JPH0543351B2 - - Google Patents
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- JPH0543351B2 JPH0543351B2 JP61101043A JP10104386A JPH0543351B2 JP H0543351 B2 JPH0543351 B2 JP H0543351B2 JP 61101043 A JP61101043 A JP 61101043A JP 10104386 A JP10104386 A JP 10104386A JP H0543351 B2 JPH0543351 B2 JP H0543351B2
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- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
Description
発明の背景
本発明は、シユードモナス(Pseudomonas)
属の微生物の産生するニトリルヒドラターゼに基
づくニトリル水和活性の経済的な低下を防止し、
この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酸素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和し
て対応するアミド類を生成せしめる酵素として、
本発明者の中の山田らにより見出されており
〔Agric.Biol.Chem.46、1165〜1174(1982)参照〕、
その具体的利用例としてニトリルヒドラターゼを
産生するシユードモナス属の微生物を用いC2-4の
ニトリルから対応するアミドを生成させる方法が
提案されている〔特公昭59−37951号公報および
Agric.Biol.Chem.46、1183〜1189(1982)参照〕。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において上記ニトリルヒドラターゼのニトリル水
和活性は不安定で、経時的に低下することが判明
した。この低下は、固定化の有無を問わずニトリ
ルヒドラターゼが菌体内にある状態および菌体か
ら分離された状態いずれの場合においても起こる
が、後者の場合の方が大きく、著しい場合には短
期間で全く使用不可能となる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリルヒド
ラターゼのニトリル水和活性を効率的に利用する
ことを目的として、鋭意検討した結果、特定の物
質、すなわち、ニトリル類、アミド類および有機
酸またはその塩類等の使用が該目的に極めて有効
であることを見出し、この知見に基づいてなされ
たものである。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るシユードモナス(Pseudomonas)属の微生物
の培養液から分離、所得した微生物菌体、該菌体
から分離、抽出した酵素ニトリルヒドラターゼま
たはこれらの固定化物を懸濁液ないしは溶液の状
態で保存するに際し、安定化剤としてニトリル
類、アミド類、および有機酸またはその塩類の中
から選ばれた少なくとも1種の化合物を添加する
こと、を特徴とするニトリル水和活性の保持方
法、を要旨とするものである。 発明の具体的な説明 微生物: 本発明における微生物は、ニトリルヒドラタ
ーゼを産生し、ニトリル特にアクリロニトリル
を水和して、対応するアミド特にアクリルアミ
ドを生成することができるシユードモナス属の
微生物である。具体的には、例えば、前記特公
昭59−37951号公報に記載のシユードモナス・
クロロラフイス B 23(Pseudomonas
chlororaphis B 23)〔微工研条寄第187号〕
およびシユードモナスsp.PS 1(Pseudomonas
sp.SP 1)〔微工研条寄第188号〕、その他シユ
ードモナス・オバリス(Pseudomonas
ovalis)〔IAM 1002〕、シユードモナス・フル
オレツセンス(Pseudomonas fluorescens)
〔IFO 3081およびIFO 3925〕およびシユード
モナス・レプテイリボーラ(Pseudomonas
reptilivora)〔IFO 3461〕などを挙げることが
できる。これらの微生物は、それぞれ工業技術
院微生物工業研究所(微工研)、東京大学応用
微生物研究所(IAM)および財団法人発酵研
究所(IFO)にそれぞれ上記番号で寄託されて
いる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコー
ス、シユークロース、デキストリン、グリセリ
ン等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒
素源、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペ
プトン等の窒素源、およびプロピオニトリル、
イソブチロニトリル、プロピオンアミド、イソ
ブチルアミド、メタクリルアミド等の酸素誘導
物質その他を適宜含有する倍地に、それぞれの
菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは6〜9程度、好ましくは7〜8程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜
30℃程度とし、培養時間は1〜3日程度で充分
である。培養により得た菌体は遠心分離等によ
り集菌することができる。 ニトリルヒドラターゼ: 本発明におけるニトリルヒドラターゼは前記
微生物が産生する酵素であり、その分離、抽出
は次のようにして行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体
を所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁
し、超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチ
プレス等により菌体を破砕し、遠心分離等によ
り未破砕菌体および細胞壁、膜を除去し、可溶
性画分(菌体抽出液)を得る。さらに、その菌
体抽出液は常法に従い、適宜、硫安分画、
DEAE−Sephacel Phenyl−sepharose、
sephadex等のカラムを用いたり、さらには結
晶化等により精製することにより、部分精製酵
素液または精製酵素(液)を得ることができ
る。 本発明では、これら精製段階の如何によら
ず、いずれの酵素も対象となる。 固定化菌体・固定化酵素: 本発明における固定化菌体・固定化酵素は、
上記微生物菌体およびニトリルヒドラターゼ
を、常法に従い、それぞれ活性炭等へ吸着させ
