JPS6143999B2 - - Google Patents

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JPS6143999B2
JPS6143999B2 JP58191637A JP19163783A JPS6143999B2 JP S6143999 B2 JPS6143999 B2 JP S6143999B2 JP 58191637 A JP58191637 A JP 58191637A JP 19163783 A JP19163783 A JP 19163783A JP S6143999 B2 JPS6143999 B2 JP S6143999B2
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JP
Japan
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pseudomonas
nitrile hydratase
liter
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Hideaki Yamada
Koichiro Tatsuno
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NITSUTO KAGAKU KOGYO KK
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いシ
ユードモナス（Pseudomonas）属菌体を高収量
で生産する方法に関する。 近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して
種々の単位化学反応や複合化学反応の触媒として
利用しようとする動きが盛んになつてきている。 ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和し
て相当するアミド類を生成させる酵素として、本
発明者の中の山田らにより見出されており
〔Agric.Biol.Chem.46 1165（1982）参照〕、その
具体的利用例としてニトリルヒドラターゼを有す
る細菌を用いてアクリロニトリルからアクリルア
ミドを生成させることが提案されている〔特開昭
58−86093号公報（特願昭56−184688号）、Agric.
Biol.Chem.46 1183（1982）参照〕。 このような場合に、ニトリルヒドラターゼ活性
の高いシユードモナス属菌体が高収率で取得でき
れば、裨益するところは大きい。 このような観点から、本発明者らは既に一つの
提案をなしている〔特開昭59−91879号公報（特
願昭57−199750号）〕。この提案にかかるシユード
モナス属細菌の培養法は、シユードモナス属に属
してニトリルヒドラターゼを産生する能力を有す
る細菌を培養してニトリルヒドラターゼ活性を有
する細菌菌体を製造するに当たり、プロピオニト
リル、イソブチロニトリル、プロピオンアミドお
よびイソブチルアミドの中から選ばれた化合物の
少なくとも一種を逐次的に培地に添加すること、
からなるものである。 発明の概要 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、上記化合物以外の特定のアミド化合物にも同
様な効果が見出されたことに基いて上記と同様の
手段によつてこの目的を達成しようとするもので
ある。 従つて、本発明によるニトリルヒドラターゼ活
性の高いシユードモナス属細菌の培養法は、シユ
ードモナス（Pseudomonas）属に属してニトリ
ルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌を培
養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細
菌菌体を製造するに当り、アクリルアミド、メタ
クリルアミド、クロトンアミドおよびｎ―ブチル
アミドの中から選ばれたアミド化合物の少なくと
も１種を培地に添加すること、を特徴とするもの
である。 効 果 培地にアミド化合物添加してシユードモナス属
細菌の培養を行なうと、単位培養液当りのニトリ
ルヒドラターゼ活性が顕著に増大する。 この単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活
性の増大は、菌体の濃度（すなわち、菌体の収
量）および菌体の活性（すなわち、菌体内のニト
リルヒドラターゼの量）の増大に因るものと解さ
れる。 なお、本発明ではアミド化合物を酵素誘導剤と
呼ぶことがあるが、これは上記の要因のうち特に
後者に着目したものをいうことができる。ただ
し、アミド化合物はこの点においてのみ有効なも
のであるということではない。 発明の具体的説明 シユードモナス属細菌 本発明において使用する細菌は、ニトリルヒド
ラターゼ活性を有し、ニトリル、特にアクリロニ
トリル、を水和して対応アミド、特にアクリルア
ミド、を生成することができるシユードモナス属
の細菌である。具体的には、例えば、前記特開昭
58−86093号公報（特願昭56−184688号明細書）
に記載のシユードモナス・クロロラフイスB23
（Pseudomonas chlororaphis B23）微工研条寄第
187号およびシユードモナスsp.PS1
（Pseudomonas sp.PS1）微工研条寄第188号など
が挙げることができる。これら両菌の詳細は、前
記特開昭58−86093号公報に記載されている。 酵素誘導剤 本発明においては、酵素誘導剤としてアクリル
アミド、メタクリルアミド、クロトンアミドまた
はｎ―ブチルアミドを使用する。これらは、それ
ぞれ単独にまたは併用混合して、使用することが
できる。 本発明によれば、これらは培地に一時にあるい
は逐次的に添加する。「逐次的」とは、連続的ま
