JP2004531243A - ニトリラーゼを使用してニトリルをカルボン酸に転換する改良された方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ニトリラーゼ触媒を使用して、対応するニトリルからカルボン酸を調製するための改良された方法に関する。より詳細には本発明は、アルギン酸塩中に固定化され、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンと架橋されたニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸に転換する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、ニトリルを対応するカルボン酸に転換する改良された方法に関する。より詳細には、本発明は、脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸のアンモニウム塩に転換する。
【背景技術】
【0002】
ニトリラーゼ酵素は水溶液中で、アミドの中間体形成なしにニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に直接的に転換する。ニトリラーゼは、多様な微生物中で同定されており、例えば(非特許文献1);(非特許文献2)は、脂肪族ニトリルの対応するカルボン酸アンモニウム塩への加水分解を触媒する、ロドコッカス・ロドキュラス(Rhodococcus rhodochrous) K22から単離される脂肪族ニトリラーゼについて記載している。アルカリゲネス・ファカリス(Alcaligenes faecalis) 1650の立体特異性ニトリラーゼは、キラルカルボン酸の製造においてラセミ体ニトリルを分解するのに使用されており、ニトリラーゼをコード化する遺伝子はクローン化され発現されている(特許文献1)。脂肪族、芳香族、および複素環式ニトリルの加水分解を触媒するニトリラーゼは、高温細菌Bacillus pallidus strain Dac521から単離されている(非特許文献3)。ロドコッカス・ロドキュラス NCIMB 40757またはNCIMB 40833からのニトリラーゼは、アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転換するのに使用されている(特許文献2)。様々な脂肪族α,ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩またはジカルボン酸ジアンモニウム塩のどちらかに転換できるニトリラーゼが、コマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)から単離されている(特許文献3;非特許文献4)。アシドボラックス・ファシリス(Acidovorax facilis) 72Wのニトリラーゼ活性による、脂肪族α,ω−ジニトリルの対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩への位置選択的加水分解についても報告されている(非特許文献5)。
【0003】
水溶液中で脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するのに、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの2つの酵素の組み合わせも使用できる。ここでは脂肪族ニトリルは、最初にニトリルヒドラターゼによってアミドに転換され、次にアミドはアミダーゼによって引き続き対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換される。ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、バチルス属(Bacillus)、Bacteridium、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、およびミクロコッカス属(Micrococcus)をはじめとする多種多様の細菌属が、多様な範囲のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有することが知られている。(非特許文献6)は、最近ニトリル分解微生物のニトリラーゼとニトリルヒドラターゼ/アミダーゼ酵素系の双方をレビューした。
【0004】
2−メチルグルタロニトリルは、生体触媒を使用してω−シアノカルボン酸アンモニウム塩(すなわち4−シアノペンタン酸のアンモニウム塩)に位置選択的に転換できる脂肪族α,ω−ジニトリルの一例である。生体触媒による4−シアノペンタン酸の調製については、(特許文献4)およびその分割特許(特許文献5)、(特許文献6)、(特許文献7)、(特許文献8)、(特許文献9)、および(特許文献10)で既に記載されている。これらの特許は、脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性、あるいはニトリルヒドラターゼ(EC 4.2.1.84)およびアミダーゼ(EC 3.5.1.4)活性の組み合わせを有する触媒を使用して、水溶液中で脂肪族α,ω−ジニトリルをω−シアノカルボン酸のアンモニウム塩に転換する方法に関する。脂肪族α,ω−ジニトリルがω−炭素原子で非対称に置換されている場合、ニトリラーゼは98%を超える位置選択性で、ω−ニトリル基の加水分解からもたらされるω−シアノカルボン酸アンモニウム塩を生じる。(特許文献4)は、アシドボラックス・ファシリス 72Wを酵素触媒として使用する前に10〜120分間の熱処理(35〜70℃)に曝す、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸に転換する方法を具体的に開示する。この熱処理は望ましくない非位置選択的ニトリルヒドラターゼ活性を破壊しながら、望ましい位置選択的脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性を選択するのに重要であった。次に4−シアノペンタン酸は、1,5−ジメチル−2−ピペリドンの商業的調製のための一段階化学法で、基質としての機能を果たすことができる。1,5−ジメチル−2−ピペリドンには、電子部品クリーニング、フォトレジスト除去、工業的脱脂および金属クリーニング、樹脂クリーンアップ、インク調合物、工業的接着剤をはじめとする工業用溶剤としての、ポリマーと化学薬品のための反応溶剤しての多くの用途がある。
【0005】
商業規模用途では、生体触媒である固定化微生物細胞を使用することは、固定化されない細胞の使用と比較して、多くの既知の経済上の利点を有する。利点のいくつかは、それらを繰り返し使用する能力、それらの分離の容易さ、および連続反応におけるそれらの使用である。ポリマーマトリックス内への細胞包含によって、生成物および基質の高い拡散を保ちながら、生細胞または代謝的不活性細胞の取り込みが可能になる。固定化のための典型的なマトリックスの例は、アルギン酸ナトリウム(非特許文献7)またはカラゲナン(非特許文献8)である。取り込み方法は比較的単純で、ゲル材料は無毒で低価格である。
【0006】
固定化細胞の「任意の」安定性は、細胞と、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンまたはヘキサメチレンジアミンなどの多官能性試薬とを共有結合的に架橋する架橋剤による、細胞ビーズの引き続く処理によってさらに増大できる。一例では、L−アスパラギン酸製造のためにκカラゲナン中に固定化されたE.coli細胞(非特許文献9)に関する安定性が研究された。架橋処理として使用された最適化濃度のヘキサメチレンジアミンおよびグルタルアルデヒドによって、固定化細胞の半減期は、未処理の固定化細胞の5倍以上に顕著に延長した。
【0007】
さらにBirnbaumら(Biotechnol.Lett.3:393〜400(1981))は、アルギン酸カルシウム固定化細胞の物理的安定性を増大する方法を開示している。1つの安定化方法では、ポリエチレンイミン処理(24時間)を使用し、グルタルアルデヒド架橋(1〜5分間)が続く。ビーズ安定性は、固定化細胞を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液内で10日間培養して検査された。固定化細胞からの細胞放出がわずかなことが観察されたことで、ビーズの完全性の改良が実証される。同時に全体的な触媒活性は、このプロトコルによって有害に影響された。Birnbaumは、この影響がおそらくグルタルアルデヒドの毒性によるものであると提案した。
【0008】
最後に、微生物細胞全体または微生物細胞材料を直接的に固定化するため、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドを添加する好ましい順序は、グルタルアルデヒドに対する固定化酵素活性の感受性に左右されると理解されている。(特許文献11)は、グルタルアルデヒド感受性酵素(チオール酵素、あるいはSH基が酵素分子の活性部位にある、またはその非常に近くにあるものなど)が、グルタルアルデヒドなどのチオール反応性作用物質によって不活性化されることを開示する。これらのタイプの酵素触媒では、発明は、起こり得る酵素活性損失を打ち消すために、微生物細胞材料を最初にポリエチレンイミンで処理して、グルタルアルデヒドを同時にまたは引き続いて添加することが必要である。対照的に(特許文献12)は、酵素がグルタルアルデヒド感受性でない微生物を固定化する場合、ポリエチレンイミンの前にグルタルアルデヒドを導入することが望ましいことを教示する。この場合、得られる固定化細胞は、グルタルアルデヒド添加前のポリエチレンイミン前処理で固定化した細胞よりも、容易に水性媒体から回収される。どちらの場合でも微生物細胞は、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドによる処理前に、ゲルまたはポリマーマトリックス内に取り込まれない。
【0009】
【特許文献1】
WO 00/23577明細書
【特許文献2】
米国特許第5,998,180号明細書
【特許文献3】
CA 2,103,616明細書
【特許文献4】
米国特許第5,814,508号明細書
【特許文献5】
米国特許第5,858,736号明細書
【特許文献6】
米国特許第5,908,954号明細書
【特許文献7】
米国特許第5,922,589号明細書
【特許文献8】
米国特許第5,936,114号明細書
【特許文献9】
米国特許第6,077,955号明細書
【特許文献10】
米国特許第6,066,490号明細書
【特許文献11】
米国特許第4,288,552号明細書
【特許文献12】
米国特許第4,355,105号明細書
【非特許文献1】
KobayashiらTetrahedron 46:5587〜5590(1990)
【非特許文献2】
J.Bacteriology,172:4807〜4815(1990)
【非特許文献3】
Almatawahら、Extremophiles3:283〜291(1999)
【非特許文献4】
S.Levy−Schilら、Gene 161:15−20(1995)
【非特許文献5】
Gavaganら、J.Org.Chem.,63:4792−4801(1998)
【非特許文献6】
Cowanら(Extremophiles 2:207〜216(1998))
【非特許文献7】
Bucke、Methods in Enzymology 135:175〜189(1987)
【非特許文献8】
Chibataら、Methods in Enzymology 135:189〜198(1987)
【非特許文献9】
Chibata,I.Immobilized Microbial Cells;Venkatsubramanian,K.,Ed.;ACS Symposium Series 106;American Chemical Society;Washington,DC,1979,pp187〜201
【非特許文献10】
Felix,Bioprocess.Technol.11:259〜278(1991)
【非特許文献11】
Felix,Anal.Biochem.120:211〜234(1982)
【非特許文献12】
Klein,J.およびVorlop,K.D.,Biotechnology FocusI;Finn,R.F.,Ed.;Oxford University Press:NewYork;1998,pp325〜336
【非特許文献13】
Smidsrodら、Trends Biotechnol.8,71〜78(1990)
【非特許文献14】
Gavaganら、Appl.Microbiol.Biotechnol.,52:654〜659(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって解決すべき問題は、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するための触媒として使用すると、高い比活性および長期の物理的完全性を有する、固定化細胞触媒を製造する経済的な方法の開発である。より具体的には、より高い収率とより高い濃度の4−シアノペンタン酸を生じ、使用が以前開示されているものよりも便利な酵素触媒を使用する方法によって、技術は進歩するであろう。
【課題を解決するための手段】
【0011】
出願人らの発明は、a)ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる触媒酵素をアルギン酸塩中に固定化する工程と、b)第1の安定剤、次に第2の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程a)の固定化酵素触媒に添加する工程と、c)工程b)の生成物を適切な水性反応混合物中でニトリルに接触させる工程と、d)工程c)で生成したカルボン酸を塩または酸の形態で単離する工程とを含む、カルボン酸を製造する方法であって、第2の安定剤が第1の安定剤以外であるならば、第1の安定剤および第2の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択される方法である。任意に工程c)およびd)を繰り返しても良い。発明の好ましい実施態様としては、工程c)のニトリルが2−メチルグルタロニトリルであるもの、工程c)の水性反応混合物が反応過程で20:1を超える(より好ましくは200:1を超え、最も好ましくは750:1を超える)NH4 +:Ca2+比を有するもの、工程d)で単離されるカルボン酸が4−シアノペンタン酸であるものが挙げられる。
【0012】
好ましい酵素触媒は、アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−15(ATCC 55747)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−17(ATCC55745)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)SS1001(ATCC PTA−1177)、またはエシェリキア・コリ SW91(ATCC PTA−1175)であり、酵素触媒は細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態である。酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)である場合、アルギン酸塩中で固定化する前に、熱処理によって酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を不活性化する必要はない。
