CN108384767A - 转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括T7C+S47C位点。具有上述突变位点的转氨酶突变体，其酶活性和/或稳定性大大提高，能够在相对极端的环境中应用。而且，具有上述突变位点的转氨酶突变体可以进一步通过固定化技术制备成固定化酶，且其固定化酶的活力和稳定性较高，能够被多次回收再利用，适合应用于填充床连续流反应。

Description

转氨酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。
背景技术
ω-转氨酶(ω-TA)属于转移酶类，同其他的转氨酶类一样，催化一个氨基与酮基互换的过程。大部分情况下ω-转氨酶是指一类酶，只要某个酶催化的转氨反应中，反应的底物或产物中不含有α-氨基酸，就可以称该酶为ω-转氨酶。ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。对映体手性胺是具有广泛生物活性的许多药物化合物的关键中间体(ChemBioChem.9，2008，363-365，Chem.Commun.46，2010，5569-5571，Biotechnol.Bioeng.108，2011，1479-1493)。因其底物相对廉价、产物纯度高的特点，受到研究人员越来越多的关注(Green Chemistry,2017,19，2:333-360.)。并且转氨酶已经显现出应用于生产手性胺的希望(Organic Process Research&Development,2010,14,234-237)。
尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在放大生产应用中存在很多问题。如酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；易受反应体系中有机溶剂的影响而变性失活等。
另外，在分离产品胺的过程中，只能通过使酶变性失活形成沉淀后除去并丢弃，无法再利用；或将产品用有机溶剂从水溶液中萃取出，酶继续存在于水溶液中，但此时由于pH及溶剂等众多苛刻条件的影响使酶失活，无法再利用。
现有技术中有报道通过固定化技术将酶进行固定化以提高酶的回收再利用的问题。然而，目前固定化技术在脂肪酶、青霉素酰化酶、淀粉酶等领域的研究较多，因为这些酶相比其他酶有更好的稳定性，固定化后酶活性的损失较低。而对于大部分转氨酶而言，其稳定性较差，尤其是当体系中存在有机相时，固定化操作过程中容易引起酶活损失，因而，对转氨酶的固定化的研究较少，适合连续化反应的固定化的转氨酶的研究更少。
对于能够催化下列底物1和底物2进行氨基转换反应的转氨酶而言，如果用游离的转氨酶催化该反应，游离酶不能回收，只能使用一次。且由于反应体系中酶蛋白的存在使得后处理乳化现象极其严重，产物分离困难。
若将所用转氨酶固定化后，理论上可以实现酶的回收利用，但现有的用于催化底物1或底物2的转氨酶固定化后的酶活回收率依旧很低。而且，由于现有的底物酮(氨基受体)大多都水溶性不好，无法在纯水相中进行连续化反应。若要实现连续化反应，则需要加入足够的有机助溶剂使底物溶解，但现有的转氨酶对温度、pH及有机溶剂的耐受性差，有机溶剂易使其失活。因而也难以实现其固定化处理。
因此，需要对现有的能够催化上述底物的转氨酶进行改进，以改善其在有机溶剂等极端环境中稳定性差而应用受限的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种转氨酶突变体及其应用，以解决现有技术中的转氨酶活性在极端环境中耐受性差而使得应用受限的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括T7C+S47C位点。
进一步地，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：M356L、F364L、C404L、M430L、R405E/A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F/A、G110P、K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E以及A286T，其中“/”表示“或”。
进一步地，发生氨基酸突变的位点还包括如下任一种组合突变位点：K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286TR405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368PR405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种转氨酶突变体。
根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述任一种DNA分子。
根据本发明的第四个方面，提供了一种固定化转氨酶，该固定化转氨酶包括上述任一种转氨酶突变体。
进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体的转氨酶交联酶聚集体；优选地，转氨酶突变体经沉淀得到转氨酶聚集体，转氨酶聚集体中游离的氨基、酚基、咪唑基或巯基进一步与交联剂交联得到的转氨酶交联酶聚集体，其中，交联剂选自戊二醛、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、双马来酰亚胺及右旋糖苷中的任意一种；优选地，转氨酶交联酶聚集体为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的交联酶聚集体：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L；优选地，右旋糖苷的分子量为6KDa～200KDa；优选地，转氨酶聚集体为转氨酶突变体经乙醇沉淀得到；优选地，转氨酶聚集体中游离的氨基与戊二醛交联得到转氨酶交联酶聚集体。
进一步地，固定化转氨酶为转氨酶包埋-交联固定化酶；优选地，转氨酶包埋-交联酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的包埋-交联固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L；优选地，转氨酶突变体中游离氨基与戊二醛形成席夫碱交联得到转氨酶交联酶，转氨酶交联酶包埋至聚丙烯酰胺凝胶网格中得到转氨酶包埋-交联固定化酶。
进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体与载体共价连接的共价固定化酶；优选地，共价固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的共价固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T；优选地，载体为壳聚糖载体、树脂载体；更优选地，壳聚糖载体通过羟基和/或氨基与转氨酶突变体共价结合形成共价固定化酶；更优选地，树脂载体包括基质及与基质连接的官能团，基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与基质连接的官能团选自C2短链氨基、C4中链氨基、C6长链氨基或环氧基；进一步优选地，树脂载体选自ECR8309、ECR8315、EC-HFA、LX-1000HA、LX-1000EA、ECR8409、ECR8415、EC-EP、EC EP403、EXE119、LX-1000EP、Immobead-150A、Immobead-150P、Immobead350A、ECR8206、ECR8209、ECR8215或ECR8285。
