CN105018460B - 一种磁性固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。本发明公开的固定化芽胞漆酶以Fe₃O₄磁性纳米粒子为载体，通过双功能交联剂将磁性纳米粒子直接固定在芽胞表面；其可通过外加磁场进行快速分离，并反复使用。本发明公布的磁性芽胞漆酶制备方法不需要对磁性纳米粒子进行表面修饰，其过程仅包含芽胞的制备、固定化处理和收集三个步骤，大大降低了制备过程的操作要求，还大大节约了固定化芽胞漆酶的制备成本。本发明提供的磁性固定化芽胞漆酶可直接用于染料的脱色处理，并保持较高的脱色效率。

Description

一种磁性固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种固定化芽胞漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。

背景技术

漆酶(laccase)是一种含铜多酚氧化酶，广泛分布于真菌、细菌、植物和昆虫之中。漆酶可以氧化酚类物质，在介体的辅助作用下，还可以氧化非酚类物质，在染料脱色、饮料处理，制浆漂白以及生物传感器开发中都有研究和应用。芽胞漆酶是指固着在芽胞外衣上的漆酶，是最具代表性的细菌漆酶，其以芽胞作为研究单位，具有耐碱性耐高温的特点，在纺织染料脱色应用中具有明显优势。

近年来对于芽胞漆酶的研究仍处在生化特性描述和简单的染料脱色应用研究上，极少有芽胞漆酶固定化的报道。对酶进行固定化通常可以提高酶的稳定性、易于酶的分离，而且可以提高酶的重复使用率，降低工业化应用的成本。在众多的固定化载体中，磁性纳米粒子是一类非常独特的材料。磁性纳米粒子的直径和重量都极小，且具有超顺磁性，这使得其在使用过程中分散均匀，在使用结束后极易被分离出来。磁性固定化的实施方案非常多，纳米粒子的种类，表面修饰与否，修饰基团类型，固定化的条件等等都会影响酶的固定化效率以及固定化酶的最终使用性能。选择一种经济、简便而且高效的方案在工业化应用中极为重要。

发明内容

本发明旨在提供一种简便可行的芽胞固定化方法，以此方法制备得到可重复利用的固定化芽胞漆酶，并应用于染料脱色。

所述固定化芽胞漆酶通过以下步骤来制备：

(1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞；

(2)固定：称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为5－30nm)，加入到5－15ml 0.02MNa₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入0.5－2.0ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.1－1.0ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于50－250rpm，4－40℃条件下旋转振荡20－240min；

(3)回收：将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗1－5次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于0－40℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的芽胞制备包括以下步骤：

①将产漆酶的芽胞杆菌属菌株在37℃条件下在生孢培养基上培养2d；

②以8000rpm的离心速度对上述培养物进行10min的离心，收集芽胞；

③水洗芽胞1次；

④水洗所得的的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温2h。

⑤培养物经溶菌酶处理后，先后经1M NaCl和1M KCl洗，8000rpm离心10min收集芽胞。

⑥对芽胞进行湿重称量，用去离子水重悬芽胞，浓度为100mg/ml。

其中，所述的芽胞产生菌株包括但不限于Bacillus pumilus W3。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的Fe₃O₄磁性纳米粒子粒径为20nm。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的固定化体系为0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子:10ml Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液:1ml碳二亚胺盐酸盐:0.5ml芽胞。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述固定化混合物经超声处理后在200rpm，37℃条件下旋转振荡30min。

本发明还提供应用上述固定化芽胞漆酶对染料废水进行脱色处理的方法，是向染料废水中添加适量固定化芽胞漆酶，在适当温度、pH条件下，对纺织染料废水进行脱色处理。

所述染料废水中的染料包括但不限于甲基绿、甲基红和酸性红1。

所述脱色处理的pH条件可以为7.0。不同染料的最适脱色pH值可能会有不同。

所述脱色处理的的温度范围为30－70℃。

所述脱色处理可以在150rpm－250rpm转速的摇床或搅拌速度下进行，也可以通过流化床以及其他形式来进行。

所述脱色处理的时间可以是24－48h。

所述脱色处理过程中，可以添加2,2’-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐作为介体，也可以添加其他化合物作为介体或不添加介体。介体添加浓度可以为0.1mM。

针对混合染料脱色时，可先利用游离芽胞漆酶作为催化剂先确定漆酶对混合染料脱色条件的偏好。

本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明提供了一种结合稳定的固定化芽胞漆酶，其可通过外加磁场进行快速分离，并可反复使用。(2)本发明提供的固定化芽胞漆酶制备方法，该方法不需要对磁性纳米粒子进行表面修饰，这大大降低了制备过程的操作要求，还大大节约了固定化芽胞漆酶的制备成本。(3)本发明所提供的固定化芽胞漆酶可直接应用于染料脱色，并保持较高的脱色效率。