【0013】
(微生物の寄託の簡単な説明)
出願人らはブダペスト条約の取り決めの元に、以下の微生物の寄託を行った。
【0014】
【表1】
【0015】
ここでの用法では、「ATCC」とは、10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110−1109,U.S.A.にあるAmerican Type Culture Collection International Depositoryを指す。「ATCC No.」とは、ATCCに寄託された培養株の受け入れ番号である。列挙した寄託株は、表示国際保管所に少なくとも30年保持され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の可用性は、政府の行為によって付与される特許権を失効させる、対象発明の実施免許を意味するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換する、改良された方法に関する。より詳細には本発明は、脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸のアンモニウム塩に転換する。出願人らは、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒をアルギン酸カルシウム中に固定化し、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンと架橋した後に得られる触媒を使用して、架橋された固定化酵素触媒の物理的完全性の迅速な損失の帰結が予期される条件下において、少なくとも1.50Mの濃度で4−シアノペンタン酸アンモニウム塩を製造することが可能であることをここで開示する。PEI添加に先立つ固定化細胞のグルタルアルデヒド処理が、測定可能なニトリラーゼ活性の損失なしに実施できること、あるいはアンモニウム/カルシウムイオン比が20:1の比率を超えないことが推奨されている場合に、少なくとも750:1で反応させることが、触媒ビーズの物理的完全性に影響しないことは予想外であった。酵素触媒は物理的完全性の損失なしに、多数の連続リサイクル反応で再利用された。
【0017】
出願人らは(カラゲナンを使用して調製された対応する酵素触媒とは対照的に)、グルタルアルデヒド/ポリエチレンイミン−架橋アルギン酸塩−固定化酵素触媒のニトリラーゼ活性が、触媒ビーズ中の乾燥細胞重量の濃度増大と共に増大することをさらに開示する。アルギン酸塩−固定化酵素触媒の使用は、カラゲナン固定化酵素触媒と比較すると、触媒使用量を基準にした全体的な生成物収率を増大させて有利である。
【0018】
出願人らは、酵素触媒アシドボラックス・ファシリス 72Wを固定化する場合、細胞をアルギン酸塩内に固定化して、得られる酵素触媒を安定剤グルタルアルデヒドとポリエチレンイミンに架橋する際、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化するのに通常必要な熱処理が必要でないことをさらに開示する。特にニトリラーゼがグルタルアルデヒドによって不活性化できることは既知であり、固定化手順が測定可能なニトリラーゼ活性損失を生じることなく、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を選択的かつ完全に不活性化することは予想外であった。
【0019】
ここで開示される方法の改良は、既知の方法と比較して、以前得られたよりも高い濃度でより高い生成物収率(触媒重量あたりの生成物重量を基準にして)をもたらす。クレーム方法の生成物は、農業および製薬産業で高価値なポリマー、溶剤(例えば1,5−ジメチル−2−ピペリドン)、および化学物質の前駆物質として有用である。
【0020】
本願明細書では、特に断りのない限り以下の略語と定義が適用される。
「グルタルアルデヒド」は、GAと略する。
「ポリエチレンイミン」は、PEIと略する。
「2−メチルグルタロニトリル」は、2−MGNと略する。
「4−シアノペンタン酸」は、4−CPAと略する。
【0021】
「酵素触媒」とは、ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる触媒を指す。触媒は、微生物細胞全体または透過性処理微生物細胞(群)の形態であっても良い。
【0022】
「水性反応混合物」は、水、濃度が少なくとも2mMのカルシウム塩、任意に反応の初期pHを5〜10、好ましくは6〜8に保てる緩衝液を含有する水性混合物を指すために使用される。
【0023】
「水性生成物混合物」は、対応する工程段階からもたらされる生成物を含有する水性混合物を指すために使用される。
【0024】
2−メチルグルタロニトリル(2−MGN)を4−シアノペンタン酸(4−CPA)アンモニウム塩に転換する方法の顕著な改良をここで開示する。具体的には本発明の顕著な改良は、1)好ましくはアシドボラックス・ファシリス 72Wに由来するニトリラーゼ活性によって特徴付けられる酵素触媒をアルギン酸塩中に固定化する工程と、2)グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンを(好ましくはこのこの順で)固定化酵素触媒に、各安定剤の架橋を達成するのに適切な量で十分な時間をかけて順次に添加する工程と、3)適切な水性反応混合物中で2−MGNと架橋された固定化酵素触媒とを接触させる工程と、4)4−CPAを酸またはアンモニウム塩として単離する工程と、5)次に架橋された固定化酵素触媒を少なくとも1回リサイクルする工程と含む方法によってもたらされる。本発明の利点は、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するために、ニトリラーゼ活性によって特徴付けられるその他の酵素触媒(例えばロドコッカス・ロドキュラス、アルカリゲネス・ファカリス、Bacillus pallidus、コマモナス・テストステロニ、Nocardia sp.、Acinetobacter sp.、およびArthrobacter sp.)を使用する際にも実現化できる。
【0025】
(酵素触媒固定化)
酵素触媒を固定化するための方法は、2つの異なるポリマーマトリックス、ナトリウムアルギン酸塩、およびΚ−カラゲナンを使用して開発された。細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態の酵素触媒は、アルギン酸塩またはカラゲナン中に固定化でき、透過性処理の方法は当業者には周知であり、凍結融解、あるいは有機溶剤または洗剤による処理(非特許文献10);(非特許文献11)が挙げられるが、これに限定されるものではない。アルギン酸塩中の細胞固定化は、固定化が5℃程度の低い温度で実施できることから有利である。対照的にカラゲナン固定化は、典型的に45〜50℃の温度を必要とし、これはニトリラーゼの不活性化をもたらすことができる。
【0026】
グルタルアルデヒド(GA)およびリエチレンイミン(PEI)処理を固定化プロトコルに加えて、触媒リサイクルによる多数回の連続反応に適するように、ビーズの機械的安定性をさらに増大させた。アルギン酸塩ビーズ酵素触媒を架橋するために添加されるGAおよびPEIの量は、それぞれ触媒ビーズ中に存在する乾燥細胞重量あたり25重量%から、触媒ビーズ中に存在する乾燥細胞重量あたり2重量%の範囲であり、触媒ビーズに添加されるGAとPEIとの比は3:1〜1:3の範囲である。2つの架橋安定剤は、最初にGA次にPEI、あるいは最初にPEI次にGAのどちらかの順で固定化酵素触媒に添加される。2つの架橋安定剤の好ましい添加順序は、最初にGA次にPEIである。第2の安定剤の添加は、第1の安定剤を架橋させるのに十分な時間遅らされる。固定化酵素触媒のGA架橋時間は、5分〜2時間、好ましくは30分〜1時間の範囲である。固定化酵素触媒のPEI架橋時間は、30分〜24時間、好ましくは1時間〜12時間の範囲である。
【0027】
グルタルアルデヒドがアシドボラックス・ファシリス 72Wニトリラーゼ酵素を不活性化する(実施例1)ことが知られていたため、GA/PEIの組み合わせが特定のニトリラーゼ活性への損害なしに、固定化細胞触媒を成功裏に安定化させることは知られておらず予想外であった。(非特許文献6)では、ニトリラーゼ酵素が、活性化されたチオール残基によるニトリル炭素への求核攻撃によって作用することが開示されており、(特許文献11)は、チオール−酵素などのグルタルアルデヒド感受性酵素がグルタルアルデヒドによって不活性化されることを記載している。
【0028】
カルシウム架橋アルギン酸塩は、高濃度のその他のカチオン存在下で安定でないことが報告されている。具体的には、20:1または25:1のアンモニウム/カルシウムイオン比を上回ることは奨励されていない(非特許文献12);(非特許文献13)。Kleinらは、高比率のL−グルロン酸を有するアルギン酸塩に対しては、電解質(Na+、K+、NH4 +、Mg2+のモル濃度合計)とCa2+との比率が20:1より高くなってはならないと述べている。本出願では、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンとの架橋後、アルギン酸塩は(高比率のL−グルロン酸を含有する)酵素触媒をゲル化し、少なくとも195回の連続バッチ反応でリサイクルして高濃度の4−シアノペンタン酸アンモニウム塩を製造する際に、それらの物理的完全性を保つ。最小カルシウムイオン濃度2mMを含有するこれらの反応では、アンモニウムイオンとカルシウムイオンの比は、典型的に少なくとも750:1(実施例4参照)である。反応は、アンモニウムイオンとカルシウムイオンの比が200:1、750:1、および950:1で実施された。これらの結果は確かに予見できないものだった。
【0029】
商業的方法を実施する際、ここで触媒の酵素活性/重量として定義される比活性が高いことが望ましい。本出願では、アルギン酸塩ビーズ中の乾燥細胞重量の増大する濃度と共に、ニトリラーゼ比活性が増大したが、カラゲナンビーズ中では増大しなかった。カラゲナンビーズでは、乾燥細胞重量の50%の増大により、30℃での小さな活性増大(7%)、あるいは35℃でのわずかな比活性減少のどちらかがあった(実施例4参照)。
【0030】
(グルタルアルデヒド/ポリエチレンイミン架橋アルギン酸塩中のアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)固定化)
微生物アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)は、脂肪族ニトリルまたはジニトリルに曝された土壌サンプルから予め単離されている(特許文献4およびその分割特許特許文献5、特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、および特許文献10)。(特許文献4を本願明細書に援用する。)アシドボラックス・ファシリス 72Wを微生物の全細胞触媒として、非対称に置換されたα−alkyl−α,ω−ジニトリルの加水分解のために使用すると、所望のω−シアノカルボン酸に加えて、対応するジカルボン酸モノアミドおよびジカルボン酸が生じる。この全細胞触媒の望ましくない非位置選択的ニトリルヒドラターゼ活性は、望ましくないジカルボン酸モノアミドを生じて、それはアミダーゼによって対応するジカルボン酸にさらに転換された。アシドボラックス・ファシリス 72Wのニトリラーゼ活性によって特徴付けられるが、アシドボラックス・ファシリス 72Wのニトリルヒドラターゼ活性を示さないアシドボラックス・ファシリス 72−PF−15、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−17、エシェリキア・コリ SS1001、およびエシェリキア・コリ SW91などの酵素触媒は、望ましくないジカルボン酸モノアミドおよびジカルボン酸副産物を生じない。
【0031】
適切な緩衝液中でアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)懸濁液を35〜70℃に短時間加熱することで、望ましいニトリラーゼ活性に影響せずに、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性が不活性化されることが分かった。したがって極めて高い位置選択性で2−メチルグルタロニトリル(2−MGN)を4−シアノペンタン酸(4−CPA)アンモニウム塩に加水分解するための以前の方法では、アシドボラックス・ファシリス 72Wの懸濁液を35〜70℃で熱処理して望まれないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化し、望まれない副産物2−メチルグルタル酸の生成を除外することが必要であった(非特許文献14);特許文献4)。熱処理はニトリラーゼ活性の損失を生じることなく、固定化細胞触媒を調製するのに日常的に使用された。
【0032】
4−シアノペンタン酸商業的製造のための本発明は、アルギン酸塩中の非熱処理アシドボラックス・ファシリス 72W細胞を固定化することで望まれないニトリルヒドラターゼ活性のおよそ90%を除去するという、さらなる利点を提供する。引き続くアルギン酸塩固定化アシドボラックス・ファシリス 72W細胞のグルタルアルデヒド(GA)またはグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミン(GA/PEI)架橋は、触媒による望ましくない副産物(2−メチルグルタル酸)の生成率を、熱処理されて検出可能なニトリルヒドラターゼ活性を持たない細胞で観察された率にまで、さらに低下させる(実施例10参照)。(特許文献4)でこれまで必要であった熱処理工程がもはや必要なくなったので、出願人らの開示は意外であり予想外であった。アルギン酸塩中でのアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の固定化とそれに続くGAまたはGA/PEI架橋が、望ましいニトリラーゼ活性の測定可能な損失を同時に引き起こすことなく、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を選択的かつ完全に不活性化することは知られていなかった。ニトリラーゼがグルタルアルデヒドによって不活性化されることが知られていたので、結果は特に予想外であった。
【0033】
(2−メチルグルタロニトリルの加水分解:)
加水分解反応の温度を選択して、反応速度と酵素触媒活性の安定性の双方を最適化した。反応温度は、懸濁液の氷点のすぐ上(約0℃)から60℃の範囲でも良く、好ましい反応温度範囲は5℃〜35℃である。固定化酵素触媒懸濁液は、触媒を蒸留水中、または反応の初期pHを5.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.0に保つ緩衝液中に懸濁して調製しても良い。反応が進行すると、ジニトリルの対応するニトリル官能性からのカルボン酸アンモニウム塩形成のために、反応混合物のpHは変化するかもしれない。反応は、pH調節なしにジニトリルが完全に転換するまで実施でき、あるいは反応の経過に伴って適切な酸または塩基を添加して、所望のpHを保つことができる。塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムをはじめとするが、これに限定されるものではないカルシウム塩を少なくとも2mMの濃度で加水分解反応に添加して、架橋された固定化酵素触媒の物理的完全性を保つ。