进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体与载体经金属离子螯合而成的螯合固定化酶；优选地，螯合固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的螯合固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T；优选地，载体为多孔玻璃载体；进一步优选地，多孔玻璃载体为EziG-101、EziG-102或EziG-103。
进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体与载体经物理吸附结合的吸附固定化酶；优选地，吸附固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的共价固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C；优选地，载体为树脂载体；更优选地，树脂载体包括基质及与基质连接的官能团，基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与基质连接的官能团为十八烷基；进一步优选地，树脂载体选自ECR8806、ECR1030、ECR1090、ECR1061、ECR1091、ECR8804、Immobead-EC1、Immobead-S60S、Immobead-S861、X17S0409、EXE120或Diaion。
根据本发明的第五个方面，提供了一种生产手性胺的方法，包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体或上述任一种固定化转氨酶。
进一步地，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体，上述方法为批次反应；优选批次反应的反应体系为水相反应体系。
进一步地，转氨酶为上述任一种固定化转氨酶，上述方法为连续化反应；优选连续化反应的反应体系为有机相反应体系。
进一步地，酮类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C6～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，酮类化合物为 转氨基反应产物为优选地，氨基供体为异丙胺。
应用本发明的技术方案，通过对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的转氨酶进行定向进化，筛选得到了一系列其酶活性和/或稳定性大大提高的转氨酶突变体，这些突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基础上发生突变的氨基酸序列，其中突变的氨基酸位点包括T7C+S47C位点。包含上述突变位点的转氨酶突变体，能够在相对极端的环境中应用。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
名称解释：
定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒PCR引入定点突变是简单有效，且目前使用较多的手段。其原理是：一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。突变质粒转化至宿主细胞，诱导表达出目标蛋白。
易错PCR：意为易错条件下的PCR,即容易使复制出的DNA序列出现错误的PCR技术，又称错配PCR或倾向错误PCR。具体是指通过利用低保真度TaqDNA聚合酶和改变PCR反应条件，降低DNA复制的保真度，在新DNA链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。
易错PCR是目前最简单、有效的基因体外随机诱变技术，其原理是：碱基的异构为错配提供了可能，组成DNA的4种碱基都有互变异构体存在，其中鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)3种含氧碱基有酮式和烯醇式两种互变异构体。腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶两种含氮碱基，有胺式、亚胺式两种互变异构体。G、C和T主要以酮式结构存在，烯醇式结构的比率极低，A和T两种含氮碱基上的氮原子主要以氨基(NH2)状态存在，以亚胺基(NH)状态存在的比率极低。不同同分异构体之间氢原子位置的不同及同一位置电子云偏离方向的不同，可使得碱基的配对形式发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错配。例如当胸腺嘧啶以酮式结构存在时，与腺嘌呤配对，而以烯醇式结构存在时，与鸟嘌呤配对，这样就出现了A能配上C，T能配上G的不稳定碱基对，从而造成错配。
在已知的几种耐热DNA聚合酶中，TaqDNA聚合酶的错配率最高。Taq DNA聚合酶是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，具有5'-3'外切酶活性，不具3'-5'外切酶活性，因此在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能，所以比有3'-5'校对活性的DNA聚合酶发生错配的概率较高。DNA聚合酶的保真性可以通过多种方法来降低，包括使用4种浓度不同dNTP、添加Mn2+、提高Mg2+浓度等。几种诱变方法导致扩增DNA链碱基变异的机理各不相同。MnC12是DNA聚合酶的诱变因子，加入Mn2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率；4种dNTPs浓度的不平衡可以提高碱基错误掺入的概率，实现错配；Mg2+具有激活Taq酶的作用，增加Mg2+浓度，使之超过正常用量，能稳定非互补的碱基对；提高TaqDNA聚合酶用量、增加每个循环延伸时间，可以增加错配终端延伸的概率；降低起始模板浓度，会使后面PCR循环的变异模板比例增加。
固定化酶：是指在一定的空间范围内，其催化作用能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶固定化之后，一般稳定性增加，易从反应体系中分离，易于控制，能多次使用，便于运输和储存，有利于自动化生产，但活性降低，使用范围减小。
固定化酶载体基质：指形成固定化酶载体骨架的材料。
本申请中，所涉及到的1wt均指转化1g底物需要1g转氨酶突变体重组湿细胞。
本申请中，所涉及的1V等于反应体系的体积/底物的质量。
本申请为了解决现有技术中的转氨酶活性在极端环境中耐受性差而使得应用受限的问题，本申请一种典型的实施方式对来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的R416T位点发生突变的转氨酶进行了定向进化，得到了一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体具有SEQID NO:1所示的序列发生氨基酸突变的序列，其中，发生氨基酸突变的位点包括T7C+S47C位点。在相对极端的环境下，R416T+T7C+S47C位点发生突变的转氨酶突变的转氨酶活性较R416T突变体有明显提高。
以下将结合试验对上述技术方案和技术效果进行说明。
一、对极端环境耐受性提高的突变体的筛选
本申请对来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的氨基转移酶进行改造，得到酶活性提高的R416T突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该酶活性好，但是稳定性还不理想，为了提高该酶的稳定性，又以R416T突变体为模板，设计了五组双点突变，Q78C+A330C，V137C+G313C，A217C+Y252C，T7C+S47C，L295C+328C，引物序列是利用QuikChange Primer Design网页设计得到。通过全质粒PCR的方式在突变体R416T上引入突变位点，以pET-22b(+)为表达载体，获得新的突变位点的突变质粒。