る吸着法、イオン交換樹脂等に結合させるイオ
ン結合法ならびにガラスビーズ等に共有結合さ
せる共有結合法およびアクリルアミド、カラギ
ーナン、アルギン酸等で包括する包括法等によ
り得ることができる。 安定化剤: 本発明において使用する安定化剤は、ニトリ
ル類、アミド類および有機酸またはその塩類の
中から選ばれた化合物であり、これらはそれぞ
れ単独にまたは混合して使用することができ
る。 具体的には、例えば次の化合物を挙げること
ができる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソ
ブチロニトリルのような脂肪族ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニ
トリル、β−アミノプロピオニトリルのよう
なアミノニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのよう
なヒドロキシニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルの
ような不飽和ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシ
ポニトリルのようなジニトリル類と対応する
ジアミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモ
ノシアノアミドおよびモノシアノ酸またはそ
の塩類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリル
のような芳香族ニトリル類と対応するアミド
および酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリル
のような複素環式ニトリル類と対応するアミ
ドおよび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピ
オニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有
する酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持: 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、
前記した化合物を、同じく前記した微生物菌
体、ニトリルヒドラターゼおよびこれらの固定
化物を各種バツフアー溶液、生理食塩水などに
分散ないしは溶解させた懸濁液ないし溶液に添
加することにより達成することができる。安定
化剤の添加量は通常0.01〜50g/の範囲であ
るが、長期保存、コスト等を考慮すると0.1〜
10g/添加することが望ましい。 懸濁液あるいは溶液のPHは5〜8、好ましく
は5.5〜7の範囲で、リン酸バツフアー、トリ
スバツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用
いられる。また、場合によつては、塩酸、硫酸
等の酸、カセイソーダ、カセイカリ等のアルカ
リを添加し、PHをコントロールすることも有効
である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、
低温、特に0℃付近で保存することが望まし
い。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長期間安
定に保持することができるが、本発明の安定化剤
の添加は、特に、該活性の経時的低下が大きい菌
体から分離した酵素に対して有効である。その効
果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存安定
性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の保持
においても認められる。従つて、安定化剤は各精
製工程において使用する酵素液またはバツフアー
溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液または菌体懸濁液0.1mlを、アクリロニトリル
2.5重量%含むM/20リン酸バツフアー(PH7.7)
9.9mlに加えて、10℃、10分間反応させ、この時
生成したアクリルアミドをガスクロマトグラフイ
ーにより定量することにより測定した。また、酵
素液または菌体懸濁液について1分間に1μモル
のアクリルアミドを生成する能力を1単位(U)とし
て表示した。 実施例1〜21および比較例1 シユークロース10g/、KH2PO4 1g/、
K2HSO4 1g/、MgSO4・7H2O 1g/、
味液10g/、L−システイン1g/、
FeSO4・7H2O 10g/およびメタクリルアミド
8g/からなる培地をPH7.2に調整後、それぞ
れ100mlを500ml容三角フラスコに入れて滅菌し
た。 冷却後、これにシユークロース 5g/、ペ
プトン 5g/、酵母エキス 3g/、麦芽
エキス 3g/、PH7.8からなる培地で1日間
予め培養したシユードモナス・クロロラフイス
B23(微工研条寄第187号)菌株の培養液1mlを接
種し、25℃にて2日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離(3℃、10000rpm、
20分)により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液(菌体濃度約
20g/、1.7×103U/ml)を得た。 この菌体懸濁液2.5mlに、表−1に示すニトリ
ル類を10mg含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを
加えPH6.5に調整後、氷冷下に5日間放置し、放
置前後のニトリル水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率(表中、活性残存率と略す。以下
同じ)を算出し同表に示す結果を得た。
属の微生物の産生するニトリルヒドラターゼに基
づくニトリル水和活性の経済的な低下を防止し、
この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酸素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和し
て対応するアミド類を生成せしめる酵素として、
本発明者の中の山田らにより見出されており
〔Agric.Biol.Chem.46、1165〜1174(1982)参照〕、
その具体的利用例としてニトリルヒドラターゼを
産生するシユードモナス属の微生物を用いC2-4の
ニトリルから対応するアミドを生成させる方法が
提案されている〔特公昭59−37951号公報および