【0034】
4−シアノペンタン酸はまた、(触媒の除去後)に濃HClによって反応混合物のpHを2.0〜2.5に調節し、得られる溶液を塩化ナトリウムで飽和して、4−シアノペンタン酸を適切な有機溶剤(酢酸エチル、エチルエーテル、またはジクロロメタンなど)で抽出して、生成物混合物から単離しても良い。次に有機抽出物を一緒にして適切な乾燥剤(例えば硫酸マグネシウム)と共に撹拌して濾過し、溶剤を(例えばロータリー蒸発によって)除去して、所望の生成物を高収率および高純度(典型的に純度98〜99%)で製造する。所望するならば、生成物を再結晶または蒸留によってさらに精製できる。代案としては、1,5−ジメチル−2−ピペリドンの調製と同様に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩を引き続く反応で直接的に使用しても良い(特許文献4およびその分割特許特許文献5、特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、および特許文献)。
【0035】
(実施例)
発明をさらに例証する制限を意図しない以下の実施例では、2−メチルグルタロニトリルの%回収率、および微生物の加水分解反応中に形成する加水分解生成物4−シアノペンタン酸および2−メチルグルタル酸の%収率は、(特に断りのない限り)反応混合物中に存在する2−メチルグルタロニトリルの初期量を基準とし、屈折率検出器およびSupelcosil LC−18−DBカラム(15cm×4.6mM径)、および10mMの酢酸、10mMの酢酸ナトリウム、および7.5%(v/v)のメタノール/水混液から構成される溶出剤を使用して、HPLCによって求められる。
【0036】
略語の意味は次の通り。「sec」は秒を意味し、「min」は分を意味し、「h」は時間を意味し、「d」は日数を意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「mm」はミリメートルを意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモル濃度を意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「μmole」はマイクロモルを意味し、「g」はグラムを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、「U」は単位を意味し、「dcw」は乾燥細胞重量を意味する。
【実施例1】
【0037】
(グルタルアルデヒドによるアシドボラックス・ファシリス 72Wニトリラーゼ酵素の不活性化)
実施例1は、グルタルアルデヒドがニトリラーゼ活性に有害であることを例証する。
【0038】
アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)のニトリラーゼを細胞抽出物から単離し、Q−Sepharoseイオン交換媒体に通過させ、続いてHiload 16/60Superdex 200カラム上でゲル濾過して、>90%純度に精製した。100mMリン酸緩衝液(pH7.2)中の5mMベンゾニトリル溶液の245nmにおける吸収増大によって示される、ベンゾニトリルの安息香酸への転換率を測定することで、ニトリラーゼ活性を精製中にモニターした。精製した酵素のニトリラーゼ活性は、25.7U/mgタンパクであった。グルタルアルデヒド(0.10M)の存在下で酵素アッセイを実施すると、ニトリラーゼ比活性は6.65U/mgに減少し、74%の酵素活性損失であった。
【実施例2】
【0039】
(アルギン酸カルシウム中のアシドボラックス・ファシリス 72W細胞固定化)
実施例2は、非架橋アルギン酸カルシウムおよびGA/PEI架橋アルギン酸カルシウム、双方の中でのアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)細胞の固定化を例証する。
【0040】
22.9gの蒸留脱イオン水を含有する磁気撹拌棒を装着した100mLメディアボトルに、50℃で1.10gのFMC BioPolymer Protanal(登録商標)LF 10/60アルギン酸塩を迅速に撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながら、アルギン酸塩が完全に溶解するまで75〜80℃に加熱し、得られた溶液を水浴中で25℃に冷却した。0.15M酢酸ナトリウム緩衝液(総容量16mL、pH7.0)中のアシドボラックス・ファシリス 72W懸濁液(50%湿潤細胞重量、11.5%乾燥細胞重量)を50℃に15分間加熱して次に25℃に冷却し、25℃で撹拌しながらアルギン酸塩溶液に添加した。細胞/アルギン酸塩混合物をシリンジで滴下して、213mLの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)に25℃で撹拌しながら添加した。2時間の撹拌後、得られたビーズから緩衝液をデカントし、84mLの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)中に25℃で再懸濁した。撹拌しながら0.88gの水中の25重量%グルタルアルデヒド(GA)を添加し、ビーズを25℃で1.0時間混合した。次に懸濁液に、3.5gの水中の12.5重量%のポリエチレンイミン(PEI)(BASF Lupasol(登録商標)PR971L、平均分子量約750,000)を添加して、ビーズを25℃でさらに1時間混合した。次に架橋したビーズを25℃で84mLの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)で2回洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【0041】
0.20M酢酸カルシウム緩衝液中のビーズ懸濁液にGAとPEIを添加しなかったこと以外は、上述の方法で非架橋ビーズを調製した。
【実施例3】
【0042】
(4−シアノペンタン酸製造における非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズ触媒の比較)
実施例3は、連続バッチ反応においてGA/PEI架橋触媒ビーズが、非架橋ビーズよりも高い収率の4−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【0043】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例2で記載されたように調製された16.5gの非架橋またはGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズのどちらかを入れた。各反応容器に68.25mLの蒸留脱イオン水、1.0mLの0.50M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度5.0mM)、および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを添加し、混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mLの水と混合し、次に0.360mLの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られた各容器内の混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズによる4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ193mM/時間および198mM/時間であった。2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩および2−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でも典型的にそれぞれ98.5%および1.5%の収率であった。
【0044】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述の条件下で、これらのビーズをさらに11回の連続バッチ反応で再利用した。表1に示すように、非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズによる、反応12での4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ64mM/時間および118mM/時間であった。11回のリサイクル反応の各セット完了時に、4−シアノペンタン酸最終濃度は少なくとも1,550mMであった。
【0045】
【表2】
【実施例4】
【0046】
(4−シアノペンタン酸製造のためのGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズ触媒に対するカルシウムイオン濃度の効果)
実施例4は、高濃度アンモニウムイオン存在下でGA/PEI架橋アルギン酸塩ビーズ触媒が安定化できることを例証する。この発見は先行技術(非特許文献12)に反している。
【0047】
各3個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例2で記載されたように調製された16.5gのGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズを入れた。各反応容器に68.25mlの蒸留脱イオン水および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを入れた。これらの3つの反応混合物の1つに、3つの反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度が、それぞれ5.0mM、2.0mM、または0mMになるように、a)1.0mlの0.50M酢酸カルシウム(pH7.0)、b)0.20M酢酸カルシウム(pH7.0)、またはc)蒸留水を添加した。混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100m)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られた混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。5mM、2mM、または0mMのカルシウムイオンを含有する反応中の4−シアノペンタン酸生成速度は、それぞれ236mM/時間、233mM/時間、および232mM/時間であった。
【0048】
2−メチルグルタロニトリルの完全な転換後、生成物混合物を触媒ビーズからデカントした。触媒重量を測定し、上述したような条件下で、触媒をさらに10回の連続バッチ反応で再利用した。リサイクル反応の各セットにおける2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸の最終濃度は、前の反応から残留する反応ヒール(触媒と生成物の混合物)のために、少なくとも1,550mMであった。反応の各セットにおける回収された触媒重量を表2に列挙した。
【0049】
【表3】
【0050】
3つの反応混合物中の酢酸カルシウム濃度が、それぞれ2.0mM、1.0mM、および0.5mMであったこと以外は、上述の3回の反応のセットを繰り返した。触媒リサイクルによるさらに10回の反応後、0.5mMの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは粉々になり、反応混合物は顕著な量の粒子状物質を含有した。1.0mMの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは、触媒リサイクルによる12回目の反応で破損し始め、18回目の反応後に触媒は粉々になり、反応混合物は顕著な量の粒子状物質を含有した。2.0mMの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは、触媒リサイクルによる60回に及ぶ連続反応後も粉々にならず、反応混合物中に粒子状物質の顕著な生成はなかった。
【実施例5】
【0051】
(カラゲナン中のE.coli形質転換体SS1001細胞固定化)
実施例5は、カラゲナン中のE.coli形質転換体SS1001(ATCC PTA−1177)細胞の固定化を例証する。
【0052】
250mLメディアボトル(磁気撹拌棒を装着し50℃の64.12gの蒸留脱イオン水を含有する)中に、3.38gのFMC BioPolymer ISAGEL(登録商標)RG300カラゲナンを迅速に撹拌しなからゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながら、カラゲナンが完全に溶解するまで75〜80℃に加熱し、得られた溶液を温度調節された水浴中で55〜56℃(ゲル化温度およそ52℃)に冷却した。0.35Mのリン酸水素ナトリウム緩衝液(総容量45mL、pH7.3)中のE.coli形質転換体SS1001(ATCC PTA−1177)の懸濁液(12.5%乾燥細胞重量)を50℃に12分間加熱し、次に55〜56℃で撹拌しながらカラゲナン溶液に添加した。細胞/カラゲナン混合物を50℃でオーバーヘッド撹拌機を使用して撹拌しながら、直ちに450mlの大豆油にゆっくりと添加した。油中に所望のサイズの細胞/カラゲナン液滴が生じた後に撹拌速度を調節し、油の温度を35℃に低下させて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカントし、0.10Mの重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)で洗浄した。ビーズの20gの部分を48.8mlの0.10M重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)に再懸濁し、0.25gの水中の25重量%グルタルアルデヒドを添加し、ビーズを25℃で1.0時間混合した。次に混合物に1.0gの水中の12.5重量%ポリエチレンイミン(BASF Lupasol(登録商標)PR971L、平均分子量約750,000)を添加し、ビーズを25℃でさらに1時間混合した。次に架橋したビーズを25℃で50mlの0.30M炭酸水素アンモニウム(pH7.3)で洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【実施例6】
【0053】
(4−シアノペンタン酸製造における非架橋およびGA/PEI架橋E.coli SS1001/カラゲナンビーズ触媒の比較)