将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在25℃，0.1mM IPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。将突变菌株表达的酶液在45-50℃，pH9.5，20％DMSO的极端环境下处理1h后，加入底物1或底物2，使用1wt的酶量继续在此条件下反应16h后检测转化率。利用此方式筛选出稳定性提高的突变体，其中T7C+S47C位点的突变体(R416T+T7C+S47C)活性较R416T突变体有明显提高，在此条件下，R416T催化的转化率为15％，而突变体R416T+T7C+S47C催化的转化率为72％。
进一步地，以R416T+T7C+S47C突变体为母本，设计了33对定点突变(具体引物采用QuikChange Primer Design网页设计得到)(M356L、W360L、F364L、C404L、M430L、M438L、C445A、F449V、R405E、R405A、K90G、K190R、K219T、K304D、K51R、W187Y、K193E、K143R、N151M、S8P、A33P、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P)，经QuikChange Primer Design网页设计引物序列，利用定点突变手段，以pET-22b(+)为表达载体获得带有目的基因的突变质粒。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，并在25℃、0.1mM IPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
将突变菌株表达的酶液在30-45℃、pH 9.5-10、50％DMSO的极端环境下处理1h后、加入底物1或底物2、继续在此条件下反应16h后检测转化率。以此方式筛选出温度、pH及有机溶剂耐受性增强的突变体。筛选结果为：突变位点在M356L、F364L、C404L、M430L、R405E、R405A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P的突变体、对30℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高8％-40％。某些突变体对45℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高1.7倍～2.1倍、某些突变体对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高3.7倍～3.9倍。
以R416T+T7C+S47C突变体为母本，定点突变所筛选到的分别在不同极端环境下耐受性得到提高的具体突变体见下表1和表2。
表1：定点突变所获的对30℃、pH 9.5、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。
表2：定点突变所获的对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。
为简单有效地筛选出更理想的突变体、本申请还采用易错PCR技术对R416T+T7C+S47C突变体进行随机突变。
本申请经易错PCR方法，将获得目的基因片段连接至pET-22b载体上，获得带有目的基因的突变质粒。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，并在25℃、0.1mMIPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜。最后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
将突变菌株表达的酶液在30-45℃、pH9-10、有机溶剂浓度为50％DMSO或35％MeOH的极端环境下处理1h后，加入底物1或2，继续在此条件下反应16h后检测转化率。以此方式筛选出对温度、pH及有机溶剂耐受性增强的突变体。筛选结果显示：突变位点在K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E、A286T的突变体对30℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高16％-45％、某些突变体对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高117％～537％、某些突变体对30℃、pH8、35％MeOH环境的耐受性较母本提高233％～649％。
以R416T+T7C+S47C突变体为母本，易错PCR所筛选到的分别在不同极端环境下耐受性得到提高的具体突变体见下表3至表5。
表3：易错PCR所获对30℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。
突变位点 耐受性提高程度 突变位点 耐受性提高程度
R416T+T7C+S47C 无 K193I 38％
F111Y 16％ K190E 31％
Q380L 41％ R305H 43％
I297L 42％ A286T 45％
K69N 24％ G201C 28％
表4：易错PCR所获对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。
突变位点 耐受性提高程度 突变位点 耐受性提高程度
R416T+T7C+S47C 无 Q380L 509％
K190E 191％ K193I 312％
F111Y 238％ I297L 537％
R305H 174％ K190E 191％
K69N 124％ G201C 117％
表5：易错PCR所获对30℃、pH 8、35％MeOH环境的耐受性提高的单点突变体。
突变位点 耐受性提高程度 突变位点 耐受性提高程度
R416T+T7C+S47C 无 R305H 497％
F111Y 233％ I297L 576％
K190E 403％ K193I 579％
A286T 623％ Q380L 649％
K69N 288％ G201C 294％
为进一步进化出稳定性和耐受性更好的转氨酶，本申请将这些转氨酶稳定性和耐受性提高的位点进行多点组合突变，然后通过定向筛选的方法获得稳定性和耐受性进一步提高的多点突变体。
进行组合突变的突变位点来自于K51R、W187Y、R405E、K90G、A95P、K304D、Q380L、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P、I297L、K69N、G201C、A286T。
该组合突变是对这些位点进行任意组合。具体而言，包括但不限于如下突变组合：K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286T、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。
将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在25℃、0.1mMIPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