たは間歇的いずれをも意味するものである。 培養―本発明の実施 本発明の一般的実施態様は、次の通りである。 すなわち、ニトリルヒドラターゼ活性を有する
シユードモナス属の微生物を炭素源、例えばグル
コース、フラクトース、シユークロース、デキス
トリン、グリセリン、エタノールおよびコハク酸
など、窒素源、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよ
び尿素など、有機栄養源、例えば、酵母エキス、
肉エキス、麦芽エキス、カゼイン分解物およびペ
プトンなど、無機塩、例えばリン酸塩、マグネシ
ウム、カリウム、鉄、その他微量金属、その他、
を適宜含有する培地、特に液体培地、に接種し、
これに酵素誘導剤として前記アミド化合物の中の
少なくとも１種を一時にあるいは逐次的に添加し
ながら好気的条件下に培養を行なう。 これらの酵素誘導剤の培地中の濃度は培養時
間、培養温度などにもよるが、通常好ましくは50
ｇ／リツトル（併用の場合は合計量）未満、より
好ましくは10ｇ／リツトル以下、となるように調
整する。この濃度が50ｇ／リツトル以上となる
と、ニトリルヒドラターゼ活性の低下が認められ
る。培地のpHは６〜９程度、好ましくは７〜８
程度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは25〜
30℃程度、培養時間は１〜３日程度で充分であ
る。 培養終了後の菌体の回収ないし利用、あるいは
ニトリルヒドラターゼの回収ないし利用は、前記
特開昭58−86093号公報に記載されたところ、あ
るいは後記実施例の記載、に従つて行なうことが
できる。 活性向上剤 本発明者らは既に、α―アミノ酸を上記培地に
添加するとニトリルヒドラターゼ活性が向上する
ことを見出している（特願昭58−1997号および同
時提出特許願(1)）。 α―アミノ酸としては天然タンパク構成員とし
て知られているものが適当であり、具体的にはア
ラニン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、
リジン、フエニルアラニン、プロリン、トリプト
フアン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン
酸、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、システ
インおよびシスチンがある。これらはＬ―体、Ｄ
―体およびＬ，Ｄ―体混合物のいずれであつても
よく、またその二種または三種以上を併用するこ
ともできる。 本発明においても、このようなα―アミノ酸を
添加して培養を行なうことによつて、ニトリルヒ
ドラターゼ活性を向上させることができる。 実験例 (1) 菌の培養 下記の前培養条件で生育させた菌（シユードモ
ナス・クロロラフイスB23（微工研条寄第187
号）1.4mlを、下記の本培養条件で培養して、ア
クリルアミド生成活性を調べた。 (1) 前培養条件 MY培地（ペプトン５ｇ／リツトル、酵母エ
キス３ｇ／リツトル、麦芽エキス３ｇ／リツト
ル、グルコース５ｇ／リツトル、pH7.6）、培
養温度28℃、培養時間18時間、500ml坂口フラ
スコ（実容量50ml）使用。 (2) 本培養条件 培地（シユクロース10ｇ／リツトル、
KH2PO40.5ｇ／リツトル、K2HPO40.5ｇ／リツ
トル、MgSO4・7H2O0.5ｇ／リツトル、
FeSO4・7H2O20mg／リツトル、Ｌ―システイ
ン２ｇ／リツトル、Ｌ―グルタミン酸、２ｇ／
リツトル、Ｌ―プロリン２ｇ／リツトル、アミ
ド化合物５ｇ／リツトル）、pH7.6 培養温度
25℃、500ml坂口フラスコ（実容量70ml）使
用。 (2) ヒドラターゼ活性の測定 アクリロニトリル水和によるアクリルアミド生
成のヒドラターゼ活性は、培養液１mlと1/10Ｍリ
ン酸緩衝液（pH7.0）４mlとを混合し、これにさ
らに5.0重量％のアクリロニトリルを含む1/10Ｍ
リン酸緩衝液（pH7.0）５mlを加えて、10℃で10
分間反応させ、菌体を別してから、ガスクロマ
トグラフイーでアクリルアミド（AA）を定量す
ることによつて行なつた。 活性は、比活性（SA）および全活性（TA）に
ついて調べた。これらは、下記の通りに定義され
る。 SA：μモルAA/mg―菌体／分 TA：μモルAA/ml―培地／分 結果は、第１表に示す通りであつた。 【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス（Pseudomonas）属に属し
    てニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する
    細菌を培養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を
    有する細菌菌体を製造するに当り、アクリルアミ
    ド、メタクリルアミド、クロトンアミドおよびｎ
    ―ブチルアミドの中から選ばれたアミド化合物の
    少なくとも１種を培地に添加することを特徴とす
    る、シユードモナス属細菌の培養法。 ２ 培地中のアミド化合物の濃度を50ｇ／リツト
    ル未満とする、特許請求の範囲第１項記載の培養
    法。 ３ シユードモナス属に属してニトリルヒドラタ
    ーゼを産生する能力を有する細菌がシユードモナ
    ス・クロロラフイスB23（Pseudomonas
    chlororaphis B23）微工研条寄第187号またはシ
    ユードモナスsp.PS1（Pseudomonas sp.PS1）微
    工研条寄第188号である、特許請求の範囲第１項
    または第２項記載の培養法。
JP58191637A 1983-10-13 1983-10-13 シユ−ドモナス属細菌の培養法 Granted JPS6083581A (ja)

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