実施例6は、連続バッチ反応においてGA/PEI架橋カラゲナンビーズ触媒が、非架橋ビーズよりも高い速度で4−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【0054】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例6で記載されたように調製された12.375gの非架橋またはGA/PEI架橋E.coli SS1001(ATCC PTA−1177)/カラゲナンビーズのどちらかを入れた。各反応容器に、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含有する51.9mlの蒸留脱イオン水、および10.71mL(10.17g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを添加し、各混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られる混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCで2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズによる4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ254mM/時間および310mM/時間であった。2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩および2−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でもそれぞれ98.8%および1.2%の収率であった。
【0055】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述したように、触媒ビーズをさらに11回の連続バッチ反応で再利用した。表3は、非架橋およびGA/PEI架橋E.coli SS1001(ATCC PTA−1177)/カラゲナンビーズによる、反応4での4−シアノペンタン酸の生成速度がそれぞれ120mM/時間および290mM/時間であったことを示す。
【0056】
【表4】
【実施例7】
【0057】
(カラゲナン中のアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の固定化)
実施例7は、カラゲナン中のアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)細胞の固定化を例証する。
【0058】
250mLメディアボトル(磁気撹拌棒を装着し50℃の64.12gの蒸留脱イオン水を含有する)中に、3.38gのFMC BioPolymer ISAGEL(登録商標)RG300カラゲナンを迅速に撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながらカラゲナンが完全に溶解するまで75〜80℃に加熱し、得られた溶液を温度調節された水浴中で55〜56℃に冷却した(ゲル化温度およそ52℃)。0.35Mリン酸水素ナトリウム緩衝液(総容量45mL、pH7.3)中のアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の懸濁液(12.5%乾燥細胞重量)を50℃に60分間加熱して、次にカラゲナン溶液に55〜56℃で撹拌しながら添加した。細胞/カラゲナン混合物を50℃でオーバーヘッド撹拌機を使用して撹拌しながら、直ちに450mlの大豆油にゆっくりと添加した。油中に所望のサイズの細胞/カラゲナン液滴が生じた後に撹拌速度を調節し、油の温度を35℃に低下させて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカントし、0.10M重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)で洗浄した。ビーズの20gの部分を48.8mlの0.10M重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)に再懸濁し、0.25gの水中の25重量%グルタルアルデヒドを添加し、ビーズを25℃で1.0時間混合した。次に混合物に1.0gの水中の12.5重量%ポリエチレンイミン(BASF Lupasol(登録商標)PR971L、平均分子量約750,000)を添加し、ビーズを25℃でさらに1時間混合した。次に架橋したビーズを25℃で50mlの0.30M炭酸水素アンモニウム(pH7.3)で洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【0059】
グルタルアルデヒド無添加の非架橋ビーズも0.30M炭酸水素アンモニウム(pH7.3)で25℃で洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【実施例8】
【0060】
(4−シアノペンタン酸製造における非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/カラゲナンビーズ触媒の比較)
実施例8は、連続バッチ反応においてGA/PEI架橋カラゲナンビーズ触媒が、非架橋ビーズよりも高い速度で4−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【0061】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例7で記載されたように調製された16.5gの非架橋またはGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/カラゲナンビーズのどちらかを入れた。各反応容器に、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含有する72.1mlの蒸留脱イオン水、および11.40mL(10.83g、1.0M)の2−メチルグルタロニトリルを添加し、混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られる混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズによる4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ266mM/時間および235mM/時間であった。2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩および2−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でもそれぞれ98.5%および1.5%収率であった。
【0062】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述したように、触媒ビーズをさらに9回の連続バッチ反応で再利用した。表4は非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/カラゲナンビーズによる、反応9での4−シアノペンタン酸の生成速度が、それぞれ144mM/時間および200mM/時間であったことを示す。
【0063】
【表5】
【実施例9】
【0064】
(4−シアノペンタン酸製造のための触媒としてのGA/PEI架橋アルギン酸塩またはカラゲナンビーズ中に固定化されたアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の比較)
実施例9は、乾燥細胞重量の増大する濃度と共に、アルギン酸塩ビーズ触媒ではニトリラーゼの比活性が増大するが、カラゲナンビーズ触媒では増大しないことを例証する。
【0065】
別個の125mLジャケット付き反応容器に、a)16.5gの固定化アシドボラックス・ファシリス 72W触媒ビーズおよび68.25gの蒸留脱イオン水、あるいはb)22gの固定化アシドボラックス・ファシリス 72W触媒ビーズおよび62.75gの蒸留脱イオン水のどちらかを入れた。触媒をGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズ(実施例2で記載された手順に従って調製された)またはGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/カラゲナンビーズ(実施例5で記載された手順に従って調製された)のどちらかから選択した。触媒ビーズは、5%乾燥細胞重量(dcw)または7.5%のdcwのアシドボラックス・ファシリス 72W細胞のどちらかで調製された。7.5%dcwの触媒ビーズでは、完全に架橋された触媒を生じるために、ビーズを架橋するのに使用されるGAおよびPEIの量は2倍になった。各反応容器に1.0mlの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを直ちに添加して、再循環温度浴で温度を保ちながら、各反応混合物を30℃または35℃のどちらかで撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られる混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。表5は、同一反応条件下で2つの触媒で実施された反応中での4−シアノペンタン酸の製造について、反応速度および触媒比活性を列挙する。
【0066】
【表6】
【実施例10】
【0067】
(4−シアノペンタン酸(アンモニウム塩)の調製)
実施例10は、アルギン酸塩中にアシドボラックス・ファシリス 72Wを固定化することで、望まれないニトリルヒドラターゼ活性のおよそ90%が除去されることを例証する。さらにGAまたはGA/PEIは、追加的な望まれないニトリルヒドラターゼ活性を除去する。4−シアノペンタン酸を調製するための先行技術は、望まれないニトリルヒドラターゼ活性を除去するための細胞の熱処理工程を必要とする(特許文献4およびその分割特許、上述)。
【0068】
アルギン酸塩溶液との混合前に、アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)細胞懸濁液を50℃で15分熱処理しなかったこと以外は、実施例2の手順を繰り返して、3つの別個のアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズ触媒を製造した。細胞のニトリラーゼおよびニトリルヒドラターゼ/アミダーゼ活性は、固定化前に0.3Mの2−メチルグルタロニトリルを使用して25℃でアッセイし、2−メチルグルタル酸(2−MGA、細胞のニトリルヒドラターゼ/アミダーゼ活性の生成物)の生成速度は、4−シアノペンタン酸(4−CPA)生成速度の34%であった。実施例2で記載されたようにして調製され加熱された細胞懸濁液では、2−メチルグルタル酸の生成速度は、典型的に4−シアノペンタン酸生成速度の1.5%であった。調製された3つの触媒セットで、1)アシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズの1つめのセットはGAまたはPEIのどちらによっても架橋せず、2)2つめはGAのみで架橋し、3)3つめはのGAとPEIの双方で架橋した。
【0069】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で35℃に温度調節された)の中に、16.5gの上述したように調製された3つの触媒の1つを入れた。次に各反応容器に68.25mlの蒸留脱イオン水、1.0mlの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度2.0mM)、および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチルグルタロニトリルを添加して、混合物を35℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)、および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られた混合物を濾過して(0.22μm)、各濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。GAまたはPEIのどちらによっても架橋されないアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズによる2−メチルグルタル酸の生成速度は、4−シアノペンタン酸生成速度の3.6%であり、34%の低下であった(表6)。GAのみによって架橋されたアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズは、4−シアノペンタン酸生成速度の1.7%である2−メチルグルタル酸生成速度を有し、GAおよびPEI双方によって架橋されたアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズは、4−シアノペンタン酸生成速度の1.5%である2−メチルグルタル酸生成速度を有した。
【0070】
【表7】
【実施例11】
【0071】
(4−シアノペンタン酸製造のためのGA/PEI架橋E.Coli SS1001/アルギン酸塩ビーズ触媒)
反応混合物中に2mMの酢酸カルシウムを使用して、4−シアノペンタン酸製造のために、GA/PEI架橋エシェリキア・コリ(E.coli) 72W SS1001/アルギン酸塩を使用して、GA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W SS1001ビーズ触媒を使用した実施例3の反応を繰り返した。
【0072】
195回の連続触媒リサイクル後、反応速度は初期反応速度の67%で、触媒ビーズの物理的完全性の顕著な損失はなかった。
【0001】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、ニトリルを対応するカルボン酸に転換する改良された方法に関する。より詳細には、本発明は、脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸のアンモニウム塩に転換する。
【背景技術】
【0002】
ニトリラーゼ酵素は水溶液中で、アミドの中間体形成なしにニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に直接的に転換する。ニトリラーゼは、多様な微生物中で同定されており、例えば(非特許文献1);(非特許文献2)は、脂肪族ニトリルの対応するカルボン酸アンモニウム塩への加水分解を触媒する、ロドコッカス・ロドキュラス(Rhodococcus rhodochrous) K22から単離される脂肪族ニトリラーゼについて記載している。アルカリゲネス・ファカリス(Alcaligenes faecalis) 1650の立体特異性ニトリラーゼは、キラルカルボン酸の製造においてラセミ体ニトリルを分解するのに使用されており、ニトリラーゼをコード化する遺伝子はクローン化され発現されている(特許文献1)。脂肪族、芳香族、および複素環式ニトリルの加水分解を触媒するニトリラーゼは、高温細菌Bacillus pallidus strain Dac521から単離されている(非特許文献3)。ロドコッカス・ロドキュラス NCIMB 40757またはNCIMB 40833からのニトリラーゼは、アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転換するのに使用されている(特許文献2)。様々な脂肪族α,ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩またはジカルボン酸ジアンモニウム塩のどちらかに転換できるニトリラーゼが、コマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)から単離されている(特許文献3;非特許文献4)。アシドボラックス・ファシリス(Acidovorax facilis) 72Wのニトリラーゼ活性による、脂肪族α,ω−ジニトリルの対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩への位置選択的加水分解についても報告されている(非特許文献5)。