在更极端的条件下、如45℃、pH9.5-10、含50％DMSO或35％MeOH的环境下将酶液处理1h后、加入底物1、继续在此条件下反应16h、检测转化率。某些组合突变体对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性较母本提高231％～610％、某些组合突变体对30℃、pH8、35％MeOH环境的耐受性较母本提高213％～990％、某些组合突变体对45℃、pH8、40％MeOH环境的耐受性较母本提高3000％之多。具体的耐受性提高的组合突变体见下表6至表8。
表6：对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性提高的组合突变体。
表7：对30℃、pH8、35％MeOH环境的耐受性提高的组合突变体。
表8：对45℃、pH8、40％MeOH环境的耐受性提高的组合突变体。
二、对本申请的转氨酶突变体进行固定化
2.1转氨酶交联酶聚集体(CLEAs)的制备
本申请中，分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行交联法固定，制备转氨酶交联酶聚集体。
一般地，交联酶聚集体的制备主要分两步进行：(1)酶蛋白聚集沉淀体的形成；(2)沉淀体之间的交联。
酶蛋白可以通过盐析法、等电点沉淀法、重金属盐沉淀法或有机溶剂沉淀法等方法凝聚沉淀，得到酶蛋白沉淀体(Aggregates)。一般情况下，这种酶蛋白沉淀为可逆沉淀，能重新在水溶液中溶解。
在蛋白沉淀后、加入交联剂使蛋白沉淀体间进一步通过共价键相连、形成水不溶性沉淀-交联酶聚集体。使用的交联剂为双功能或多功能试剂，双功能试剂有戊二醛、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、双马来酰亚胺等、多功能试剂右旋糖苷(分子量为6KDa～200KDa)。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
制备固定化酶液的缓冲液中含有0.4-1mg/mL的PLP、酶液pH为7.0-8.0。制备酶蛋白沉淀所用的沉淀剂为乙醇、异丙醇和/或硫酸铵，沉淀剂终浓度为90％。制备酶蛋白的交联聚集体所用的交联剂为25％戊二醛溶液，戊二醛终浓度为200mM-500mM。
制备的交联酶聚集体、可以直接使用过滤得到的含水交联酶在水相进行催化反应、或将含水的交联酶冻干得到干粉后再应用。冻干粉还可以应用于有机溶剂相中的反应。交联酶聚集体使用一次后、可以通过离心或过滤等方式回收后再使用，在与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，交联酶聚集体在水相反应中应用，与游离酶相比，活力回收＞80％，母本R416T+T7C+S47C可重复使用3次，而在母本基础上的单点突变体和/或组合突变体的重复使用次数较母本明显提高，其中最好的突变体的重复使用次数可达13次。
某些突变体的交联酶在含35％甲醇的体系中反应可重复使用至少6次。突变体游离酶活性稳定性提高，固定化后酶活回收及重复使用次数也提高。
使用交联酶催化反应，反应后处理从水相中用有机溶剂萃取产品，乳化现象明显减轻。制备交联酶无需载体、成本低、使用交联酶催化反应、重复使用次数多、综合使用次数、酶用量减少、使用成本较游离酶低。交联酶冻干粉在100％的有机相溶剂中反应，母本重复使用第二次时，其活性与第一次相比损失＞10％。而某些突变体的重复使用可达5次，活性与第一次相比损失＜5％。
2.2转氨酶的包埋-交联固定化方法
CLEAs无载体支撑，固定化酶颗粒小(＜10μm)，机械强度较差，过滤回收酶的过程中，酶容易板结，下次使用时不能很好地分散在反应体系中。为解决这一问题，可以结合交联和包埋两种技术先采用戊二醛作为交联剂，在含有酶液、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合液中，滴加戊二醛使其和自由酶形成希夫碱制得交联酶聚集体，加入引发剂过硫酸铵形成聚丙烯酰胺凝胶，而交联酶聚集体便被包埋至聚丙烯酰胺凝胶矩阵中，从而得到稳定的固定化酶。
本申请中，分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行包埋-交联法固定，制备包埋-交联酶。
制备的包埋-交联酶，酶活回收＞80％，水相反应使用一次后、经过滤等方式极易回收后再使用，在与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，母本R416T+T7C+S47C可重复使用8次，而在母本基础上的单点突变体和/或组合突变体的重复使用次数较母本明显提高，其中最好的突变体的重复使用次数可达18次。
某些突变体的包埋-交联酶在含35％甲醇的体系中反应可重复使用至少12次。后处理从水相中用有机溶剂萃取产品，乳化现象明显减轻。
2.3转氨酶的吸附固定化方法
酶分子与水不溶性载体通过静电作用、氢键、疏水作用等方式吸附结合可制备得到吸附固定化酶。该方法条件温和，不易引起酶的变性，但在水溶液中酶很容易与载体脱离，无法回收再利用，因此吸附法制备的固定化酶主要应用于有机溶剂中的反应。
可用于吸附固定化酶的载体分为无机载体和高分子载体两大类。无机载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；高分子载体有淀粉、谷蛋白、大孔型合成树脂、陶瓷等。
本申请所用载体为大孔合成树脂载体，包括基质以及可选的修饰该基质的官能团，其中，基质包括但不限于聚苯乙烯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂或苯乙烯与甲基丙烯酸酯的共聚物。除此之外，各类载体可经十八烷基官能团修饰。下表9所列为适用于本申请中转氨酶吸附固定化的载体。
表9.吸附型载体
载体名称 基质 官能团
Diaion 聚甲基丙烯酸酯 无
X17S0401 聚甲基丙烯酸酯 无
ECR8806 聚甲基丙烯酸酯 无
EXE120 聚甲基丙烯酸酯 十八烷基
ECR-1030 聚甲基丙烯酸酯 无
ECR-1090 聚苯乙烯 无
本申请将转氨酶与大孔树脂载体直接通过疏水键、氢键等物理方式结合。
分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行物理吸附结合法固定。
制备酶液所用的缓冲液中含有0.4-1mg/mL的PLP、缓冲液pH为7.0-8.0、缓冲盐为Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-Cl或硼酸-氢氧化钠。
制备得到的吸附固定化酶可以通过氮气吹干、真空干燥、冷冻干燥等方式进行干燥处理。
本申请将转氨酶以吸附的方式结合至上述载体，活力回收＞80％；在有机溶剂中反应，固定化酶经过滤或注射器吸出液体等方式回收，可重复使用。与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，对于某些突变体的固定化酶，可重复使用6次，活性损失＜5％。
2.4转氨酶的共价固定化方法
酶的共价固定化，是酶蛋白的非必需基团与水不溶性载体通过共价键形成不可逆的连接，在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。与载体共价结合的基团，通常不能是酶表现活力所必需的基团。
2.4.1共价固定化的酶载体
固定化酶载体可以是无机材料的如二氧化硅、玻璃、矿物质及硅藻土等、也可以是天然有机材料、如羧甲基纤维素、右旋糖苷、琼脂糖、果胶、壳聚糖等、还有非天然有机合成聚合物如聚苯乙烯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂、或苯乙烯与甲基丙烯酸酯的共聚物。这些载体还可以进一步官能团化、以利于同蛋白分子的结合、如在载体上加入氨基、羟基、环氧基、十八烷基等官能团。其中氨基和羟基官能团化的载体可以和酶蛋白分子通过离子键结合、氨基型载体还可以与酶蛋白共价结合、环氧基官能团的载体主要和酶蛋白通过共价键相连、十八烷基官能团的载体与酶分子通过疏水作用结合。载体可以采用任何形状或形式、如薄膜、管、片、珠、颗粒、芯片、光纤等。