Agric.Biol.Chem.46、1183〜1189(1982)参照〕。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において上記ニトリルヒドラターゼのニトリル水
和活性は不安定で、経時的に低下することが判明
した。この低下は、固定化の有無を問わずニトリ
ルヒドラターゼが菌体内にある状態および菌体か
ら分離された状態いずれの場合においても起こる
が、後者の場合の方が大きく、著しい場合には短
期間で全く使用不可能となる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリルヒド
ラターゼのニトリル水和活性を効率的に利用する
ことを目的として、鋭意検討した結果、特定の物
質、すなわち、ニトリル類、アミド類および有機
酸またはその塩類等の使用が該目的に極めて有効
であることを見出し、この知見に基づいてなされ
たものである。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るシユードモナス(Pseudomonas)属の微生物
の培養液から分離、所得した微生物菌体、該菌体
から分離、抽出した酵素ニトリルヒドラターゼま
たはこれらの固定化物を懸濁液ないしは溶液の状
態で保存するに際し、安定化剤としてニトリル
類、アミド類、および有機酸またはその塩類の中
から選ばれた少なくとも1種の化合物を添加する
こと、を特徴とするニトリル水和活性の保持方
法、を要旨とするものである。 発明の具体的な説明 微生物: 本発明における微生物は、ニトリルヒドラタ
ーゼを産生し、ニトリル特にアクリロニトリル
を水和して、対応するアミド特にアクリルアミ
ドを生成することができるシユードモナス属の
微生物である。具体的には、例えば、前記特公
昭59−37951号公報に記載のシユードモナス・
クロロラフイス B 23(Pseudomonas
chlororaphis B 23)〔微工研条寄第187号〕
およびシユードモナスsp.PS 1(Pseudomonas
sp.SP 1)〔微工研条寄第188号〕、その他シユ
ードモナス・オバリス(Pseudomonas
ovalis)〔IAM 1002〕、シユードモナス・フル
オレツセンス(Pseudomonas fluorescens)
〔IFO 3081およびIFO 3925〕およびシユード
モナス・レプテイリボーラ(Pseudomonas
reptilivora)〔IFO 3461〕などを挙げることが
できる。これらの微生物は、それぞれ工業技術
院微生物工業研究所(微工研)、東京大学応用
微生物研究所(IAM)および財団法人発酵研
究所(IFO)にそれぞれ上記番号で寄託されて
いる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコー
ス、シユークロース、デキストリン、グリセリ
ン等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒
素源、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペ
プトン等の窒素源、およびプロピオニトリル、
イソブチロニトリル、プロピオンアミド、イソ
ブチルアミド、メタクリルアミド等の酸素誘導
物質その他を適宜含有する倍地に、それぞれの
菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは6〜9程度、好ましくは7〜8程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜
30℃程度とし、培養時間は1〜3日程度で充分
である。培養により得た菌体は遠心分離等によ
り集菌することができる。 ニトリルヒドラターゼ: 本発明におけるニトリルヒドラターゼは前記
微生物が産生する酵素であり、その分離、抽出
は次のようにして行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体
を所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁
し、超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチ
プレス等により菌体を破砕し、遠心分離等によ
り未破砕菌体および細胞壁、膜を除去し、可溶
性画分(菌体抽出液)を得る。さらに、その菌
体抽出液は常法に従い、適宜、硫安分画、
DEAE−Sephacel Phenyl−sepharose、
sephadex等のカラムを用いたり、さらには結
晶化等により精製することにより、部分精製酵
素液または精製酵素(液)を得ることができ
る。 本発明では、これら精製段階の如何によら
ず、いずれの酵素も対象となる。 固定化菌体・固定化酵素: 本発明における固定化菌体・固定化酵素は、
上記微生物菌体およびニトリルヒドラターゼ
を、常法に従い、それぞれ活性炭等へ吸着させ
る吸着法、イオン交換樹脂等に結合させるイオ
ン結合法ならびにガラスビーズ等に共有結合さ
せる共有結合法およびアクリルアミド、カラギ
ーナン、アルギン酸等で包括する包括法等によ
り得ることができる。 安定化剤: 本発明において使用する安定化剤は、ニトリ
ル類、アミド類および有機酸またはその塩類の
中から選ばれた化合物であり、これらはそれぞ
れ単独にまたは混合して使用することができ
る。 具体的には、例えば次の化合物を挙げること
ができる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソ
ブチロニトリルのような脂肪族ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニ
トリル、β−アミノプロピオニトリルのよう
なアミノニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのよう
なヒドロキシニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルの
ような不飽和ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシ
ポニトリルのようなジニトリル類と対応する
ジアミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモ
ノシアノアミドおよびモノシアノ酸またはそ
の塩類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリル
のような芳香族ニトリル類と対応するアミド
および酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリル
のような複素環式ニトリル類と対応するアミ
