JPS6255098A - 光学活性α−オキシ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 上の矛１ 本発明は光学活性α−オキシ酸の製造法に関する。より
詳しくは特定の微生物が産生ずる酵素の作用により、Ｄ
ＬまたはＬ−α−オキシ酸アミドからＬ−α−オキシ酸
を製造する方法に関する。

光学活性α−オキシ酸は医薬品などの原料として、ある
いはジアステレオマー形成による光学分割剤として有用
な物質である。

一倣ｍ歪− 光学活性α−オキシ酸の製造は、糖蜜等を原料とした発
酵による方法、酵母の培養液中にＤＬ−α−オキシニト
リルを加えてＬ−α−オキシ酸を生産する方法〔特開昭
４９−４２８８６号公報〕、微生物によるα−オキシ酸
の立体選択的な酸化反応による方法〔西独特許公開第２
，８３２，２３０号公報〕、Ｌ−アミノ酸を亜硝酸でジ
アゾ化後オキシ化する方法、α−ハローカルボン酸をデ
ハロゲナーゼにより立体選択的に脱ハロゲン化後オキシ
酸に変換する方法〔特開昭５９−３１６９０号公報〕お
よび不斉触媒によるピルビヅ酸頻の立体選択的な還元に
よる方法（Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、　（４Ｂ）４３５１（１
９７６））などが知られている。

しかしながら、これらの方法にも種々の欠点がある。例
えば、培養液中で生産するものについては、目的生成物
の分離、精製が難しく、酸化反応を利用して生産する場
合には補酵素の再生を考慮しなければならず、この他反
応系が複雑であったり、Ｌ−アミノ酸を原料とする場合
のように原料が高価である点などが挙げられる。

１１旦互１ かかる状況から、本発明者らは、特に化学合成で容易か
つ安価に製造できるα−オキシ酸アミドを原料とし、こ
れから微生物学的方法により対応する光学活性α−オキ
シ酸を得るべく鋭意検討した結果、エンテロバクタ−属
およびシュードモナス属に属する微生物が産生ずる酵素
がα−オキシ産テアミドＬ一体だけを選択的に加水分解
し得ることを見出し、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、エンテロバクタ−（Ｅｎ　Ｌｅｒ
ｏ−ｂａｃｔｅｒ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏ＋５ｏｎａｓ）属の微生物が産生ずるＬ−α−オキ
シ酸テアミド加水分解活性有する酵素の作用により、一
般式　　１？−Ｃ１ｌ−ＣＯＮＩ＋□■ 〔式中、Ｒはアルキル基（炭素数１〜４）、フェニル基
、アラルキル基または置換基を有するこれらの基を表す
。〕 で示されるＤＬ−またはＬ−α−オキシ酸アミドから対
応するＬ−α−オキシ酸を生成せしめること、を特徴と
する光学活性のα−オキシ酸の製造法を要旨とするもの
である。

本発明で使用するＤＬ−α−オキシ酸アミドは、合成の
容易なα−オキシニトリルからＭｎＪ触媒等を用いる接
触水和法、あるいはα−オキシ酸エステルにアンモニア
を作用させる方法などにより容易に得ることが可能であ
るが、このＤＬ−α−オキシ酸アミドあるいはまたＬ−
α−オキシ酸アミドから光学活性α−オキシ酸を製造す
ることについての報告は見あたらない。

■の具　・ｉ″日 本発明において使用される微生物は、本発明者らが各地
の土壌、汚泥等より新たに分離、見出したものであり、
具体的には例えば、エンテロバクタ−・クロアッセイＮ
−７９０１、シュードモナスＳＰ。

Ｎ−７１３１およびシュードモナスＳＰ、　　Ｎ−２２
１１を挙げることができる。

これらの微生物は、それぞれ微工研条寄第８７３号（エ
ンテロバクタ−・クロアッセイＮ−７９０１）、同第８
７４号（シュードモナスＳＰ、　　Ｎ−７１３１）およ
び同第８７５号（シュードモナスＳＰ、　　Ｎ−２２１
１）として工業技術院微生物工業゛技術研究所（微工研
）に寄託されており、閃学的性質はそれぞれ以下の通り
である。

