JPS59130182A - シユ−ドモナス属細菌の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いシュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌体を高収率で生産
する方法に関する。

近年、固定化酵素または固定化微生物に関する技術の急
速な進歩と共に微生物寸たは酵素あるいはその固定化物
を種々の単位化学反応や複合化学反応の触媒として利用
しようとする動きが活発化しつつある。

ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和して相当す
るアミＰ類を生成せしめる酵素として、本発明者の中の
山田らに見出されており［Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　４６１１６５　（１９８２）
参照〕、その具体的利用例としてニトリルヒドラターゼ
を有する細菌を用いアクリロニトリルからアクリルアミ
ｒを生成させることが提案されている〔特願昭５６−１
８４６８８号、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　４６１１８３（１９８２）参照〕。

このような場合に、ニトリルヒドラターゼ活性の高いシ
ュードモナス属菌体が高収率で取得できれば、稗益する
ところは大きい。

発明の概要 要旨 本発明は−Ｆ記の点に解決を与えるととを目的とし７、
該細菌の培養に際して培地中に特定の物質すなわちシス
ティンおよび（または）シスチンを添加することによっ
て、この目的を達成しようとするものである。

従って、本発明にするニトリルヒドラターゼ活性の高い
シュードモナス属細菌の培養方法は、シュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属してニトリルヒ１きラ
ターゼを産生する能力を有する細菌をニトリルヒドラタ
ーゼ酵素が誘導される条件で培養してニトリルヒドラタ
ーゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際し、培地
中にシスティンおよび（！！たけ）シスチンを存在させ
ること、を特徴とするものである。

効果 培地にシスティンおよび（寸たは）シスチンを添加して
シュードモナス属細菌の培養を行なうと、単位培養液当
りのニトリルヒドラターゼ活性が顕著に増大する。たと
えば、システィン等を添加すると、無添加の場合に比較
して単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性の取計
を約３倍近くまで向上させることができる。

この単位培養液当りのニトリルヒドラターぜ活性の増大
は、菌体の濃度（すなわち、菌体の収量）および菌体自
体の活性（すなわち、菌体内のニトリルヒドラターゼの
量）の増大に因るものと解される。

本発明において期用する細菌は、二）　ＩＪルヒＰラタ
ーゼ活性を有し、ニトリル、特にアクリロニトリル、を
水和して対応アミｒ１特にアクリルアミド、を生成する
ことができるンユー１：″モナス属の細菌である。具体
的には、例えば、前記特願昭５６−１．８４６８８号の
明細書に記載のシューｒモナス０クロロラフイスＢ　２
３　（Ｐｓｅｕｄｏｒｎｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐ
ｈｉＳＢ２３）微工研条寄第１８７号およびシュードモ
ナスｓｐ、　ＰＳ　］、　（Ｐｓ’ｅｕｃｌｏｍｏｎａ
ｓ　ｓｐ、　ＰＳ　ｉ　）微工研条寄第１８８号などを
挙げることができる。これら両画の詳細は、前記特願昭
５６−１８４６８８号明細真−に記載されている。

活性向上剤 本発明においては、活性向上剤としてシスティンおよび
（才たは）シスチンを１吏用する。これらは、それぞれ
単独にまたは両者混合して、使用することができる。