本申请所用载体为壳聚糖、树脂以及多孔玻璃。
壳聚糖因其生物相容性好、形状可塑性高(可以做成凝胶、薄膜、纤维等形状)、无毒、、以及易于被化学修饰等特点、可以作为酶固定化的载体(ProcessBiochem,2005；40:2833–40)。壳聚糖本身可溶于水、需要先将其制备成水不溶性的载体颗粒、制备方法有溶剂蒸发法、乳化法、以及凝聚法等(MacromolBiosci,2003；3:511–20)。乳化法制得的载体颗粒较小且均一、通常为首选。壳聚糖分子中有活泼的羟基和氨基等、可将酶通过离子键、氢键和范德华力等作用吸附结合、但吸附作用弱、酶易脱落、常用交联剂甲醛、戊二醛等活化后再与酶共价结合。
本申请所用树脂载体，包括基质以及修饰该基质的官能团，其中，基质包括但不限于聚苯乙烯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂及苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物。此类基质带有的合适的官能团包括但不限于短链氨基、长链氨基和环氧基。下表10所列为适用于本申请中转氨酶固定化的载体。
表10：
载体名称 基质 官能团
ECR8309 聚甲基丙烯酸酯 短链氨基(C2)
ECR8409 聚甲基丙烯酸酯 长链氨基(C6)
ECR8285 聚甲基丙烯酸酯 环氧基
本申请将转氨酶与具有环氧基官能团的树脂直接通过共价键结合、与经戊二醛活化后的具有氨基官能团的树脂通过共价键结合。
2.4.2共价固定化的方法
本申请分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行共价结合法固定。
制备酶液所用的缓冲液中含有0.4-1mg/mL的PLP、缓冲液pH为7.0-8.0、缓冲盐为Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-Cl或硼酸-氢氧化钠。本申请所用壳聚糖分子量包括但不限于300-500KDa，通过乳化法制备载体，载体经戊二醛活化后，加入酶液，20℃孵育6h，过滤或离心后收集沉淀，沉淀用缓冲液润洗。
共价固定化至氨基型载体，首先将载体用戊二醛活化，再加入酶液，20℃孵育过夜，过滤收集沉淀，沉淀用缓冲液润洗。共价固定化至环氧基型载体，直接将酶液与载体混合，20℃孵育过夜，随后静置20h，过滤收集沉淀，沉淀用缓冲液润洗。
制备得到的固定化酶可以通过氮气吹干，真空干燥，冷冻干燥等方式进行干燥处理。
本申请将转氨酶以共价结合的方式固定化至上述载体，固定化至壳聚糖载体，活力回收为50％-60％；固定化至短链氨基型载体，活力回收为50％-70％；固定化至长链氨基型载体，活力回收为70％-80％；固定化至环氧基型载体，活力回收为40％-60％。突变体的固定化酶活性与母本固定化酶比，有明显提高。固定化酶经过滤或注射器吸出液体等方式回收，可重复使用。在与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，对于某些固定化至壳聚糖载体的酶，可重复使用3次，活性损失＜5％；固定化至短链氨基型载体，某些酶可以重复使用5次；固定化至长链氨基型载体，对于某些突变体的酶，重复使用次数可达11次；固定化至环氧基型载体，某些酶可以重复使用6次。突变体固定化酶的可重复使用次数比母本固定化酶明显提高。共价固定化后的某些转氨酶，在100％有机溶剂中可以发挥催化作用，一些突变体固定化后在有机溶剂中反应，重复使用3次，活性损失＜5％。在35％甲醇溶液中发挥催化作用，一些突变体在固定化后，重复使用5次，活性损失＜5％。
2.5金属离子螯合固定化方法
多孔玻璃因其材质惰性、透水性好等特点、非常适用于做酶固定化的基质。玻璃及其孔道表面的硅烷醇基作为结合位点跟酶结合、实现固定化、但是传统玻璃其表面硅烷醇基密度有限而且分布不均、与酶结合位阻大、蛋白负载量低(Science,2010,329,305-309、JChromatogr,1976,125,115-127)、而且容易使酶失活。在多孔玻璃内外表面覆盖一层有机聚合物薄膜、可形成更有利于酶固定化的环境(Langmuir,2004,20,10639-10647)。聚合物薄膜可根据需要经进一步修饰、在表面加上适合于固定化的各种官能团。
带有组氨酸标签的蛋白可以经固相金属亲和层析法进行纯化、蛋白中的组氨酸残基可以与螯合在水不溶性基质上的金属离子(Ni2+、Co2+、Fe3+)经螯合作用相连、然后可用含咪唑的缓冲液将目标蛋白洗脱下来(Nature,1975,258,598-599)。基于这项技术、可以将带有组氨酸标签的酶与末端螯合有金属离子的载体特异性螯合、达到固定化的目的、同时这种方法固定化特异性高、杂蛋白几乎不会被固定。
本申请所用的玻璃载体是经聚合物薄膜在多孔玻璃内外表面进行涂层，聚合物薄膜可以是亲水的如丙烯酸聚合物、半亲水的苯乙烯与丙烯腈聚合物和疏水的如氯甲基苯乙烯聚合物。薄膜表面经氨基修饰，再经2,4-二羟基苯乙酮酰基化，而2,4-二羟基苯乙酮的羟基再与金属离子螯合，从而通过2,4-二羟基苯乙酮的手臂作用，一端与载体结合，另一端与金属离子螯合，使得玻璃载体末端带有金属离子，可以与带有组氨酸标签的蛋白亲和结合，实现特异性固定化(ChemicalCommunications,2014,50(65):9134-7)。螯合的金属离子包括但不限于为Ni2+、Co2+、Fe3+。下表11所列为适用于本申请中转氨酶固定化的载体。
表11：
载体名称 性质 金属离子
EziG-101 亲水 Fe3+
EziG-102 半亲水 Fe3+
EziG-103 疏水 Fe3+
本申请分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行共价结合法固定。
制备酶液所用的缓冲液中含有0.4-1mg/mL的PLP、缓冲液pH为7.0-8.0、缓冲盐为Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-Cl或硼酸-氢氧化钠。
共价固定化至多孔玻璃载体，直接将酶液与载体混合，20℃孵育40-60min，过滤收集沉淀，沉淀用缓冲液润洗。
制备得到的固定化酶可以通过氮气吹干，真空干燥，冷冻干燥等方式进行干燥处理。
本申请将转氨酶以螯合的方式结合至上述载体，活力回收约70％-80％；固定化酶经过滤或注射器吸出液体等方式回收，可重复使用。在水相溶剂中反应，与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，对于某些突变体的固定化酶，可重复使用12次，活性损失＜5％；有机溶剂中反应，第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，对于某些突变体的固定化酶，可重复使用8次。
三、固定化转氨酶的使用方法
本申请的固定化转氨酶可将底物1和底物2所示的氨基受体转化为对应的伯胺，所用的氨基供体为异丙胺。
本申请的固定化转氨酶可以在如下溶剂中应用：100％水溶液、含20％-50％DMSO的溶剂、含35％甲醇的溶剂或100％的水饱和有机溶剂(比如，可以是100％水饱和甲基叔丁基醚或100％水饱和乙酸异丙酯)。
本申请的固定化酶可以应用于搅拌形式的批次反应中，也适用于填充于管道反应器中的连续流反应。
批次搅拌反应操作方式为：将原料即氨基受体、氨基供体、固定化酶、辅酶PLP及溶剂一次性加入到反应容器中，通过机械搅拌的方式，反应16h以上。反应结束后，通过过滤的方式将固定化酶回收，应用到下一轮的反应。
连续反应的操作方式为：将固定化酶填充到管式反应器中，将原料即氨基受体、氨基供体及辅酶PLP用合适的溶剂完全溶解配制成反应液，用柱塞泵将反应液以合适的流速注入到填充了固定化酶的管式反应器中，出口处用溶剂接收产品溶液。
连续反应操作时，溶剂可以为35％的甲醇溶液，或100％的水饱和甲叔醚。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例一：突变体30℃，pH9.5，50％DMSO耐受性检测