【0003】
水溶液中で脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するのに、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの2つの酵素の組み合わせも使用できる。ここでは脂肪族ニトリルは、最初にニトリルヒドラターゼによってアミドに転換され、次にアミドはアミダーゼによって引き続き対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換される。ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、バチルス属(Bacillus)、Bacteridium、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、およびミクロコッカス属(Micrococcus)をはじめとする多種多様の細菌属が、多様な範囲のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有することが知られている。(非特許文献6)は、最近ニトリル分解微生物のニトリラーゼとニトリルヒドラターゼ/アミダーゼ酵素系の双方をレビューした。
【0004】
2−メチルグルタロニトリルは、生体触媒を使用してω−シアノカルボン酸アンモニウム塩(すなわち4−シアノペンタン酸のアンモニウム塩)に位置選択的に転換できる脂肪族α,ω−ジニトリルの一例である。生体触媒による4−シアノペンタン酸の調製については、(特許文献4)およびその分割特許(特許文献5)、(特許文献6)、(特許文献7)、(特許文献8)、(特許文献9)、および(特許文献10)で既に記載されている。これらの特許は、脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性、あるいはニトリルヒドラターゼ(EC 4.2.1.84)およびアミダーゼ(EC 3.5.1.4)活性の組み合わせを有する触媒を使用して、水溶液中で脂肪族α,ω−ジニトリルをω−シアノカルボン酸のアンモニウム塩に転換する方法に関する。脂肪族α,ω−ジニトリルがω−炭素原子で非対称に置換されている場合、ニトリラーゼは98%を超える位置選択性で、ω−ニトリル基の加水分解からもたらされるω−シアノカルボン酸アンモニウム塩を生じる。(特許文献4)は、アシドボラックス・ファシリス 72Wを酵素触媒として使用する前に10〜120分間の熱処理(35〜70℃)に曝す、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸に転換する方法を具体的に開示する。この熱処理は望ましくない非位置選択的ニトリルヒドラターゼ活性を破壊しながら、望ましい位置選択的脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性を選択するのに重要であった。次に4−シアノペンタン酸は、1,5−ジメチル−2−ピペリドンの商業的調製のための一段階化学法で、基質としての機能を果たすことができる。1,5−ジメチル−2−ピペリドンには、電子部品クリーニング、フォトレジスト除去、工業的脱脂および金属クリーニング、樹脂クリーンアップ、インク調合物、工業的接着剤をはじめとする工業用溶剤としての、ポリマーと化学薬品のための反応溶剤しての多くの用途がある。
【0005】
商業規模用途では、生体触媒である固定化微生物細胞を使用することは、固定化されない細胞の使用と比較して、多くの既知の経済上の利点を有する。利点のいくつかは、それらを繰り返し使用する能力、それらの分離の容易さ、および連続反応におけるそれらの使用である。ポリマーマトリックス内への細胞包含によって、生成物および基質の高い拡散を保ちながら、生細胞または代謝的不活性細胞の取り込みが可能になる。固定化のための典型的なマトリックスの例は、アルギン酸ナトリウム(非特許文献7)またはカラゲナン(非特許文献8)である。取り込み方法は比較的単純で、ゲル材料は無毒で低価格である。
【0006】
固定化細胞の「任意の」安定性は、細胞と、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンまたはヘキサメチレンジアミンなどの多官能性試薬とを共有結合的に架橋する架橋剤による、細胞ビーズの引き続く処理によってさらに増大できる。一例では、L−アスパラギン酸製造のためにκカラゲナン中に固定化されたE.coli細胞(非特許文献9)に関する安定性が研究された。架橋処理として使用された最適化濃度のヘキサメチレンジアミンおよびグルタルアルデヒドによって、固定化細胞の半減期は、未処理の固定化細胞の5倍以上に顕著に延長した。
【0007】
さらにBirnbaumら(Biotechnol.Lett.3:393〜400(1981))は、アルギン酸カルシウム固定化細胞の物理的安定性を増大する方法を開示している。1つの安定化方法では、ポリエチレンイミン処理(24時間)を使用し、グルタルアルデヒド架橋(1〜5分間)が続く。ビーズ安定性は、固定化細胞を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液内で10日間培養して検査された。固定化細胞からの細胞放出がわずかなことが観察されたことで、ビーズの完全性の改良が実証される。同時に全体的な触媒活性は、このプロトコルによって有害に影響された。Birnbaumは、この影響がおそらくグルタルアルデヒドの毒性によるものであると提案した。
【0008】
最後に、微生物細胞全体または微生物細胞材料を直接的に固定化するため、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドを添加する好ましい順序は、グルタルアルデヒドに対する固定化酵素活性の感受性に左右されると理解されている。(特許文献11)は、グルタルアルデヒド感受性酵素(チオール酵素、あるいはSH基が酵素分子の活性部位にある、またはその非常に近くにあるものなど)が、グルタルアルデヒドなどのチオール反応性作用物質によって不活性化されることを開示する。これらのタイプの酵素触媒では、発明は、起こり得る酵素活性損失を打ち消すために、微生物細胞材料を最初にポリエチレンイミンで処理して、グルタルアルデヒドを同時にまたは引き続いて添加することが必要である。対照的に(特許文献12)は、酵素がグルタルアルデヒド感受性でない微生物を固定化する場合、ポリエチレンイミンの前にグルタルアルデヒドを導入することが望ましいことを教示する。この場合、得られる固定化細胞は、グルタルアルデヒド添加前のポリエチレンイミン前処理で固定化した細胞よりも、容易に水性媒体から回収される。どちらの場合でも微生物細胞は、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドによる処理前に、ゲルまたはポリマーマトリックス内に取り込まれない。
【0009】
【特許文献1】
WO 00/23577明細書
【特許文献2】
米国特許第5,998,180号明細書
【特許文献3】
CA 2,103,616明細書
【特許文献4】
米国特許第5,814,508号明細書
【特許文献5】
米国特許第5,858,736号明細書
【特許文献6】
米国特許第5,908,954号明細書
【特許文献7】
米国特許第5,922,589号明細書
【特許文献8】
米国特許第5,936,114号明細書
【特許文献9】
米国特許第6,077,955号明細書
【特許文献10】
米国特許第6,066,490号明細書
【特許文献11】
米国特許第4,288,552号明細書
【特許文献12】
米国特許第4,355,105号明細書
【非特許文献1】
KobayashiらTetrahedron 46:5587〜5590(1990)
【非特許文献2】
J.Bacteriology,172:4807〜4815(1990)
【非特許文献3】
Almatawahら、Extremophiles3:283〜291(1999)
【非特許文献4】
S.Levy−Schilら、Gene 161:15−20(1995)
【非特許文献5】
Gavaganら、J.Org.Chem.,63:4792−4801(1998)
【非特許文献6】
Cowanら(Extremophiles 2:207〜216(1998))
【非特許文献7】
Bucke、Methods in Enzymology 135:175〜189(1987)
【非特許文献8】
Chibataら、Methods in Enzymology 135:189〜198(1987)
【非特許文献9】
Chibata,I.Immobilized Microbial Cells;Venkatsubramanian,K.,Ed.;ACS Symposium Series 106;American Chemical Society;Washington,DC,1979,pp187〜201
【非特許文献10】
Felix,Bioprocess.Technol.11:259〜278(1991)
【非特許文献11】
Felix,Anal.Biochem.120:211〜234(1982)
【非特許文献12】
Klein,J.およびVorlop,K.D.,Biotechnology FocusI;Finn,R.F.,Ed.;Oxford University Press:NewYork;1998,pp325〜336
【非特許文献13】
Smidsrodら、Trends Biotechnol.8,71〜78(1990)
【非特許文献14】
Gavaganら、Appl.Microbiol.Biotechnol.,52:654〜659(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって解決すべき問題は、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するための触媒として使用すると、高い比活性および長期の物理的完全性を有する、固定化細胞触媒を製造する経済的な方法の開発である。より具体的には、より高い収率とより高い濃度の4−シアノペンタン酸を生じ、使用が以前開示されているものよりも便利な酵素触媒を使用する方法によって、技術は進歩するであろう。
【課題を解決するための手段】
【0011】
出願人らの発明は、a)ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる触媒酵素をアルギン酸塩中に固定化する工程と、b)第1の安定剤、次に第2の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程a)の固定化酵素触媒に添加する工程と、c)工程b)の生成物を適切な水性反応混合物中でニトリルに接触させる工程と、d)工程c)で生成したカルボン酸を塩または酸の形態で単離する工程とを含む、カルボン酸を製造する方法であって、第2の安定剤が第1の安定剤以外であるならば、第1の安定剤および第2の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択される方法である。任意に工程c)およびd)を繰り返しても良い。発明の好ましい実施態様としては、工程c)のニトリルが2−メチルグルタロニトリルであるもの、工程c)の水性反応混合物が反応過程で20:1を超える(より好ましくは200:1を超え、最も好ましくは750:1を超える)NH4 +:Ca2+比を有するもの、工程d)で単離されるカルボン酸が4−シアノペンタン酸であるものが挙げられる。
【0012】
好ましい酵素触媒は、アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−15(ATCC 55747)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−17(ATCC55745)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)SS1001(ATCC PTA−1177)、またはエシェリキア・コリ SW91(ATCC PTA−1175)であり、酵素触媒は細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態である。酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)である場合、アルギン酸塩中で固定化する前に、熱処理によって酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を不活性化する必要はない。
【0013】
(微生物の寄託の簡単な説明)
出願人らはブダペスト条約の取り決めの元に、以下の微生物の寄託を行った。
【0014】
【表1】
【0015】
ここでの用法では、「ATCC」とは、10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110−1109,U.S.A.にあるAmerican Type Culture Collection International Depositoryを指す。「ATCC No.」とは、ATCCに寄託された培養株の受け入れ番号である。列挙した寄託株は、表示国際保管所に少なくとも30年保持され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の可用性は、政府の行為によって付与される特許権を失効させる、対象発明の実施免許を意味するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換する、改良された方法に関する。より詳細には本発明は、脂肪族ニトリラーゼ(EC 3.5.5.7)活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で2−メチルグルタロニトリルを4−シアノペンタン酸のアンモニウム塩に転換する。出願人らは、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒をアルギン酸カルシウム中に固定化し、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンと架橋した後に得られる触媒を使用して、架橋された固定化酵素触媒の物理的完全性の迅速な損失の帰結が予期される条件下において、少なくとも1.50Mの濃度で4−シアノペンタン酸アンモニウム塩を製造することが可能であることをここで開示する。PEI添加に先立つ固定化細胞のグルタルアルデヒド処理が、測定可能なニトリラーゼ活性の損失なしに実施できること、あるいはアンモニウム/カルシウムイオン比が20:1の比率を超えないことが推奨されている場合に、少なくとも750:1で反応させることが、触媒ビーズの物理的完全性に影響しないことは予想外であった。酵素触媒は物理的完全性の損失なしに、多数の連続リサイクル反応で再利用された。