本発明において使用するシスティンはＤ−システィン、
Ｌ−システィン、Ｄ、Ｌ−システィンおよびシスチンは
Ｄ−シスチン、Ｌ−シスチン、Ｄ。

Ｌ−シスチンのいずれでもよく、これらはそれぞれ単独
で用いてもよく、寸だ２種以上混合して用いてもよいこ
とは上記した通りである。

培養一本発明の実施 本発明の一般的実施態様を示すと次の通りである。

すなわち、炭素源、例えばグルコース、フラクトース、
シュークロース、デキストリン、クリセリン、エタノー
ルおよびコハク酸など、窒素源、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
および尿素など、有機栄養源例えば酵母エキス、肉エキ
ス、麦芽エキス、カゼイン分解物およびペプトンなど、
および無機塩、例えばリン酸塩、マグネシウム、カリウ
ム、鉄、その他微量金属など、その他、を適宜含有する
培地にＤ−システィン、Ｌ−システィン、Ｄ、Ｌ−シス
ティン、Ｄ−シスチン、Ｌ−シスチン、およびり、Ｌ−
シスチンから選ばれた少なくとも１種を一時にあるいは
逐次的に添加して０．１〜５．０ｇ／リットル、好まし
くは０゜５〜２．０　ｇ　／リットル、の濃度で存在さ
せ、この培地にニトリルヒドラターゼ活性を有するシュ
ードモナス属の細菌を接種して、好気信条注下に培養を
行なう。

この培養は、酵素誘導剤を添加して、ニトリルヒドラタ
ーゼ酵素が誘導される条件で行々われる。

酵素誘導剤としては、例えば、ゾロビオニトリル、イン
ブチロニトリル、プロピオンアミドおよびイソブチルア
ミＰ々どが挙げられる（これらの酵素誘導剤は、培養中
にその濃度が通常１５　ｇ　／　’）ットル未満、好ま
しくは１．０　ｇ　／リットル以下、となるように逐次
的に添加すればより効果的である）。

培地のｐＨは６〜９程度、奸才しくは７〜８程度、培養
温度は２０〜３７℃程度、好ましくは２５〜３０℃程度
、培養時間は１〜３日程度で充分である。

実施例 下記の実験例中、アクリロニトリル水利のヒドラターゼ
活性は、培養液１ｍｌ　　をアクリロニトリルを２．８
重量％含むリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）９ｍｌに加え
て１０℃でＩＯ〜６０分間反応させ、この時生成したア
クリルアミドをガスクロマトグラフィーにより定量し、
このデータを基に培養液１ｒｎ１当ね、１分間に１μモ
ルのアクリルアミドを生成する能力を１単位として算出
した。

実施例１ シュークｏ−ス１０ｇ／リットル、Ｋ、、ＨＰＯ４２ｇ
／リット／へＭｇ　ＳＯ４・７Ｈ２００−５ｇ　／リッ
トＡｙ。

ＮａＣ１１ｇ／リットルおよびＦｅ　Ｓｏ　４　・７Ｆ
Ｉ２０１０　ｍ　ｌ　／リットルからなる培地にＬ−シ
スティンヲｏ。１〜５．０ｇ／’）ットルの濃度範囲で
加え、ｐＩ（７，２に調整後、それぞれ１０σｍｌを５
００ｍ１容三角フラスコに入れて滅菌した。

冷却後、それぞれイソブチロニトリルを０．４　ｇ加え
、これにＬ−シスナインを含まない上記組成の培地で予
め培養したシュードモナス・クロロラフイスＢ２．３（
微工研条寄第１８７号）菌株の培養液０．５　ｍｌを接
種し、５℃にて２日間好気的に振とり培養した。

なお、比較のためし一システィン無添加の場合について
同様に培養を行なった。

得られプζ培養液について、菌体濃度およびアクリロニ
トリル水利のニトリルヒドラターゼ活性の測定を行なっ
た。結果を第１表に示した。

第　　１　　表 実施例２ シェークｏ−１１０ｇ／リットル、Ｋ２■（Ｐｏ４２ｇ
／リットル、ＭｇＳＯ４・７Ｆ（２００，５ｇ／リット
ル、ＮａＣ１１ｇ　／リットルおよびＦｅＳＯ４・７Ｈ
７Ｈ２Ｏ１０／リツトルからなる培地に、Ｄ−システィ
ン、Ｄ。

Ｌ−システィンまたはＬ−シスチンのそれぞれを、１．
０ｇ／リットルになるように加え、ｐＨ７，２に調整後
、それぞれ１００ｍ１を５００　ｍｌ容三角フラスコに
入れ滅菌した。