一比二ｊユ０１１淋− ＋１１　　　形　　態 桿　　菌　　　　　　　０．８〜１．２　Ｘ　１．０〜
１．５μ麟鞭　毛　　　　　　周毛１本以上 運動性　　　　　　十 グラム染色性　　　陰　性 （２）　　生理学的性質 硝酸塩の還元　　　十 脱窒反応　　　　　− ＭＲテスト　　　　− ｖｐテスト　　　　士 インドールの生成　− 硫化水素の生成　　− クエン酸塩の利用　士 色素の生成　　　　− ウレアーゼ　　　　− オキシダーゼ　　　− カタラーゼ　　　　士 生育の範囲　　　　ＰＩ＋４〜１０ 至適温度　３５〜３７℃ 酸素に対する態度　通性　嫌気性 ０−Ｆテスト　　　Ｆ アドニトール　　　−− アラビノース　　　＋　　　　　　＋ キシロース　　　　＋　　　　　　＋ グルコース　　　　＋　　　　　　＋ マンノース　　　　　＋　　　　　　　＋フラクトース
　　　＋　　　　　　＋ ガラクトース　　　＋　　　　　　＋ マルトース　　　　＋　　　　　　＋ シュークロース　　＋　　　　　　＋ ラクトース　　　　＋　　　　　　＋ ラフィノース　　　＋ ラムノース　　　　＋ グリセリン　　　　＋　　　　　　＋ ソルビトール　　　＋　　　　　　＋ マンニトール　　　＋　　　　　　＋ イノシトール　　　−　　　　　　− ズルシトール　　　− ズルシトール　　　−　　　　　　− （３１その他 デンプンの分解　　− ゼラチンの分解　　− 尿素の分解　　　　弱 反応　　　　　　　− ドロラーゼ　　　　＋ β−ガラクトシ ダーゼ　　　　　　＋ シアン化カリウ ムの耐性　　　　　十 Ｎ二」ユＵ床 （１）　　　形　　態 桿　　菌 鞭　毛　　　　　　極上　１本以上 運動性　　　　　　十 芽　胞　　　　　　認めず グラム染色性　　　陰　性 （２）　　生理学的性質 脱窒反応　　　　　十 インドールの生成　− 硫化水素の生成　　− クエン酸塩の利用　十 色素の生成　　　　水溶性色素　　− 蛍光色素　　　− ウレアーゼ　　　　＋ オキシダーゼ　　　＋ カタラーゼ　　　　＋ ４０℃での生育　　　− ０−Ｆテスト　　　０ キシロース　　　　＋ グルコース　　　　＋　　　　　　− マンノース　　　　＋ ガラクトース　　　＋ ラクトース　　　　− マンニトール　　　＋ 資化性 グルコース　　　＋ フラクトース　　＋ Ｌ−アラビノ　　＋ −ス シュークロース　− マロネイト　　　− エタノール　　　− トレハロース　　− ｍｅｓｏ−イノシ トール＋ β−７ラニン　　＋ ＯＬ−フルギニン　＋ （３１その他 デンプンの分解　　− ゼラチンの分解　　− 尿素の分解　　　　− ト　の蓄積 アルギニンヒド ラーゼ　　　　　　− （１）　　　形　　態 桿　　菌 鞭　　毛　　　　　　　　　　極上 運動性　　　　　　十 芽　胞　　　　　　認めず グラム染色性　　　陰　性 （２）　　生理学的性質 脱窒反応　　　　　弱 インドールの生成　− 硫化水素の生成　　− クエン酸塩の利用　十 色素の生成　　　　水溶性色素　　弱 蛍光色素　　　− ウレアーゼ　　　　＋ オキシダーゼ　　　＋ カフラーゼ　　　　士 ４０℃での生育　　　−・ ０−Ｆテスト　　　Ｏ キシロース　　　　＋ グルコース　　　　＋ マンノース　　　　＋ ガラクトース　　　＋ ラクトース　　　　− マンニトール　　　閏 資化性 グルコース　　　＋ フラクトース　　＋ Ｌ−アラビノ　　十 一ス シュークロース　− マロネイト　　　− エタノール　　　− トレハロース　　＝ ■ｅｓｏ−イノシ トール　　　　弱 β−アラニン　　弱 ＤＬ−アルギニン　− （３）　　その他 デンプンの分解　　− ゼラチンの分解　　− 尿素の分解　　　　十 ラーゼ　　　　　　− アミノペプチダ ーゼ　　　　　　　＋ 以上の菌学的性質をバージニーズ・マニュアル・オブ・
デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒｇ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ［１ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８ｔｈ、　ｅｄ、）
に従って検索すると、Ｎ−７９０１菌株はエンテロバク
タ−・クロアッセイと、Ｎ−７１３１およびＮ−２２１
１菌株はシュードモナス属に属するｍ菌とそれぞれ同定
された。なお、Ｎ−７１３１菌株は細胞内にポリ−β−
ヒドロキシブチレートを蓄積し、４０℃での生育および
アルギニンジヒドラーゼが共に陰性、脱窒反応は陽性を
示し、糖の資化性等に非典型的性状が認められたが、本
菌はシュードモナス・ソラナシェラムまたはその近縁種
と思われる。

上記微生物を培養して本発明の酵素を生成せしめるには
、炭素源、窒素源、無機塩および有機栄養源を含有する
通常の培地を用い好気的に咳微生。

物の培養を行えばよい。

炭素源としてはグルコース、フラクトース、シェークロ
ース、マルトース等のｔＪ！ｇ、酢酸、クエン酸等の有
機酸その他が適宜使用でき、その使用量は通常培地中に
Ｏ５１〜１０％（重量％、以下同じ）である。窒素源と
してはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然
窒素源の他に各種の無機酸または有機酸のアンモニウム
塩等が使用できる。無機塩類としてはに１１２Ｐ０４、
ＫｚｌｌＰＯ，、ＮａｚｌｌＰＯｎ、ＮａＣ１，ＣａＣ
１ｚ、ｑｇｓｏ、、７Ｈ２０およびＰｅ、　Ｍｎ、　Ｚ
ｎ、　Ｃ。