ドおよび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピ
オニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有
する酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持: 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、
前記した化合物を、同じく前記した微生物菌
体、ニトリルヒドラターゼおよびこれらの固定
化物を各種バツフアー溶液、生理食塩水などに
分散ないしは溶解させた懸濁液ないし溶液に添
加することにより達成することができる。安定
化剤の添加量は通常0.01〜50g/の範囲であ
るが、長期保存、コスト等を考慮すると0.1〜
10g/添加することが望ましい。 懸濁液あるいは溶液のPHは5〜8、好ましく
は5.5〜7の範囲で、リン酸バツフアー、トリ
スバツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用
いられる。また、場合によつては、塩酸、硫酸
等の酸、カセイソーダ、カセイカリ等のアルカ
リを添加し、PHをコントロールすることも有効
である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、
低温、特に0℃付近で保存することが望まし
い。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長期間安
定に保持することができるが、本発明の安定化剤
の添加は、特に、該活性の経時的低下が大きい菌
体から分離した酵素に対して有効である。その効
果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存安定
性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の保持
においても認められる。従つて、安定化剤は各精
製工程において使用する酵素液またはバツフアー
溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液または菌体懸濁液0.1mlを、アクリロニトリル
2.5重量%含むM/20リン酸バツフアー(PH7.7)
9.9mlに加えて、10℃、10分間反応させ、この時
生成したアクリルアミドをガスクロマトグラフイ
ーにより定量することにより測定した。また、酵
素液または菌体懸濁液について1分間に1μモル
のアクリルアミドを生成する能力を1単位(U)とし
て表示した。 実施例1〜21および比較例1 シユークロース10g/、KH2PO4 1g/、
K2HSO4 1g/、MgSO4・7H2O 1g/、
味液10g/、L−システイン1g/、
FeSO4・7H2O 10g/およびメタクリルアミド
8g/からなる培地をPH7.2に調整後、それぞ
れ100mlを500ml容三角フラスコに入れて滅菌し
た。 冷却後、これにシユークロース 5g/、ペ
プトン 5g/、酵母エキス 3g/、麦芽
エキス 3g/、PH7.8からなる培地で1日間
予め培養したシユードモナス・クロロラフイス
B23(微工研条寄第187号)菌株の培養液1mlを接
種し、25℃にて2日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離(3℃、10000rpm、
20分)により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液(菌体濃度約
20g/、1.7×103U/ml)を得た。 この菌体懸濁液2.5mlに、表−1に示すニトリ
ル類を10mg含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを
加えPH6.5に調整後、氷冷下に5日間放置し、放
置前後のニトリル水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率(表中、活性残存率と略す。以下
同じ)を算出し同表に示す結果を得た。
【表】
実施例22〜39および比較例2
実施例1〜21において、ニトリル類に代えてア
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−2
に示す結果を得た。
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−2
に示す結果を得た。
【表】
実施例40〜59および比較例3
実施例1〜21においてニトリル類に代えて有機
酸類を添加し、さらにPHを6.0に調整した以外は
同例と同様にして表−3に示す結果を得た。
酸類を添加し、さらにPHを6.0に調整した以外は
同例と同様にして表−3に示す結果を得た。
【表】
【表】
実施例60〜77および比較例4〜9
実施例1と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
(1.8×103U/ml)2.5mlに、表−4に示す安定化
剤25mgを含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、氷冷下にて4日間放置し
た。 それぞれの懸濁液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
4に示す結果を得た。
(1.8×103U/ml)2.5mlに、表−4に示す安定化
剤25mgを含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、氷冷下にて4日間放置し
た。 それぞれの懸濁液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
4に示す結果を得た。
【表】
【表】
実施例78〜94および比較例10
実施例1と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
(1.8×103U/ml)2.5mlに表−5に示す安定化剤
を所定量含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0(無添加はPH6.5)に調整後、氷冷下にて
3日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測
定値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に
示す結果を得た。
(1.8×103U/ml)2.5mlに表−5に示す安定化剤
を所定量含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0(無添加はPH6.5)に調整後、氷冷下にて