【0017】
出願人らは(カラゲナンを使用して調製された対応する酵素触媒とは対照的に)、グルタルアルデヒド/ポリエチレンイミン−架橋アルギン酸塩−固定化酵素触媒のニトリラーゼ活性が、触媒ビーズ中の乾燥細胞重量の濃度増大と共に増大することをさらに開示する。アルギン酸塩−固定化酵素触媒の使用は、カラゲナン固定化酵素触媒と比較すると、触媒使用量を基準にした全体的な生成物収率を増大させて有利である。
【0018】
出願人らは、酵素触媒アシドボラックス・ファシリス 72Wを固定化する場合、細胞をアルギン酸塩内に固定化して、得られる酵素触媒を安定剤グルタルアルデヒドとポリエチレンイミンに架橋する際、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化するのに通常必要な熱処理が必要でないことをさらに開示する。特にニトリラーゼがグルタルアルデヒドによって不活性化できることは既知であり、固定化手順が測定可能なニトリラーゼ活性損失を生じることなく、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を選択的かつ完全に不活性化することは予想外であった。
【0019】
ここで開示される方法の改良は、既知の方法と比較して、以前得られたよりも高い濃度でより高い生成物収率(触媒重量あたりの生成物重量を基準にして)をもたらす。クレーム方法の生成物は、農業および製薬産業で高価値なポリマー、溶剤(例えば1,5−ジメチル−2−ピペリドン)、および化学物質の前駆物質として有用である。
【0020】
本願明細書では、特に断りのない限り以下の略語と定義が適用される。
「グルタルアルデヒド」は、GAと略する。
「ポリエチレンイミン」は、PEIと略する。
「2−メチルグルタロニトリル」は、2−MGNと略する。
「4−シアノペンタン酸」は、4−CPAと略する。
【0021】
「酵素触媒」とは、ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる触媒を指す。触媒は、微生物細胞全体または透過性処理微生物細胞(群)の形態であっても良い。
【0022】
「水性反応混合物」は、水、濃度が少なくとも2mMのカルシウム塩、任意に反応の初期pHを5〜10、好ましくは6〜8に保てる緩衝液を含有する水性混合物を指すために使用される。
【0023】
「水性生成物混合物」は、対応する工程段階からもたらされる生成物を含有する水性混合物を指すために使用される。
【0024】
2−メチルグルタロニトリル(2−MGN)を4−シアノペンタン酸(4−CPA)アンモニウム塩に転換する方法の顕著な改良をここで開示する。具体的には本発明の顕著な改良は、1)好ましくはアシドボラックス・ファシリス 72Wに由来するニトリラーゼ活性によって特徴付けられる酵素触媒をアルギン酸塩中に固定化する工程と、2)グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンを(好ましくはこのこの順で)固定化酵素触媒に、各安定剤の架橋を達成するのに適切な量で十分な時間をかけて順次に添加する工程と、3)適切な水性反応混合物中で2−MGNと架橋された固定化酵素触媒とを接触させる工程と、4)4−CPAを酸またはアンモニウム塩として単離する工程と、5)次に架橋された固定化酵素触媒を少なくとも1回リサイクルする工程と含む方法によってもたらされる。本発明の利点は、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するために、ニトリラーゼ活性によって特徴付けられるその他の酵素触媒(例えばロドコッカス・ロドキュラス、アルカリゲネス・ファカリス、Bacillus pallidus、コマモナス・テストステロニ、Nocardia sp.、Acinetobacter sp.、およびArthrobacter sp.)を使用する際にも実現化できる。
【0025】
(酵素触媒固定化)
酵素触媒を固定化するための方法は、2つの異なるポリマーマトリックス、ナトリウムアルギン酸塩、およびΚ−カラゲナンを使用して開発された。細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態の酵素触媒は、アルギン酸塩またはカラゲナン中に固定化でき、透過性処理の方法は当業者には周知であり、凍結融解、あるいは有機溶剤または洗剤による処理(非特許文献10);(非特許文献11)が挙げられるが、これに限定されるものではない。アルギン酸塩中の細胞固定化は、固定化が5℃程度の低い温度で実施できることから有利である。対照的にカラゲナン固定化は、典型的に45〜50℃の温度を必要とし、これはニトリラーゼの不活性化をもたらすことができる。
【0026】
グルタルアルデヒド(GA)およびリエチレンイミン(PEI)処理を固定化プロトコルに加えて、触媒リサイクルによる多数回の連続反応に適するように、ビーズの機械的安定性をさらに増大させた。アルギン酸塩ビーズ酵素触媒を架橋するために添加されるGAおよびPEIの量は、それぞれ触媒ビーズ中に存在する乾燥細胞重量あたり25重量%から、触媒ビーズ中に存在する乾燥細胞重量あたり2重量%の範囲であり、触媒ビーズに添加されるGAとPEIとの比は3:1〜1:3の範囲である。2つの架橋安定剤は、最初にGA次にPEI、あるいは最初にPEI次にGAのどちらかの順で固定化酵素触媒に添加される。2つの架橋安定剤の好ましい添加順序は、最初にGA次にPEIである。第2の安定剤の添加は、第1の安定剤を架橋させるのに十分な時間遅らされる。固定化酵素触媒のGA架橋時間は、5分〜2時間、好ましくは30分〜1時間の範囲である。固定化酵素触媒のPEI架橋時間は、30分〜24時間、好ましくは1時間〜12時間の範囲である。
【0027】
グルタルアルデヒドがアシドボラックス・ファシリス 72Wニトリラーゼ酵素を不活性化する(実施例1)ことが知られていたため、GA/PEIの組み合わせが特定のニトリラーゼ活性への損害なしに、固定化細胞触媒を成功裏に安定化させることは知られておらず予想外であった。(非特許文献6)では、ニトリラーゼ酵素が、活性化されたチオール残基によるニトリル炭素への求核攻撃によって作用することが開示されており、(特許文献11)は、チオール−酵素などのグルタルアルデヒド感受性酵素がグルタルアルデヒドによって不活性化されることを記載している。
【0028】
カルシウム架橋アルギン酸塩は、高濃度のその他のカチオン存在下で安定でないことが報告されている。具体的には、20:1または25:1のアンモニウム/カルシウムイオン比を上回ることは奨励されていない(非特許文献12);(非特許文献13)。Kleinらは、高比率のL−グルロン酸を有するアルギン酸塩に対しては、電解質(Na+、K+、NH4 +、Mg2+のモル濃度合計)とCa2+との比率が20:1より高くなってはならないと述べている。本出願では、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンとの架橋後、アルギン酸塩は(高比率のL−グルロン酸を含有する)酵素触媒をゲル化し、少なくとも195回の連続バッチ反応でリサイクルして高濃度の4−シアノペンタン酸アンモニウム塩を製造する際に、それらの物理的完全性を保つ。最小カルシウムイオン濃度2mMを含有するこれらの反応では、アンモニウムイオンとカルシウムイオンの比は、典型的に少なくとも750:1(実施例4参照)である。反応は、アンモニウムイオンとカルシウムイオンの比が200:1、750:1、および950:1で実施された。これらの結果は確かに予見できないものだった。
【0029】
商業的方法を実施する際、ここで触媒の酵素活性/重量として定義される比活性が高いことが望ましい。本出願では、アルギン酸塩ビーズ中の乾燥細胞重量の増大する濃度と共に、ニトリラーゼ比活性が増大したが、カラゲナンビーズ中では増大しなかった。カラゲナンビーズでは、乾燥細胞重量の50%の増大により、30℃での小さな活性増大(7%)、あるいは35℃でのわずかな比活性減少のどちらかがあった(実施例4参照)。
【0030】
(グルタルアルデヒド/ポリエチレンイミン架橋アルギン酸塩中のアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)固定化)
微生物アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)は、脂肪族ニトリルまたはジニトリルに曝された土壌サンプルから予め単離されている(特許文献4およびその分割特許特許文献5、特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、および特許文献10)。(特許文献4を本願明細書に援用する。)アシドボラックス・ファシリス 72Wを微生物の全細胞触媒として、非対称に置換されたα−alkyl−α,ω−ジニトリルの加水分解のために使用すると、所望のω−シアノカルボン酸に加えて、対応するジカルボン酸モノアミドおよびジカルボン酸が生じる。この全細胞触媒の望ましくない非位置選択的ニトリルヒドラターゼ活性は、望ましくないジカルボン酸モノアミドを生じて、それはアミダーゼによって対応するジカルボン酸にさらに転換された。アシドボラックス・ファシリス 72Wのニトリラーゼ活性によって特徴付けられるが、アシドボラックス・ファシリス 72Wのニトリルヒドラターゼ活性を示さないアシドボラックス・ファシリス 72−PF−15、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−17、エシェリキア・コリ SS1001、およびエシェリキア・コリ SW91などの酵素触媒は、望ましくないジカルボン酸モノアミドおよびジカルボン酸副産物を生じない。
【0031】
適切な緩衝液中でアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)懸濁液を35〜70℃に短時間加熱することで、望ましいニトリラーゼ活性に影響せずに、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性が不活性化されることが分かった。したがって極めて高い位置選択性で2−メチルグルタロニトリル(2−MGN)を4−シアノペンタン酸(4−CPA)アンモニウム塩に加水分解するための以前の方法では、アシドボラックス・ファシリス 72Wの懸濁液を35〜70℃で熱処理して望まれないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化し、望まれない副産物2−メチルグルタル酸の生成を除外することが必要であった(非特許文献14);特許文献4)。熱処理はニトリラーゼ活性の損失を生じることなく、固定化細胞触媒を調製するのに日常的に使用された。
【0032】
4−シアノペンタン酸商業的製造のための本発明は、アルギン酸塩中の非熱処理アシドボラックス・ファシリス 72W細胞を固定化することで望まれないニトリルヒドラターゼ活性のおよそ90%を除去するという、さらなる利点を提供する。引き続くアルギン酸塩固定化アシドボラックス・ファシリス 72W細胞のグルタルアルデヒド(GA)またはグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミン(GA/PEI)架橋は、触媒による望ましくない副産物(2−メチルグルタル酸)の生成率を、熱処理されて検出可能なニトリルヒドラターゼ活性を持たない細胞で観察された率にまで、さらに低下させる(実施例10参照)。(特許文献4)でこれまで必要であった熱処理工程がもはや必要なくなったので、出願人らの開示は意外であり予想外であった。アルギン酸塩中でのアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の固定化とそれに続くGAまたはGA/PEI架橋が、望ましいニトリラーゼ活性の測定可能な損失を同時に引き起こすことなく、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を選択的かつ完全に不活性化することは知られていなかった。ニトリラーゼがグルタルアルデヒドによって不活性化されることが知られていたので、結果は特に予想外であった。
【0033】
(2−メチルグルタロニトリルの加水分解:)
加水分解反応の温度を選択して、反応速度と酵素触媒活性の安定性の双方を最適化した。反応温度は、懸濁液の氷点のすぐ上(約0℃)から60℃の範囲でも良く、好ましい反応温度範囲は5℃〜35℃である。固定化酵素触媒懸濁液は、触媒を蒸留水中、または反応の初期pHを5.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.0に保つ緩衝液中に懸濁して調製しても良い。反応が進行すると、ジニトリルの対応するニトリル官能性からのカルボン酸アンモニウム塩形成のために、反応混合物のpHは変化するかもしれない。反応は、pH調節なしにジニトリルが完全に転換するまで実施でき、あるいは反応の経過に伴って適切な酸または塩基を添加して、所望のpHを保つことができる。塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムをはじめとするが、これに限定されるものではないカルシウム塩を少なくとも2mMの濃度で加水分解反応に添加して、架橋された固定化酵素触媒の物理的完全性を保つ。
【0034】
4−シアノペンタン酸はまた、(触媒の除去後)に濃HClによって反応混合物のpHを2.0〜2.5に調節し、得られる溶液を塩化ナトリウムで飽和して、4−シアノペンタン酸を適切な有機溶剤(酢酸エチル、エチルエーテル、またはジクロロメタンなど)で抽出して、生成物混合物から単離しても良い。次に有機抽出物を一緒にして適切な乾燥剤(例えば硫酸マグネシウム)と共に撹拌して濾過し、溶剤を(例えばロータリー蒸発によって)除去して、所望の生成物を高収率および高純度(典型的に純度98〜99%)で製造する。所望するならば、生成物を再結晶または蒸留によってさらに精製できる。代案としては、1,5−ジメチル−2−ピペリドンの調製と同様に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩を引き続く反応で直接的に使用しても良い(特許文献4およびその分割特許特許文献5、特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、および特許文献)。
【0035】
(実施例)
発明をさらに例証する制限を意図しない以下の実施例では、2−メチルグルタロニトリルの%回収率、および微生物の加水分解反応中に形成する加水分解生成物4−シアノペンタン酸および2−メチルグルタル酸の%収率は、(特に断りのない限り)反応混合物中に存在する2−メチルグルタロニトリルの初期量を基準とし、屈折率検出器およびSupelcosil LC−18−DBカラム(15cm×4.6mM径)、および10mMの酢酸、10mMの酢酸ナトリウム、および7.5%(v/v)のメタノール/水混液から構成される溶出剤を使用して、HPLCによって求められる。
【0036】