等の重金属イオンが必要に応じて適宜使用される。

なお、この際、高い酵素活性を誘導させるため炭素数２
〜５の脂肪族アミド（例えば、アセトアミド、プロピオ
ンアミド、ブチルアミド、サクシノアミド等）を少量添
加することが効果的であり、その添加量は使用する微生
物によって若干異なるが通常培地中に０．０１％以上、
とりわけ０．１〜０．５χ程度とするのが好ましい。

培養はＰ］１５〜ｌＯ１温度２０〜４０℃の範囲で１〜
５日間好気的に行う。

本発明は、微生物が産生ずる酵素の作用を利用するもの
であるが、その酵素作用は上記のように培養して得た微
生物の培養液、分離生菌体、または菌体処理物（例えば
菌体破砕物、菌体抽出物等）、さらには常法に従って菌
体または菌体処理物を′ポリアクリルアミド、カラギー
ナン等で固定化した菌体等いずれの使用によっても得る
ことが可能で、これらの使用形態は全て本発明に適用し
得る。

本発明に使用されるＤＬ−またはＬ−オキシ酸アミドは
、前記一般式中、Ｒがアルキル基（炭素数１〜４）、フ
ェニル基、アラルキル基または置換基を有するこれらの
基で表される化合物であり置換基としてはメルカプト基
、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、フェニ
ル基、インドリル基、ピリジル基、イミダゾリル基等で
ある。

加水分解反応は、通常、これらＤＬ−またはＬ−オキシ
酸アミド濃度０．５〜５０％（反応基ｉ溶液はスラリー
状であってもよい）、微生物等の使用量は乾燥菌体とし
て反応液泡たり０．０１〜１０％、反応温度２０〜６０
℃、Ｐ１１６〜１１、反応時間０．１〜１００時間の範
囲で行う。

かくして、反応液中に生成、蓄積したし一オキシ酸は、
イオン交換法、その他公知の方法を組合せて分離、精製
し取得することができる。

また、原料としてＤＬ−α−オキシ酸アミドを使用した
場合、Ｌ−α−オキシ酸を分離した後の反応液からＤ−
α−オキシ酸とすることもできる。

さらに、Ｌ−α−オキシ酸アミドは酸または塩基により
ラセミ化させたり、酸化、還元によりピルビン酸誘導体
を経てラセミ化させた後、再び加水分解反応へ戻してＬ
−α−オキシ酸を得る原料とする。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの例のみに限定されるものではない。

実施例１ 下記の組成の培地を使用し、３０℃で４８時間Ｎ＝７９
０１閏の振盪培養を行った。

シュークロース　　　１％ 肉エキス　　　　　０．５％ プロピオンアミド　０．５％ Ｐ　Ｈに の培養液ＩＩｌを第１表に示しＤＬ−α−オキシ酸アミ
ドの０．０５χ水溶液（Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ緩衝液（Ｐ
Ｈ９）　　）の９−２に加え、３０℃で２０分反応させ
た後、濃塩酸にて酸性として反応を停止させた。この反
応液を除菌フィルターを用いて除菌後、高速液体クロマ
トグラフィーにて分析し、生成したα−オキシ酸の立体
化学を標準品と比較し光学収率（Ｌ−α−４オキシ酸／
生成α−オキシ酸）を算出した。

第　　１　　表 実施例２ 下記の組成の培地を使用し、３０℃で４８時間Ｎ−２２
１１菌株の振盪培養を行った。

グリセロール　　　１％ 酵母エキス　　　　ｏ、ｏｓｘ イソブチルアミド　０．５χ ＰＨ７ 以下、実施例１において反応時間を２時間とした以外、
実施例１と同様の操作を行い第２表に示す結果を得た。

第　　２　　表 実施例３ 下記の組成の培地を使用し、３０℃で４８時間Ｎ−７１
３１菌の振盪培養を行った グリセロール　　　１％ 肉エキス　　　　　０．５％ イソブチルアミド　０．５％ ＰＨ７ 以下、原料としてＤＬ−ラクトアミドを（吏用して実施
例２と同様の操作を行った薄吉果、収率（（士込ＤＬ一
体基準）　２０％で光学収率１００％のＬ−乳酸が得ら
れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属また
   はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生
   物が産生するＬ−α−オキシ酸アミド加水分解活性を有
   する酵素の作用により、 一般式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒはアルキル基（炭素数１〜４）、フェニル基
   、アラルキル基または置換基を有するこれらの基を表す
   。〕 で示されるＤＬ−またはＬ−α−オキシ酸アミドから対
   応するＬ−α−オキシ酸を生成せしめること、を特徴と
   する光学活性α−オキシ酸の製造法。