JPS594987B2 - ニトリラ−ゼ活性の高い細菌菌体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はニトリラーゼ活性の高い細菌菌体の製造法に関
する。

近年、固定化酵素または固定化微生物に関する技術の急
速な進歩とともに微生物または酵素を種々の単位反応用
の触媒として利用しようとする動きが活発化しつつある
。

ニトリラーゼはニトリル類を水和して粕当するアミド類
を生成せしめる酵素として知られており、その代表的な
反応例として、例えば、特開昭５４−１２９１９０号公
報にはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属およびノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ ）属
の細菌が、特開昭５１−８６１８６号公報にはバチルス
（Ｂａｃｉ ｆｌｕｓ ）属、Ｐｒｅｖｏｔの意味での
バクテリウムーム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ ）属、マ
イクロコカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ）属およびＢ
ｅｒｇｅｙの意味でのブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌が二） ＩＪクラーゼ性
を有しアクリロニトリルを水和してアクリルアミドを生
成せしめることが記載されている。

そこで、本発明者らはこの酵素源の工業的製造を目的と
して二ｔ−ＩＪラーゼ生産能を有する細菌を高活性、高
収率に取得する方法について種々検討した結果、該細菌
の培養に際し、培地中に水溶性鉄化合物を存在させて培
養するとニトリラーゼ収量が顕著に増大することを認め
た。

本発明はこの知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明はニトリラーゼを生産する能力を有す
る細菌を培養してニトリラーゼ活性を有する細菌菌体を
製造するに際して、培地中に水溶性鉄化合物を存在させ
ることを特徴とするニトリラーゼ活性の高い細菌菌体の
製造法を要旨とするものである。

本発明において使用する細菌は、アクリロニトリルを水
和してアクリルアミドを生成する能力を有するものであ
れば微生物の分類学的位置づけには関係なくいずれも利
用することができる。

例えば、前記、特開昭５４−１２９１９０号公報記載の
本発明者らが土壌中より分離したコリネバクテリウム属
Ｎ−７７１菌株（微工研菌寄第４４４５号、コリネバク
テリウム属Ｎ−７７４菌株（微工研菌寄第４４４６号）
およびノカルジア属Ｎ−７７５菌株（微工研菌寄第４４
４７号）などを好適にあげることができる。

本発明において使用する水溶性鉄化合物は無機または有
機の鉄塩、もしくは有機の鉄錯化合物である。

具体的には、例えば、２価または３価の鉄の硫酸塩、塩
酸塩などの無機塩、酢酸、フマル酸などの有機酸塩、お
よびクエン酸、酒石酸、エチレンジアミン四酢酸、ニト
リロトリ酢酸などと鉄との有機鉄錯化合物を挙げること
ができる。

この中、有機鉄錯化合物を使用し、鉄を有機錯化合物の
形で培地中に存在させることが菌体の酵素活性を高める
上で特に好ましい。

これらの鉄化合物の培地への添加量は鉄イオンとして０
．２ ｍ？／ ｌ！未満でも効果はみられるが、通常０
．２〜５００■／ｌ。

好ましくは１〜１００η／ｌである。

本発明は、具体的には次のようにして行うことができる
。

すなわち、前記した細菌の１種をグルコース、マルトー
ス、サッカロースなどの炭素源、アンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
などの窒素源、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、カ
ゼイン分解物、ペプトンなどの有機栄養源、およびリン
酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、その他の微量金属
塩などの無機栄養源を適宜含有する培地で培養すること
により行われる。

この際、得られる菌体のニトリラーゼ活性を高めるため
に前記水溶性鉄化合物の添加が必須である。

培養は通常、温度２５〜３０°Ｃ，ｐＨ５〜８、好気的
条件下３０〜１００時間で良好に行われる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

なお、実施例中、アクリロニトリル水利のニトリラーゼ
酵素活性の測定は次の方法により行った。

すなわち、培養液から菌体を分離し、０．０５ＭＩＪン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄して洗浄菌体を得る。

これを酵素源としてアクリロニトリル２．５％を含む０
．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）５１１Ｌｌに適
量の酵素液を加え、さらに上記リン酸塩緩衝液で全量を
１０ｒｎｌとした後１０℃で１０分間反応させる。