略語の意味は次の通り。「sec」は秒を意味し、「min」は分を意味し、「h」は時間を意味し、「d」は日数を意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「mm」はミリメートルを意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモル濃度を意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「μmole」はマイクロモルを意味し、「g」はグラムを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、「U」は単位を意味し、「dcw」は乾燥細胞重量を意味する。
【実施例1】
【0037】
(グルタルアルデヒドによるアシドボラックス・ファシリス 72Wニトリラーゼ酵素の不活性化)
実施例1は、グルタルアルデヒドがニトリラーゼ活性に有害であることを例証する。
【0038】
アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)のニトリラーゼを細胞抽出物から単離し、Q−Sepharoseイオン交換媒体に通過させ、続いてHiload 16/60Superdex 200カラム上でゲル濾過して、>90%純度に精製した。100mMリン酸緩衝液(pH7.2)中の5mMベンゾニトリル溶液の245nmにおける吸収増大によって示される、ベンゾニトリルの安息香酸への転換率を測定することで、ニトリラーゼ活性を精製中にモニターした。精製した酵素のニトリラーゼ活性は、25.7U/mgタンパクであった。グルタルアルデヒド(0.10M)の存在下で酵素アッセイを実施すると、ニトリラーゼ比活性は6.65U/mgに減少し、74%の酵素活性損失であった。
【実施例2】
【0039】
(アルギン酸カルシウム中のアシドボラックス・ファシリス 72W細胞固定化)
実施例2は、非架橋アルギン酸カルシウムおよびGA/PEI架橋アルギン酸カルシウム、双方の中でのアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)細胞の固定化を例証する。
【0040】
22.9gの蒸留脱イオン水を含有する磁気撹拌棒を装着した100mLメディアボトルに、50℃で1.10gのFMC BioPolymer Protanal(登録商標)LF 10/60アルギン酸塩を迅速に撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながら、アルギン酸塩が完全に溶解するまで75〜80℃に加熱し、得られた溶液を水浴中で25℃に冷却した。0.15M酢酸ナトリウム緩衝液(総容量16mL、pH7.0)中のアシドボラックス・ファシリス 72W懸濁液(50%湿潤細胞重量、11.5%乾燥細胞重量)を50℃に15分間加熱して次に25℃に冷却し、25℃で撹拌しながらアルギン酸塩溶液に添加した。細胞/アルギン酸塩混合物をシリンジで滴下して、213mLの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)に25℃で撹拌しながら添加した。2時間の撹拌後、得られたビーズから緩衝液をデカントし、84mLの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)中に25℃で再懸濁した。撹拌しながら0.88gの水中の25重量%グルタルアルデヒド(GA)を添加し、ビーズを25℃で1.0時間混合した。次に懸濁液に、3.5gの水中の12.5重量%のポリエチレンイミン(PEI)(BASF Lupasol(登録商標)PR971L、平均分子量約750,000)を添加して、ビーズを25℃でさらに1時間混合した。次に架橋したビーズを25℃で84mLの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)で2回洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【0041】
0.20M酢酸カルシウム緩衝液中のビーズ懸濁液にGAとPEIを添加しなかったこと以外は、上述の方法で非架橋ビーズを調製した。
【実施例3】
【0042】
(4−シアノペンタン酸製造における非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズ触媒の比較)
実施例3は、連続バッチ反応においてGA/PEI架橋触媒ビーズが、非架橋ビーズよりも高い収率の4−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【0043】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例2で記載されたように調製された16.5gの非架橋またはGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズのどちらかを入れた。各反応容器に68.25mLの蒸留脱イオン水、1.0mLの0.50M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度5.0mM)、および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを添加し、混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mLの水と混合し、次に0.360mLの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られた各容器内の混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズによる4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ193mM/時間および198mM/時間であった。2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩および2−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でも典型的にそれぞれ98.5%および1.5%の収率であった。
【0044】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述の条件下で、これらのビーズをさらに11回の連続バッチ反応で再利用した。表1に示すように、非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズによる、反応12での4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ64mM/時間および118mM/時間であった。11回のリサイクル反応の各セット完了時に、4−シアノペンタン酸最終濃度は少なくとも1,550mMであった。
【0045】
【表2】
【実施例4】
【0046】
(4−シアノペンタン酸製造のためのGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズ触媒に対するカルシウムイオン濃度の効果)
実施例4は、高濃度アンモニウムイオン存在下でGA/PEI架橋アルギン酸塩ビーズ触媒が安定化できることを例証する。この発見は先行技術(非特許文献12)に反している。
【0047】
各3個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例2で記載されたように調製された16.5gのGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズを入れた。各反応容器に68.25mlの蒸留脱イオン水および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを入れた。これらの3つの反応混合物の1つに、3つの反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度が、それぞれ5.0mM、2.0mM、または0mMになるように、a)1.0mlの0.50M酢酸カルシウム(pH7.0)、b)0.20M酢酸カルシウム(pH7.0)、またはc)蒸留水を添加した。混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100m)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られた混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。5mM、2mM、または0mMのカルシウムイオンを含有する反応中の4−シアノペンタン酸生成速度は、それぞれ236mM/時間、233mM/時間、および232mM/時間であった。
【0048】
2−メチルグルタロニトリルの完全な転換後、生成物混合物を触媒ビーズからデカントした。触媒重量を測定し、上述したような条件下で、触媒をさらに10回の連続バッチ反応で再利用した。リサイクル反応の各セットにおける2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸の最終濃度は、前の反応から残留する反応ヒール(触媒と生成物の混合物)のために、少なくとも1,550mMであった。反応の各セットにおける回収された触媒重量を表2に列挙した。
【0049】
【表3】
【0050】
3つの反応混合物中の酢酸カルシウム濃度が、それぞれ2.0mM、1.0mM、および0.5mMであったこと以外は、上述の3回の反応のセットを繰り返した。触媒リサイクルによるさらに10回の反応後、0.5mMの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは粉々になり、反応混合物は顕著な量の粒子状物質を含有した。1.0mMの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは、触媒リサイクルによる12回目の反応で破損し始め、18回目の反応後に触媒は粉々になり、反応混合物は顕著な量の粒子状物質を含有した。2.0mMの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは、触媒リサイクルによる60回に及ぶ連続反応後も粉々にならず、反応混合物中に粒子状物質の顕著な生成はなかった。
【実施例5】
【0051】
(カラゲナン中のE.coli形質転換体SS1001細胞固定化)
実施例5は、カラゲナン中のE.coli形質転換体SS1001(ATCC PTA−1177)細胞の固定化を例証する。
【0052】
250mLメディアボトル(磁気撹拌棒を装着し50℃の64.12gの蒸留脱イオン水を含有する)中に、3.38gのFMC BioPolymer ISAGEL(登録商標)RG300カラゲナンを迅速に撹拌しなからゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながら、カラゲナンが完全に溶解するまで75〜80℃に加熱し、得られた溶液を温度調節された水浴中で55〜56℃(ゲル化温度およそ52℃)に冷却した。0.35Mのリン酸水素ナトリウム緩衝液(総容量45mL、pH7.3)中のE.coli形質転換体SS1001(ATCC PTA−1177)の懸濁液(12.5%乾燥細胞重量)を50℃に12分間加熱し、次に55〜56℃で撹拌しながらカラゲナン溶液に添加した。細胞/カラゲナン混合物を50℃でオーバーヘッド撹拌機を使用して撹拌しながら、直ちに450mlの大豆油にゆっくりと添加した。油中に所望のサイズの細胞/カラゲナン液滴が生じた後に撹拌速度を調節し、油の温度を35℃に低下させて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカントし、0.10Mの重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)で洗浄した。ビーズの20gの部分を48.8mlの0.10M重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)に再懸濁し、0.25gの水中の25重量%グルタルアルデヒドを添加し、ビーズを25℃で1.0時間混合した。次に混合物に1.0gの水中の12.5重量%ポリエチレンイミン(BASF Lupasol(登録商標)PR971L、平均分子量約750,000)を添加し、ビーズを25℃でさらに1時間混合した。次に架橋したビーズを25℃で50mlの0.30M炭酸水素アンモニウム(pH7.3)で洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【実施例6】
【0053】
(4−シアノペンタン酸製造における非架橋およびGA/PEI架橋E.coli SS1001/カラゲナンビーズ触媒の比較)
実施例6は、連続バッチ反応においてGA/PEI架橋カラゲナンビーズ触媒が、非架橋ビーズよりも高い速度で4−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【0054】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例6で記載されたように調製された12.375gの非架橋またはGA/PEI架橋E.coli SS1001(ATCC PTA−1177)/カラゲナンビーズのどちらかを入れた。各反応容器に、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含有する51.9mlの蒸留脱イオン水、および10.71mL(10.17g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを添加し、各混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られる混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCで2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズによる4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ254mM/時間および310mM/時間であった。2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩および2−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でもそれぞれ98.8%および1.2%の収率であった。
【0055】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述したように、触媒ビーズをさらに11回の連続バッチ反応で再利用した。表3は、非架橋およびGA/PEI架橋E.coli SS1001(ATCC PTA−1177)/カラゲナンビーズによる、反応4での4−シアノペンタン酸の生成速度がそれぞれ120mM/時間および290mM/時間であったことを示す。
【0056】
【表4】
【実施例7】
【0057】
(カラゲナン中のアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の固定化)
実施例7は、カラゲナン中のアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)細胞の固定化を例証する。
【0058】
