌，转速为350 r／min, 通气量为1︰0.3(V／V·min)，培养32h，获得浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂。
（3）高活性产酶溶杆菌C3菌剂脱色菌剂的制备
1）改性活性炭的预制备
为了提高活性炭对色素选择性吸附能力，而不吸附菌剂中的活性组分，采用醋酸对粉状或粒状活性炭进行改性处理。
改性反应体系：1mol/L醋酸          15克
              粉状或粒状活性炭    85克；
改性反应时间30min，反应温度50℃，改性后活性炭用水洗除去多余的醋酸直至出洗出水为中性为止得到改性活性炭。
2）将步骤（2）制备得到的浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂于100℃加热3min进行热处理，经热处理后沉淀了部分色素和杂蛋白，而保留防霉防腐生物活性不损失。
（3）无色生物防霉防腐菌剂的制备
取20克预制备的改性活性炭加入热处理后的800ml浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂中进行脱色反应；脱色反应温度15℃，搅拌，转速150 r／min，脱色反应时间3min 。此过程菌剂逐渐由浅棕色的转化到无色透明化，即得到本发明所述的天然的无色生物防霉防腐菌剂。经测定，本发明制备得到的天然的无色生物防霉防腐菌剂活性得率达到96.3%。
实施例3
（1）产酶溶杆菌C3种子液的制备
1）LB液体培养基的配方为：以100份水的重量计，蛋白胨10份，酵母提取物5份，NaCl　10份。
2）制备
将活化好的产酶溶杆菌C3接一环种子于装有70ml LB液体培养基的500ml的锥形瓶，置于200 r／min、26℃的摇床培养38h，制备成产酶溶杆菌C3种子液。
（2）高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂的制备
1）以100份水的重量计，液体培养基的配方为：
NaCl        100克
豆饼粉      150克
玉米粉      300克
CaCl2       　5克；
２）制备
将液体培养基装入发酵罐内，并接入产酶溶杆菌C3种子液。液体培养基装料量为罐体积75%，产酶溶杆菌C3种子液的接种量为10%；搅拌，转速为200 r／min, 通气量为1:0.4(V／V·min)，培养52h，获得高活性产酶溶杆菌C3浅棕色防霉防腐菌剂。
（3）高活性产酶溶杆菌C3菌剂脱色菌剂的制备
1）将发酵制备的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂于65℃加热10min，沉淀部分色素和杂蛋白，而保留防霉防腐生物活性不损失。
2）色素吸附剂活性炭改性
为了提高活性炭对色素选择性吸附能力，而不吸附菌剂中的活性组分，采用醋酸对粉状或粒状活性炭进行改性处理。
改性反应体系：1mol/L醋酸         10份
              粉状或粒状活性炭   90份
改性反应时间10min，反应温度60℃。改性后活性炭用水洗除去多余的醋酸直至出水中性为止。
3）吸附脱色和无色菌剂制备
利用改性活性炭选择性吸附色素，制备高活性无色防霉防腐产酶溶杆菌C3菌剂，脱色反应过程为：将1.5%改性粒状活性炭加入热处理后的菌剂中，脱色温度30℃，搅拌，转速90 r／min，脱色时间1h,脱色达到无色透明化，活性得率达到96.6%以上。
（4）脱色菌剂应用
    将脱色菌剂稀释10倍，加入含葡萄糖的普通百合插花液中，可延长百合花期100%，并且色泽更为艳丽，且完全防霉防腐。

Claims (6)

1.一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法，利用产酶溶杆菌C3制备出种子液，并接入液体培养基中发酵制备生物防霉防腐菌剂，其特征在于：
（1）产酶溶杆菌C3种子液的制备
将活化好的产酶溶杆菌C3接一环种子于装有70ml LB液体培养基的500ml的锥形瓶，置于230 r／min、26～30℃的摇床培养30～48h，制备成产酶溶杆菌C3种子液；
（2）高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂的制备
将液体培养基装入发酵罐内，并接入产酶溶杆菌C3种子液；液体培养基装料量为罐体积70%～80%，产酶溶杆菌C3种子液的接种量为液体培养基装料量的5～10%；搅拌，转速为200～350 r／min, 通气量为1:0.3～0.5V／V·min，培养38～52h，获得浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂；
（3）高活性产酶溶杆菌C3无色生物防霉防腐菌剂的制备
①将步骤（2）制备得到的浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂于60～100℃之间加热2～10min进行热处理；
②无色生物防霉防腐菌剂的制备
将改性活性炭加入热处理后的浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂中进行脱色反应，改性活性炭的加入量是浅棕色的高活性产酶溶杆菌C3防霉防腐菌剂重量的0.5～3.0%，即得到天然的无色生物防霉防腐菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法，其特征在于所述的LB液体培养基的配方为：以100份水的重量计，蛋白胨10份，酵母提取物5份，NaCl　10份。
3.根据权利要求1所述的一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法，其特征在于所述的液体培养基，以100份水的重量计，其配方为：
NaCl                      0.5～1份
豆饼粉                   1.5～3.5份
玉米粉                      1～5份
CaCl2                   0.05～0.1份。
4. 根据权利要求1所述的一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法，其特征在于所述的改性活性炭，是采用醋酸对粉状或粒状活性炭进行改性处理，改性反应体系：1mol/L的醋酸5～20重量份，粉状或粒状活性炭95～80重量份。
5.根据权利要求4所述的一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法，其特征在于所述的改性活性炭，改性反应时间10～30min，反应温度50～70℃，改性后活性炭用水洗除去多余的醋酸直至出洗出水为中性。
6.根据权利要求1所述的一种天然的无色生物防霉防腐菌剂的制备方法，其特征在于所述的脱色反应，反应温度15～30℃，搅拌，转速90～150 r／min，脱色反应时间30min～3h。
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