JP4709186B2 - 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明で使用する微生物は、反応温度10℃で乾燥菌体1mg当たり50U以上のニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物であればいずれでも良い。例えば、バチルス(Bacillus)属、バクテリジューム(Bacteridium)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属〔特公昭62-21519号〕、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属〔特公昭56-17918号〕、シュードモナス(Pseudomonas)属〔特公昭59-37951号〕、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属〔特公平4-4873号〕、ロドコッカス(Rhodococcus)属〔特公平4-4873号、特公平6-55148号、特公平7-40948号〕、アクロモバクター(Achromobacter)属〔特開平6-225780〕、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属〔特開平9-275978号〕に属する微生物が好ましい。さらには、ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌がより好ましい。
(1)菌の培養
i) 前培養条件:
(培地組成)
フルクトース 2%、ポリペプトン 5%(日本製薬株式会社)、酵母エキス 0.3%(オリエンタル酵母工業株式会社製)、KH2PO4 0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4 7H2O 0.1%、pH 7
500ml容三角フラスコに培地を100ml分注して綿栓をし、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。Rhodococcus rhodochrous J1(FERM BP-1478)を接種して30℃で48時間振とう培養した。
(培地組成)
初期培地: 酵母エキス 0.2%、KH2PO4 0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4・7H2O 0.1%、CoCl2・6H2O 0.002%、硫安 0.025%、フルクトース 2%、尿素 2%、エタノール 0.4%、プルロニックL61 0.1%(旭電化工業株式会社)、pH7
後添加培地: フルクトース 20%、エタノール 5%、硫安 6%、pH6.5
3リッター容ミニジャーファーメンターに初期培地2リッター分注し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。但し、フルクトース、エタノールおよび尿素は、別途、無菌的に濾過して(アドバンテック東洋株式会社製0.45ミクロンの濾紙を使用)培地に加えた。
槽内圧力0.098MPa、攪拌数600rpm、通気量1vvm、pH7、温度30℃で培養を行い、酵素活性が最も高くなった時点で培養を終了した。その後50mMのリン酸バッファー(pH7.7)にて洗浄して、乾燥菌体重量15%の菌体懸濁液を得た。
直径30mmの試験管に50mMリン酸バッファー(pH7.7)4.98mlに20μLの菌体懸濁液を添加混合し、10℃の水槽中にて5分間振盪させた。これに予め10℃にしておいた5.0%のアクリロニトリルを含む50mMリン酸バッファー(pH7.7)5mlを加えて、10分間反応させ、菌体を濾別してから、ガスクロマトグラフィー(GC−14B 島津製作所)で生成したアクリルアミドを定量することにより行った。分析条件はパラボックスPS(ウォーターズ社製カラム充填剤)を充填した1mガラスカラムを用い、カラム温度230℃、検出器は250℃のFIDで実施した。その結果、アクリルアミド1.2%生成していた。1Uが、反応温度10℃、反応時間1分間に1マイクロモルのアクリロニトリルをアクリルアミドへ変換させる量と定義した場合、本菌体のアクリロニトリルからアクリルアミドへの変換活性は、乾燥菌体1mg当たり10℃で56Uであった。
1Lのジャケット付きセパラブルフラスコに、50mM(pH7.7)のトリス(2−アミノ−2−ヒドロキシメチルー1,3―プロパンジオール)塩酸バッファーを664g入れ、これに先に得た菌体懸濁液を乾燥菌体重量が90mgとなるように添加した。これを、180rpm撹拌下18℃で、アクリロニトリル濃度が常に2%となるように連続的にアクリロニトリルを添加した。
(1)菌体の包括固定化
実施例1で得られた、アクリロニトリルからアクリルアミド変換活性56Uの菌体懸濁液を、充分に溶解させた3%アルギン酸ナトリウム(関東化学製)水溶液に等量加え、充分に混和した。この混合液を、内径2mmのシリコンチューブから1M塩化カルシウム水溶液に滴下し、粒子径約3mmの固定化菌体粒子を得た。この固定化菌体粒子を、50mMのトリス塩酸バッファー(pH7.7に調整)にて洗浄し、固定化菌体を得た。
1Lのジャケット付きセパラブルフラスコに、50mM(pH7.7)のトリス塩酸バッファーを664g入れ、これに先に得た固定化菌体を乾燥菌体重量90mgとなる量添加した。これを、180rpm撹拌下18℃で、アクリロニトリル濃度が常に2%となるように連続的にアクリロニトリルを添加した。
(1)菌の培養
特開平2−177883号の実施例に記載された方法を用いて、Pseudomonas chlororaphis B23(FERM BP-187)菌を培養した。この菌体のアクリロニトリルからアクリルアミドへの変換活性を実施例1と同様にpH7.7にて測定したところ乾燥菌体1mg当たり10℃で90Uであった。
内容積が1Lのジャケット付きセパラブルフラスコに、50mM(pH7.7)のリン酸バッファーを850mL、菌体を乾燥菌体重量として0.4g添加し、3℃撹拌条件下でアクリロニトリルが常に2%となるように連続的に添加して反応を実施した。
3時間後、アクリルアミド濃度が目的の20%に達していた。
(1)菌体の包括固定化
アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミドおよび2ージメチルアミノプロピルメタクリルアミドが、それぞれ30,1,4%となるようにモノマー混合水溶液を調製した。
実施例2記載の装置方法にてアクリロニトリルからアクリルアミドへの反応を実施した。
8時間後でも、目的のアクリルアミド濃度20%に達してしなかった。
(1)菌の培養と触媒の調製
実施例1と同様にRhodococcus rhodochrous J1(FERM BP-1478)菌を培養し、実施例1で示した活性測定法に基づき測定した菌体のアクリロニトリルからアクリルアミドへの変換活性が、乾燥菌体1mg当たり10℃で20Uとなった時点で培養を終了し、その後50mMのリン酸バッファー(pH7.7)にて洗浄して、乾燥菌体重量15%の菌体懸濁液を得た。
まず、比較例2の方法にしたがい、アクリルアミド系ポリマー包括固定化菌体懸濁液を調製した。
Claims (1)
- 反応温度10℃で乾燥菌体1mg当たり50U以上のニトリルヒドラターゼ活性を有する受託番号FERM BP-1478で特定されるロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J1菌を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、前記微生物菌体を包括固定化しないで水性媒体中でニトリル化合物と接触させることにより、45%以上のアミド化合物を蓄積させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
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