この時に生成するアクリルアミドをガスクロマトグラフ
ィーにより定量し、上記条件で１〜の菌体が１分間当り
１μモルのアクリルアミドを生成する場合を１単位とし
た。

また、実施例中、％は重量に関する。

実施例 １ グルコース１％、（ＮＨ４） ２ Ｓ ｏ４ｏ、 ５％
。

ＫＨ２Ｐ０，０．１％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，１％
、ＮａｃｌＯ１０１％、 Ｃａｃｌ、 ・２ Ｈ２００
，旧％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０４μ％、Ｋ１１０μ％、
Ｆｅｃ１３−６Ｈ２０２０μ％、ＭｎＳＯ４＠ ４ Ｈ
２Ｏ４０ｐ％、 Ｎａ２Ｍｃ０４・２Ｈ２０２０μ％、
ＺｎＳＯ４・６ Ｈ２０４０μ％ 。

カザミノ酸１％およびサイアミン塩酸塩０．０００２％
からなる基本培地（ｐＨ７，５）各１０ｒｒＬｌを中型
試験管にとり、これに硫酸第一鉄または塩化第二鉄を鉄
イオンとしてＯ〜５００１ｒ１Ｆ／／ｌの範囲で添加し
、１２０℃、１５分間殺菌した。

冷却後、ｐＨ調節用に殺菌ＣａＣＯ３を２％加え、これ
に上記培地（硫酸第一鉄をｏ、ｏｏｉ％含む）で予め培
養したコリネバクテリウムＮ−７７４菌株（微工研菌寄
第４４４６号）の培養液０．０５ｒＩＬｌを加え、３０
℃で３日間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離して菌体を採取し、０．０５ＭＩ
Ｊン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄し洗浄菌体を得た
。

この洗浄菌体についてアクリロニ） ＩＪル水和のニト
リラーゼ酵素活性を測定した。

結果は第１表に示す通りである。第１表から明らかなよ
うに基本培地に水溶性鉄化合物を添加しない場合は菌体
の生育は良好であるが、酵素生産がほとんど行われない
。

これに対し水溶性鉄化合物を存在させることにより菌体
の酵素活性が大巾に増加し、菌体内に酵素が多量に生産
されたことがわ力）る。

実施例 ２ 実施例１で使用した基本培地者１０Ｍを中型試験管にと
り、それぞれに硫酸第一鉄、クエン酸第二鉄およびエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム鉄を添加し、１２０℃、
１５分間殺菌した。

冷却後ｐＨ調節用に殺菌ＣａＣＯ３を２％加え、実施例
１で使用のコリネバクテリウムＮ−７７４菌株（微工研
菌寄第４４４６号）の前培養液０．０５ｒＩＬｌを加え
、３０℃で３日間培養した。

培養終了後、実施例１と同様にして菌体を採取し酵素活
性を測定した。

結果は第２表に示す通りである。

第２表から明らかなように水溶性鉄化合物を添加した培
地で培養した菌体は無添加の培地で培養した菌体にくら
べ大巾に酵素生産量が増大している。

特に、鉄イオンを有機錯化合物の形で存在させるのが効
果的であることがわかる。

実施例 ３ グルコース１．０％、フペトン０．５％、酵母エキス０
．３％および麦芽エキス０．３％からなる培地（ｐＨ７
，５）各１０ｍを中型試験管にきり、これに硫酸第一鉄
を鉄イオンとして０および２η／ｌ添加し、１２０℃、
１５分間殺菌した。

冷却後、水溶性鉄化合物を添加しない上記培地で予め培
養して得たコリネバクテリウム属のＮ−７７４菌株（微
工研菌寄第４４４６号）、ノカルジア属のＮ−７７５菌
株（微工研菌寄第４４４７号）およびブレビバクテリウ
ムインペリアレー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍ
ｐｅｒｉａｌｅ） Ｉ ＡＭ １６５４のそれぞれの培
養液０．０５ｒｆＬｌを加え、３０℃、４８時間培養し
た。

培養終了後、実施例１と同様にして菌体を採取し酵素活
性を測定した。

結果は第３表に示す通りである。

第３表から明らかなように水溶性鉄化合物を添加した培
地で培養した菌体は無添加の培地で培養した菌体にくら
べ酵素活性が増加し菌体内に酵素が多量に生産されたこ
とがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ニトリラーゼを生産する能力を有する細菌を培養し
   てニトリラーゼ活性を有する細菌菌体を製造するに際し
   て、培地中に水溶性鉄化合物を鉄イオンとして、０．２
   〜５００■／ｌの濃度で存在させることを特徴とするニ
   トリラーゼ活性の高い細菌菌体の製造法。 ２ 水溶性鉄化合物が無機または有機の鉄塩、もしくは
   有機鉄錯化合物である特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。