将粗酶在30℃，pH9.5，DMSO浓度为50％的环境下处理1h，然后在10mL的反应瓶中，加入0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和0.6-1mgPLP(5’-磷酸吡哆醛)，再加入上述处理后的酶5mg，在30℃，pH9.5，DMSO浓度为50％的环境恒温搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，突变体反应数据如下表12。
表12：
实施例二：突变体45℃，pH10，50％DMSO耐受性检测
粗酶在45℃，pH10，DMSO浓度为50％的环境下处理1h，然后在10mL的反应瓶中，加入0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和0.6-1mgPLP(5’-磷酸吡哆醛)，再加入经上述处理后的酶5mg，在45℃，pH10，DMSO浓度为50％的环境恒温搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，突变体反应数据如下表13。
表13：
实施例三：突变体30℃，pH8，35％甲醇耐受性检测
将粗酶在30℃，pH8，35％MeOH浓度的环境下处理1h，然后在10mL的反应瓶中，加入0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和0.6-1mgPLP(5’-磷酸吡哆醛)，再加入经上述处理后的酶5mg，继续在30℃，pH8，35％MeOH浓度的环境恒温搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，突变体反应数据如下表14。
表14：
实施例四：突变体45℃，pH8，40％甲醇耐受性检测
将粗酶在45℃，pH8，40％MeOH浓度的环境下处理1h，然后在10mL的反应瓶中，加入0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和0.6-1mgPLP(5’-磷酸吡哆醛)，再加入经上述处理后的酶5mg，继续在45℃，pH8，40％MeOH浓度的环境恒温搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，突变体反应数据如下表15。
表15：
实施例五：交联固定化
0.1g酶粉用2mL磷酸缓冲液(0.1MPB，pH7.0-8.0，含0.4-1mg/mL PLP(5’-磷酸吡哆醛))溶解，冰水浴搅拌下缓慢加入18mL乙醇，或18mL异丙醇，或硫酸铵(终饱和度90％)作为沉淀剂，加毕，搅拌10min后，再加入1.1～2.7mL25％戊二醛溶液(终浓度200-500mM)，冰水浴搅拌30-40min后离心或过滤，沉淀用磷酸缓冲液洗3次后，4℃保存，可直接应用于水相反应。或将交联酶聚集体冻干，冻干后得到的交联酶聚集体冻干粉可在水相和有机相反应中应用。
实施例六：交联酶聚集体水相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.3mLDMSO，溶解0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mgPLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1MPB7.0至反应液终体积为1mL，再加入5mg酶或由5mg酶制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体冻干粉，在45℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表16。
表16：
实施例七：交联酶有机相反应验活
10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和甲基叔丁基醚，再加入10mg底物1及4eq异丙胺，然后加入由10mg酶粉制备的交联酶聚集体冻干粉，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表17。
表17：
实施例八：转氨酶包埋-交联固定化酶水相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.4mL DMSO(DMSO终浓度为40％)，溶解0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入5mg酶或由5mg酶制备的包埋-交联固定化酶，在45℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表18。
表18：
实施例九：转氨酶包埋-交联固定化酶35％甲醇水溶液中反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.35mL甲醇(甲醇终浓度为40％)，溶解0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入10mg酶或由10mg酶制备的包埋-交联固定化酶，在30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表19。
表19：
实施例十：转氨酶吸附固定化方法
向载体中入4mL含0.4mg/mLPLP的PB缓冲液(100mM，pH7.0)，同时加入0.1g酶，20℃，80rpm低速搅拌过夜。去上清，沉淀用缓冲液清洗3-4遍，去上清，沉淀用氮气吹干，或冷冻干燥法干燥，4℃保存。
实施例十一：转氨酶吸附固定化酶有机相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和甲基叔丁基醚，再加入10mg底物1及4eq异丙胺，然后加入由20mg酶制备的固定化转氨酶，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表20。
表20：
实施例十二：壳聚糖为载体固定化转氨酶
壳聚糖载体制备：5g壳聚糖(分子量300KDa-500KDa)加入到250mL1％乙酸溶液中，微波炉加热溶解，制得水相。300mL甲苯与2.2g司盘80，1.2mL正己醇混匀，室温搅拌2h，制得油相。将水相在搅拌下缓慢滴加至油相中，制得乳剂，再将乳剂倒入至1.5L12％NaOH溶液中，搅拌3h，加入1L乙醇，过滤，用纯化水彻底清洗滤饼，得到约40g湿载体，将湿载体浸泡在140mL纯水中，4℃保存。
活化载体：每毫升湿载体，加入1.1mL25％戊二醛(戊二醛终浓度2.5％)。
固定化：向活化好的载体中加入0.2g酶，20-25℃搅拌6h，清洗载体，离心，去上清，沉淀即为固定化酶，4℃保存。
实施例十三：C6型氨基型载体固定化转氨酶
活化载体：1g载体ECR8409用20mM低离子强度的缓冲液清洗1-2遍，除去上清液，加入4mL2％戊二醛(由20mM低离子强度的缓冲液稀释试剂级25％戊二醛配制)，20℃，80rpm活化1h，用20mM的缓冲液清洗1-2遍，去上清。
固定化：向活化好的载体中入4mL含0.4mg/mLPLP的PB缓冲液(20mM，pH7.0)，同时加入0.1～0.2g酶，20℃，80rpm低速搅拌过夜。去上清，沉淀用缓冲液清洗3-4遍，去上清，沉淀用氮气吹干，或冷冻干燥法干燥，4℃保存。
实施例十四：环氧基型载体固定化转氨酶
1g载体ECR8285用100mM PB缓冲液清洗1-2遍，除去清液，加入4mL Buffer(100mMPB，pH7.0，含1M NaCl)，同时加入0.1g～0.2g酶，20℃，80rpm低速搅拌过夜(18-20h)，再于4℃静置20h。去上清，沉淀用Buffer清洗3-4遍，用氮气吹干，4℃保存