冷却後、それぞれのフラスコにイソブチロニトリルを０
．４．ｇ加え、これに、システィンまたはシスチン類を
含まない上記組成の培地で予め培養したシュードモナス
・クロロラフイスＢ２３（微工研条寄第１８７号）菌株
の培養液０．５ｍｌを接種し、５℃にて２日間好気的に
振とり培養した。

なお、比較のためこれらシスティン″！、たけシスチン
類を含まない場合について、同様に培養を行なった。

得られた培養液について菌体濃度およびアクリロニ）　
ＩＪル水和のニトリルヒドラターゼ活性の測定を行なっ
た。

結果を第２表に示した。

第２表 実施例３ グリセロール１０ｇ／リットル、Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ／２
Ｈ２０４ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ／リットル、Ｎ
ａＣ１１ｇ　／リットルおよびＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１
０ｍｇ／リットルからなる培地に、Ｌ−システィン、ま
たはＬ−シスチンのそれぞれを１．０ｇ／リットルにな
るように加え、ｐＨ７゜２に調製後それぞれ１００　ｍ
ｌを５００ｍ１容三角フラスコに入れ滅菌した。

冷却後、それぞれのフラスコにゾロざオニトリルを０．
８ｇ加え、これにシスティンまたはシスチン類を含まな
い上記組成の培地で予め培養したシュードモナスｓｐ　
ＰＳ−１（微工研条寄第１８８号）菌株の培養液０．５
ｍｌを接種し、５°Ｃにて２日間好気的に振とり培養し
た。

なお、比較のため、これらシスティンまたはシスチン類
を含まない場合について、同様に培養を行なった。

得られた培養液について菌体濃度およびアクリロニトリ
ル水和のニトリルヒドラターゼ活性を測定した。

結果を第３表に示した。

第３表 実施例４ シュークロース１０ｇ／リットノペ　Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ
／リットノペ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ　／リッ
トル、ＮａＣ１１ｇ／リットル、ＦｅＳＯ４・７Ｈ７Ｈ
２Ｏ１０／リツトルおよび酵母エキス２ｇ／リットルか
らなる培地にＬ−システィン１〜２ｇ／リットルを添加
し、ｐＨ７，２に調整後、それぞれ１００ｍ１を５００
ｍ１容三角フラスコに入れて滅菌した。

冷却後、それぞれイソズチロニトリル００４ｇを加え、
これＶＣＬ−システィンを含寸ない上記組成の培地で予
め培養したシュードモナス・クロロラフイスＢ２３（微
工研条寄第１８７号）菌株の培養液０．５ｍｌを接種し
、５℃にて２日間好気的に培養しプζ。

なお、比較のため、Ｌ−システィン無添加の場合につい
て同様に培養を行ない、得られた培養液について菌体濃
度およびニトリル上１：″ラターゼ活性の測定を行って
、第２表に示す結果を得た。

第　　４　　表 出願人代理人　　猪　　股　　　　清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属
   してニトリルヒドラターゼを産生ずる能力を有する細菌
   をニトリルヒドラターゼ酵素が誘導される条件で培養し
   てニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製
   造するに際し、培地中にシスティンおよび（才りけ）シ
   スチンを存在させることを特徴とする、シュードモナス
   属細菌の培養方法。 ２培地中のシスティンおよび（またはシスチン）の濃度
   が０．１〜５．０　ｇ　／リットルである、特許請求の
   範囲第１項記載の培養方法。 ３、シュードモナス属に属しニトリルヒドラターゼを産
   生する能力を有する細菌がシュードモナス・りｏｏラフ
   イスＢ　２３　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏ
   ｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３）微工研条寄第１８７号またはシ
   ュードモナスｓｐ、　ＰＳｌ、　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
   ａｓ　ｓｐ。 Ｐｓｉ）微工研条寄第１８８号である特許請求の範囲第
   １〜２項記載の培養方法。