3日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測
定値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に
示す結果を得た。
【表】
【表】
濃度:放置液中の安定化剤濃度
実施例95および比較例11 実施例1と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
50mlと10g/のイソ酪酸アンモニウム塩を含有
するM/10リン酸バツフアー(PH6.5)50mlを混
合した(3.2×103U/ml)。 本菌体懸濁液をフレンチプレス(大岳製作所
製)にかけ、1000〜1500KgGの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離(12000rpm、30分)にて未
破砕菌体及び細胞壁等の不溶分を除去し、菌体抽
出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液(3.2×103U/ml)を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を氷令下にて、3日間放置し、放
置開始前後のニトリル水和活性を測定し、表−6
に示す結果を得た。
実施例95および比較例11 実施例1と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
50mlと10g/のイソ酪酸アンモニウム塩を含有
するM/10リン酸バツフアー(PH6.5)50mlを混
合した(3.2×103U/ml)。 本菌体懸濁液をフレンチプレス(大岳製作所
製)にかけ、1000〜1500KgGの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離(12000rpm、30分)にて未
破砕菌体及び細胞壁等の不溶分を除去し、菌体抽
出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液(3.2×103U/ml)を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を氷令下にて、3日間放置し、放
置開始前後のニトリル水和活性を測定し、表−6
に示す結果を得た。
【表】
実施例96および比較例12
実施例1と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
(含水率75%)40ml、アクリルアミド4.5g、N,
N′−メチレンビスアクリルアミド0.5gおよび
M/20リン酸バツフアー(イソ酪酸アンモニウム
10g/含有、PH6.0)40mlを混合して、均一な
懸濁液とした。これに、5%ジメチルアミノプロ
ピオニトリル水溶液5mlおよび1.0%過硫酸カリ
ウム水溶液10mlを加えて、10℃に30分保つて重合
させた。得られた塊状の菌体含有ゲルを小粒子に
破砕し、5g/のイソ酪酸アンモニウム塩を含
むPH7.0のM/20リン酸バツフアーで充分洗浄し
た固定化菌体約90gを得た。 この洗浄固定化菌体を5g/をイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、0℃にて5日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、0℃にて5日間放置した。 これら固定化菌体について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル1gとアクリロニトリル5g、M/20
リン酸バツフアー(PH7.7)97mlを混合し、撹拌
下に0℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−7に示した。
(含水率75%)40ml、アクリルアミド4.5g、N,
N′−メチレンビスアクリルアミド0.5gおよび
M/20リン酸バツフアー(イソ酪酸アンモニウム
10g/含有、PH6.0)40mlを混合して、均一な
懸濁液とした。これに、5%ジメチルアミノプロ
ピオニトリル水溶液5mlおよび1.0%過硫酸カリ
ウム水溶液10mlを加えて、10℃に30分保つて重合
させた。得られた塊状の菌体含有ゲルを小粒子に
破砕し、5g/のイソ酪酸アンモニウム塩を含
むPH7.0のM/20リン酸バツフアーで充分洗浄し
た固定化菌体約90gを得た。 この洗浄固定化菌体を5g/をイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、0℃にて5日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、0℃にて5日間放置した。 これら固定化菌体について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル1gとアクリロニトリル5g、M/20
リン酸バツフアー(PH7.7)97mlを混合し、撹拌
下に0℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−7に示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 ニトリル水和活性を有するシユードモナス
(Pseudomonas)属の微生物の培養液から分離、
取得した微生物菌体、該菌体から分離、抽出した
酵素ニトリルヒドラターゼまたはこれらの固定化
物を懸濁液ないしは溶液の状態で保存するに際
し、安定化剤としてニトリル類、アミド類、およ
び有機酸またはその塩類の中から選ばれた少なく
とも1種の化合物を添加すること、を特徴とする
ニトリル水和活性の保持方法。 2 懸濁液ないしは溶液中のニトリル類、アミド
類、および有機酸またはその塩類の濃度が0.01〜
50g/である特許請求の範囲第1項記載の保持
方法。 3 懸濁液ないしは溶液のPHが5〜8である特許
請求の範囲第1〜2項記載の保持方法。 4 シユードモナス(Pseudomonas)属の微生
物がシユードモナス・クロロラフイス B 23
(Pseudomonas chlororaphis B 23)〔微工研
条寄第187号〕またはシユードモナスsp.PS1
(Pseudomonas sp.PS 1)〔微工研条寄第188号〕
である特許請求の範囲第1〜3項記載の保持方
法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61101043A JPS62257386A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
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