实施例十五：共价固定化转氨酶水相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.4mL DMSO(DMSO终浓度为40％)，溶解0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入5mg酶或由5mg酶制备的固定化转氨酶，在45℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表21。
表21：
实施例十六：共价固定化转氨酶35％甲醇水溶液中反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.35mL甲醇(甲醇终浓度为40％)，溶解0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入10mg酶或由10mg酶制备的固定化转氨酶，在30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表22。
表22：
实施例十七：共价固定化转氨酶有机相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和乙酸异丙酯，再加入10mg底物1及4eq异丙胺，然后加入20mg酶或由20mg酶制备的固定化转氨酶，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表23。
表23：
实施例十八：共价固定化酶转氨酶填充床连续反应(以甲醇作为底物的助溶剂)
75g突变体R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L固定化至ECR8409载体的固定化酶填充至反应器中，柱体积(CV)150mL，用柱塞泵将2CV缓冲液(0.1M的PB7.0，含5mg/mLPLP，2M异丙胺盐酸盐)注入填充床中。将配制的反应液(0.5M底物1，2M异丙胺盐酸盐，5mg/mLPLP，35％MeOH)用柱塞泵注入填充床，40℃水浴,流速0.25mL/min，保留时间约600min，转化率＞98％，连续操作240h，转化率无降低。
实施例十九：玻璃载体螯合固定化转氨酶
1g EziG-101、EziG-101或EziG-103多孔玻璃载体用缓冲液(20mM Tris-Cl 8.5)清洗1-2遍，除去上清，向载体中加入20mL Buffer，同时加入酶粉或酶液，20℃，80rpm低速搅拌1h，去上清，沉淀用Buffer清洗3-4遍，过滤，真空干燥，4℃保存。
实施例二十：EziG-101多孔玻璃载体螯合固定化转氨酶水相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.2mL DMSO，溶解0.1g底物1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和0.5mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入0.1g酶粉或由0.1g酶粉经EziG-101载体螯合法制备的固定化酶，在45℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表24。
表24：
实施例二十一：多孔玻璃载体螯合固定化转氨酶有机相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和甲基叔丁基醚，再加入10mg底物1及4eq异丙胺，然后加入20mg酶或由20mg酶制备的固定化转氨酶，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表25。
表25：
从以上实施例可以看出，本申请通过定向进化筛选得到的活性、稳定性、对温度、pH及有机溶剂耐受性提高的突变体，不仅降低生产应用中的用酶量，而且大大提高了制备成各种固定化酶的可能性。而且，本申请通过上述定向进化后的转氨酶进行固定化(自身交联或与载体共价结合)，实现固定化转氨酶在水相反应和有机相反应的应用，使酶与反应体系易于分离，并减少反应后处理过程中因残留酶蛋白而造成的乳化现象，同时固定化转氨酶突变体能够耐受各种极端环境，活性损失小，重复利用次数高，从而实现了底物1和底物2的连续化转氨反应。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已、并不用于限制本申请、对于本领域的技术人员来说、本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内、所作的任何修改、等同替换、改进等、均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120> 转氨酶突变体及其应用
<130> PN79043KLY
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)
<400> 1
Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala
1 5 10 15
His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly
20 25 30
Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu
35 40 45
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val
50 55 60
Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu
65 70 75 80
Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val
85 90 95
Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp
100 105 110
Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile
115 120 125
Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro
165 170 175
Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly
180 185 190
Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu
195 200 205
Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val
210 215 220
Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu
245 250 255
Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe
260 265 270
Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys
290 295 300
Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val
325 330 335
Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile
340 345 350
Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu
355 360 365