250mLメディアボトル(磁気撹拌棒を装着し50℃の64.12gの蒸留脱イオン水を含有する)中に、3.38gのFMC BioPolymer ISAGEL(登録商標)RG300カラゲナンを迅速に撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながらカラゲナンが完全に溶解するまで75〜80℃に加熱し、得られた溶液を温度調節された水浴中で55〜56℃に冷却した(ゲル化温度およそ52℃)。0.35Mリン酸水素ナトリウム緩衝液(総容量45mL、pH7.3)中のアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の懸濁液(12.5%乾燥細胞重量)を50℃に60分間加熱して、次にカラゲナン溶液に55〜56℃で撹拌しながら添加した。細胞/カラゲナン混合物を50℃でオーバーヘッド撹拌機を使用して撹拌しながら、直ちに450mlの大豆油にゆっくりと添加した。油中に所望のサイズの細胞/カラゲナン液滴が生じた後に撹拌速度を調節し、油の温度を35℃に低下させて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカントし、0.10M重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)で洗浄した。ビーズの20gの部分を48.8mlの0.10M重炭酸カリウム緩衝液(pH7.3)に再懸濁し、0.25gの水中の25重量%グルタルアルデヒドを添加し、ビーズを25℃で1.0時間混合した。次に混合物に1.0gの水中の12.5重量%ポリエチレンイミン(BASF Lupasol(登録商標)PR971L、平均分子量約750,000)を添加し、ビーズを25℃でさらに1時間混合した。次に架橋したビーズを25℃で50mlの0.30M炭酸水素アンモニウム(pH7.3)で洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【0059】
グルタルアルデヒド無添加の非架橋ビーズも0.30M炭酸水素アンモニウム(pH7.3)で25℃で洗浄し、この同一緩衝液中に5℃で保存した。
【実施例8】
【0060】
(4−シアノペンタン酸製造における非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/カラゲナンビーズ触媒の比較)
実施例8は、連続バッチ反応においてGA/PEI架橋カラゲナンビーズ触媒が、非架橋ビーズよりも高い速度で4−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【0061】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で30℃に温度調節された)の中に、実施例7で記載されたように調製された16.5gの非架橋またはGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/カラゲナンビーズのどちらかを入れた。各反応容器に、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含有する72.1mlの蒸留脱イオン水、および11.40mL(10.83g、1.0M)の2−メチルグルタロニトリルを添加し、混合物を30℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られる混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズによる4−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ266mM/時間および235mM/時間であった。2−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、4−シアノペンタン酸アンモニウム塩および2−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でもそれぞれ98.5%および1.5%収率であった。
【0062】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述したように、触媒ビーズをさらに9回の連続バッチ反応で再利用した。表4は非架橋およびGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W/カラゲナンビーズによる、反応9での4−シアノペンタン酸の生成速度が、それぞれ144mM/時間および200mM/時間であったことを示す。
【0063】
【表5】
【実施例9】
【0064】
(4−シアノペンタン酸製造のための触媒としてのGA/PEI架橋アルギン酸塩またはカラゲナンビーズ中に固定化されたアシドボラックス・ファシリス 72W細胞の比較)
実施例9は、乾燥細胞重量の増大する濃度と共に、アルギン酸塩ビーズ触媒ではニトリラーゼの比活性が増大するが、カラゲナンビーズ触媒では増大しないことを例証する。
【0065】
別個の125mLジャケット付き反応容器に、a)16.5gの固定化アシドボラックス・ファシリス 72W触媒ビーズおよび68.25gの蒸留脱イオン水、あるいはb)22gの固定化アシドボラックス・ファシリス 72W触媒ビーズおよび62.75gの蒸留脱イオン水のどちらかを入れた。触媒をGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/アルギン酸塩ビーズ(実施例2で記載された手順に従って調製された)またはGA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W細胞/カラゲナンビーズ(実施例5で記載された手順に従って調製された)のどちらかから選択した。触媒ビーズは、5%乾燥細胞重量(dcw)または7.5%のdcwのアシドボラックス・ファシリス 72W細胞のどちらかで調製された。7.5%dcwの触媒ビーズでは、完全に架橋された触媒を生じるために、ビーズを架橋するのに使用されるGAおよびPEIの量は2倍になった。各反応容器に1.0mlの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0)および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチグルタロニトリルを直ちに添加して、再循環温度浴で温度を保ちながら、各反応混合物を30℃または35℃のどちらかで撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られる混合物を濾過し(0.22μm)、濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。表5は、同一反応条件下で2つの触媒で実施された反応中での4−シアノペンタン酸の製造について、反応速度および触媒比活性を列挙する。
【0066】
【表6】
【実施例10】
【0067】
(4−シアノペンタン酸(アンモニウム塩)の調製)
実施例10は、アルギン酸塩中にアシドボラックス・ファシリス 72Wを固定化することで、望まれないニトリルヒドラターゼ活性のおよそ90%が除去されることを例証する。さらにGAまたはGA/PEIは、追加的な望まれないニトリルヒドラターゼ活性を除去する。4−シアノペンタン酸を調製するための先行技術は、望まれないニトリルヒドラターゼ活性を除去するための細胞の熱処理工程を必要とする(特許文献4およびその分割特許、上述)。
【0068】
アルギン酸塩溶液との混合前に、アシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)細胞懸濁液を50℃で15分熱処理しなかったこと以外は、実施例2の手順を繰り返して、3つの別個のアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズ触媒を製造した。細胞のニトリラーゼおよびニトリルヒドラターゼ/アミダーゼ活性は、固定化前に0.3Mの2−メチルグルタロニトリルを使用して25℃でアッセイし、2−メチルグルタル酸(2−MGA、細胞のニトリルヒドラターゼ/アミダーゼ活性の生成物)の生成速度は、4−シアノペンタン酸(4−CPA)生成速度の34%であった。実施例2で記載されたようにして調製され加熱された細胞懸濁液では、2−メチルグルタル酸の生成速度は、典型的に4−シアノペンタン酸生成速度の1.5%であった。調製された3つの触媒セットで、1)アシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズの1つめのセットはGAまたはPEIのどちらによっても架橋せず、2)2つめはGAのみで架橋し、3)3つめはのGAとPEIの双方で架橋した。
【0069】
別個の125mLジャケット付き反応容器(再循環温度浴中で35℃に温度調節された)の中に、16.5gの上述したように調製された3つの触媒の1つを入れた。次に各反応容器に68.25mlの蒸留脱イオン水、1.0mlの0.20M酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度2.0mM)、および14.25mL(13.54g、1.25M)の2−メチルグルタロニトリルを添加して、混合物を35℃で撹拌した。反応混合物のサンプル(0.100mL)を0.400mlの水と混合し、次に0.360mlの希釈サンプルを0.040mlの水中の0.75MのN−メチルプロピオンアミド(HPLC外部標準)、および0.020mlの6.0NのHClと混合した。得られた混合物を濾過して(0.22μm)、各濾液をHPLCによって2−メチルグルラトニトリル、4−シアノペンタン酸、および2−メチルグルタル酸について分析した。GAまたはPEIのどちらによっても架橋されないアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズによる2−メチルグルタル酸の生成速度は、4−シアノペンタン酸生成速度の3.6%であり、34%の低下であった(表6)。GAのみによって架橋されたアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズは、4−シアノペンタン酸生成速度の1.7%である2−メチルグルタル酸生成速度を有し、GAおよびPEI双方によって架橋されたアシドボラックス・ファシリス 72W/アルギン酸塩ビーズは、4−シアノペンタン酸生成速度の1.5%である2−メチルグルタル酸生成速度を有した。
【0070】
【表7】
【実施例11】
【0071】
(4−シアノペンタン酸製造のためのGA/PEI架橋E.Coli SS1001/アルギン酸塩ビーズ触媒)
反応混合物中に2mMの酢酸カルシウムを使用して、4−シアノペンタン酸製造のために、GA/PEI架橋エシェリキア・コリ(E.coli) 72W SS1001/アルギン酸塩を使用して、GA/PEI架橋アシドボラックス・ファシリス 72W SS1001ビーズ触媒を使用した実施例3の反応を繰り返した。
【0072】
195回の連続触媒リサイクル後、反応速度は初期反応速度の67%で、触媒ビーズの物理的完全性の顕著な損失はなかった。
Claims (9)
- a)ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる酵素触媒をアルギン酸塩中に固定化する工程と、
b)第1の安定剤、次に第2の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程a)の固定化酵素触媒に添加する工程と、
c)工程b)の生成物を適切な水性反応混合物中でニトリルに接触させる工程と、
d)工程c)で生成したカルボン酸を塩または酸の形態で単離する工程と
を含むカルボン酸を製造する方法であって、
第2の安定剤が第1の安定剤以外であるならば、第1の安定剤および第2の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択されることを特徴とする方法。 - 工程c)のニトリルが2−メチルグルタロニトリルであり、工程c)の水性反応混合物が反応過程中、20:1を超えるNH4 +:Ca2+比を有し、工程d)で単離されるカルボン酸が4−シアノペンタン酸であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−15(ATCC 55747)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−17(ATCC 55745)、エシェリキア・コリ SS1001(ATCC PTA−1177)、またはエシェリキア・コリ SW91(ATCC PTA−1175)であり、細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)であり、酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性が、アルギン酸塩中での固定化前に熱によって不活性化されないことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- アルギン酸塩がアルギン酸カルシウムであることを特徴とする請求項1および2に記載の方法。
- 反応過程において、工程c)の水性反応混合物が少なくとも200:1のNH4 +:Ca2+比、および少なくとも2mMのカルシウムイオン濃度を有することを特徴とする請求項1および2に記載の方法。
- (a)酵素触媒をアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−15(ATCC 55747)、アシドボラックス・ファシリス 72−PF−17(ATCC 55745)、エシェリキア・コリ SS1001(ATCC PTA−1177)、およびエシェリキア・コリ SW91(ATCC PTA−1175)からなる群より選択される細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態で、アルギン酸カルシウム中に固定化する工程と、
(b)第1の安定剤、次に第2の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程a)の固定化酵素触媒に添加する工程と、
(c)工程b)の生成物を反応過程中、20:1を超えるNH4 +:Ca2+比を有する適切な水性反応混合物中で2−メチルグルタロニトリルに接触させる工程と、
(d)工程c)で生成した4−シアノペンタン酸を塩または酸の形態で単離する工程と
を含む、4−シアノペンタン酸を製造する方法であって、
第2の安定剤が第1の安定剤以外であるならば、第1の安定剤および第2の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択されることを特徴とする方法。 - 前記酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス 72W(ATCC 55746)であり、前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性が、アルギン酸塩中での固定化前に熱によって不活性化されていないことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 工程(c)および(d)を反復する工程をさらに含むことを特徴とする請求項1または8に記載の方法。
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