具体实施方式

漆酶酶活测定方法：称取0.1g固定化芽胞漆酶置于3.5ml柠檬酸磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 6.8)中，在37℃保温15min，添加底物反应5min，然后进行10min的冰水浴以终止反应，利用磁铁吸附固定化芽胞，取上清液检测吸光值。底物为丁香醛连氮(0.05mM)，检测波长为525nm。

酶活回收率＝固定化芽胞漆酶酶活/(初始酶活－上清液酶活)×100％

初始酶活是指：游离芽胞漆酶酶活。以该游离芽胞漆酶作为对照组，其芽胞量和处理过程与固定化芽胞漆酶相同(不添加载体)。

上清液酶活是指：芽胞与Fe₃O₄磁性纳米粒子混合固定化处理后，上清液中残余酶活。

脱色率用分光光度法在各染料的最大吸收波长处进行检测，各染料的最大吸收波长分别为λ＝630nm(甲基绿)，λ＝435nm(甲基红)和λ＝531nm(酸性红1)。

脱色率＝(对照组吸光值－实验组吸光值)/对照组吸光值×100％

实施例1芽胞漆酶的生产

将Bacillus pumilus W3菌株在37℃条件下于生孢培养基上培养2d，以8000rpm的离心速度对上述培养物进行10min的离心，收集芽胞，然后水洗芽胞1次，将水洗所得的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温2h，培养物经溶菌酶处理后，先后经1MNaCl和1M KCl洗，8000rpm离心10min收集芽胞；对芽胞进行湿重称量，用去离子水重悬芽胞，浓度为100mg/ml。

实施例2固定化方案1

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到5ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7，其中含0.1M NaCl)，加入0.5ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.2ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡60min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为92.97％。

实施例3固定化方案2

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到10ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入0.5ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.2ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡60min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为90.12％。

实施例4固定化方案3

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到15ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入0.5ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.2ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡60min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为85.01％。

实施例5固定化方案4

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到10ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入1.0ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.5ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡60min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为90.19％。

实施例6固定化方案5

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到10ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入2.0ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.5ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡60min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为92.56％。

实施例7固定化方案6

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到10ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入0.5ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入1.0ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡60min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为83.38％。

实施例8固定化方案7

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到10ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入2.0ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.5ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡30min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为91.11％。

实施例8固定化方案7

称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为20nm)，加入到10ml 0.02M Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入2.0ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.5ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于200rpm，37℃条件下旋转振荡240min；将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4℃。经测得酶活回收率为92.26％。

实施例9固定化芽胞漆酶的操作稳定性

称取由实施例8制备得到的固定化芽胞漆酶0.1g置于试管中，检测漆酶活性。每次取出上清液后，用磁铁分离固定化芽胞，倒去多余上清液，加入去离子水，振荡洗涤3次，用相同的检测方法再次检测酶活。如此反复检测酶活，评价其操作稳定性。反复操作5次后，固定化芽胞漆酶的仍具初次检测时酶活的93.39％。

实施例10固定化芽胞漆酶用于染料脱色

将实施例8制备所得的固定化芽胞漆酶应用于染料脱色。染料包括甲基绿(4g/l)，甲基红(4g/l)和酸性红1(4g/l)。称取0.2g固定化芽胞漆酶置于试管中，依次加入介体100ul2,2’-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(终浓度为0.1mM)，染料(分别为100ul甲基绿，50ul甲基红和50ul酸性红1)，最后加入0.1M柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 7.0)使其最终反应体系为4ml。将混合反应液放入摇床，在200rpm，37℃条件下脱色24h。最终染料脱色率如表1所示。

表1：固定化芽胞漆酶应用于染料脱色的脱色效率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种磁性固定化芽胞漆酶，其特征在于，以未经表面修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子为载体，通过双功能交联剂将磁性纳米粒子结合在芽胞表面，其具体制备方法包括以下步骤：

(1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞；

(2)固定：称取0.1g其粒径为5－30nm的Fe₃O₄磁性纳米粒子，加入到5－15ml 0.02M pH7、其中含有浓度为0.1M的NaCl的Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液中，加入0.5－2.0ml浓度为4mg/ml的碳二亚胺盐酸盐，超声处理10min，接着加入0.1－1.0ml湿重为100mg/ml的芽胞，超声处理30min，然后置于50－250rpm，4－40℃条件下旋转振荡20－240min；

(3)回收：将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗1－5次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于0－40℃。

2.权利要求1所述的磁性固定化芽胞漆酶，其特征在于，其制备步骤(2)所述的磁性纳米粒子粒径为20nm。

3.权利要求1所述的磁性固定化芽胞漆酶，其特征在于，其制备步骤(2)所述的固定化体系为0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子:10ml Na₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液:0.5ml碳二亚胺盐酸盐:0.5ml芽胞。

4.权利要求1所述的磁性固定化芽胞漆酶，其特征在于，其制备步骤(2)所述固定化混合物经超声处理后在200rpm，37℃条件下旋转振荡30min。

5.权利要求1所述的固定化芽胞漆酶在染料脱色处理中的应用。