His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Thr
405 410 415
Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg
420 425 430
Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala
450 455

Claims (15)

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，所述发生氨基酸突变的位点包括T7C+S47C位点。
2.根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：M356L、F364L、C404L、M430L、R405E/A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F/A、G110P、K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E以及A286T，其中“/”表示“或”。
3.根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述发生氨基酸突变的位点还包括如下任一种组合突变位点：K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286T、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。
4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的转氨酶突变体。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的DNA分子。
6.一种固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶包括权利要求1至3中任一项所述的转氨酶突变体。
7.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体的转氨酶交联酶聚集体；
优选地，所述转氨酶突变体经沉淀得到转氨酶聚集体，所述转氨酶聚集体中游离的氨基、酚基、咪唑基或巯基通过与交联剂交联得到所述转氨酶交联酶聚集体，其中，所述交联剂选自戊二醛、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、双马来酰亚胺及右旋糖苷中的任意一种；
优选地，所述转氨酶交联酶聚集体为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的交联酶聚集体：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L；
优选地，所述右旋糖苷的分子量为6KDa～200KDa；
优选地，所述转氨酶突变体经乙醇沉淀得到所述转氨酶聚集体；
优选地，所述转氨酶聚集体中游离的氨基与戊二醛交联得到所述转氨酶交联酶聚集体。
8.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为转氨酶包埋-交联固定化酶；
优选地，所述转氨酶包埋-交联固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的包埋-交联固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L；
优选地，所述转氨酶突变体中游离氨基与戊二醛形成席夫碱交联得到转氨酶交联酶，所述转氨酶交联酶包埋至聚丙烯酰胺凝胶网格中得到所述转氨酶包埋-交联固定化酶。
9.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体与载体共价连接的共价固定化酶；
优选地，所述共价固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的共价固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T；
优选地，所述载体为壳聚糖载体或树脂载体；
更优选地，所述壳聚糖载体通过羟基和/或氨基与所述转氨酶突变体共价结合形成所述共价固定化酶；
更优选地，所述树脂载体包括基质及与所述基质连接的官能团，所述基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与所述基质连接的官能团选自C2短链氨基、C4中链氨基、C6长链氨基或环氧基；进一步优选地，所述树脂载体选自ECR8309、ECR8315、EC-HFA、LX-1000HA、LX-1000EA、ECR8409、ECR8415、EC-EP、EC EP403、EXE119、LX-1000EP、Immobead-150A、Immobead-150P、Immobead350A、ECR8206、ECR8209、ECR8215或ECR8285。
10.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体与载体经金属离子螯合而成的螯合固定化酶；
优选地，所述螯合固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的螯合固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T；
优选地，所述载体为多孔玻璃载体；
进一步优选地，所述多孔玻璃载体为EziG-101、EziG-102或EziG-103。
11.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体与载体经物理吸附结合的吸附固定化酶；
优选地，所述吸附固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的吸附固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C；
优选地，所述载体为树脂载体；
更优选地，所述树脂载体包括基质及与所述基质连接的官能团，所述基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与所述基质连接的官能团为十八烷基；进一步优选地，所述树脂载体选自ECR8806、ECR1030、ECR1090、ECR1061、ECR1091、ECR8804、Immobead-EC1、Immobead-S60S、Immobead-S861、X17S0409、EXE120或Diaion HP2MG。
12.一种生产手性胺的方法，包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1至3中任一项所述的转氨酶突变体或权利要求6至11中任一项所述的固定化转氨酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1至3中任一项所述的转氨酶突变体，所述方法为批次反应；优选所述批次反应的反应体系为水相反应体系。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述转氨酶为权利要求6至11中任一项所述的固定化转氨酶，所述方法为连续化反应；优选所述连续化反应的反应体系为有机相反应体系。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C6～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述酮类化合物为 其中转氨基反应的产物为 优选地，氨基供体为异丙胺。
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