JPH0582199B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はL−フエニルアラニンの製造方法に関
し、詳しくはフエニルピルビン酸またはその塩と
アミノ基供与体とからL−フエニルアラニンを生
成する能力を有するノカルデイア(Nocardia)
属に属する放線菌を、水素ガス雰囲気下において
フエニルピルビン酸またはその塩とアミノ基供与
体とを含む水溶液に作用させることによつてL−
フエニルアラニンを製造する方法に関する。 本発明の方法によつて得られるL−フエニルア
ラニンは必須アミノ酸の一種として栄養上または
医薬用途上重要な物質であり、また人工甘味料と
して利用されるα−L−アスパルチル−L−フエ
ニルアラニンメチルエステル(アスパルテーム)
の合成原料としても有用な物質である。 〔従来の技術〕 従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用
いてフエニルピルビン酸またはその塩とアミノ基
供与体とからL−フエニルアラニンを製造する方
法として、例えば(1)アルカリゲネス属、シユウド
モナス属などに属する細菌を栄養培地で培養して
得られる菌体培養液、これより分離した生菌体も
しくはその乾燥菌体またはアスペルギルス属、ペ
ニシリウム属などに属するかびの培養液から得ら
れるフエニルピルビン酸トランスアミナーゼをフ
エニルピルビン酸とL−アスパラギン酸、L−グ
ルタミン酸などのアミノ基供与体との混合物に作
用させることによりL−フエニルアラニンを製造
する方法(特公昭37−10672号公報および特公昭
45−20556号公報参照)、(2)L−グルタミン酸とフ
エニルピルビン酸とから酵素的にアミノ基転移反
応によつてL−フエニルアラニンを製造する際に
ハイドロゲナーゼ、L−グルタミン酸脱水素酵素
およびアミノ基転移酵素の各々の酵素活性を有す
るエシエリヒア属、プロテウス属、クロストリジ
ウム属などに属する細菌の生菌体、菌体破砕物ま
たは抽出液を用いて窒素源の存在下かつ水素ガス
雰囲気でL−グルタミン酸の生成反応とアミノ基
転移反応とをL−グルタミン酸を仲介として基質
共軛的に行わしめる方法(特公昭39−5011号公報
および特公昭40−1995号公報参照)、(3)デヒドロ
ゲナーゼおよびトランスアミナーゼを生産するエ
シエリシア属、エンテロバクター属などに属する
細菌の培養物を用いて、フエニルピルビン酸とア
ンモニアとを、前記細菌の培養物により代謝され
て還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフエート、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドなどの補酵素を与えるグルコースな
どの炭素源の存在下に反応させることによるL−
フエニルアラニンの製造方法(特開昭60−91992
号公報参照)、(4)ブレビバクテリウム
(Brevibacterium)種DSM2448菌株から得られ
るL−フエニルアラニンデヒドロゲナーゼを用い
てフエニルピルビン酸と塩化アンモニウムなどの
アンモニウムイオンとをニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの存在下で作用させることにより
L−フエニルアラニンを製造する方法(特開昭59
−198972号公報参照)などが知られている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 フエニルピルビン酸とアミノ基供与体とからL
−フエニルアラニンを製造する際に利用できる微
生物菌体または微生物起源の酵素として具体的に
知られているのは上述のとおり細菌菌体または細
菌起源もしくはかび起源の酵素に限られていた。
L−フエニルアラニンを製造する際に利用する微
生物をより広い範囲の微生物の中から選択しうる
ことは望ましいことである。 本発明者らのうちの1人を含む数人はかかる観
点から先にフエニルピルビン酸とアミノ基供与体
とからL−フエニルアラニンを生成する能力を有
するノカルデイア(Nocardia)属に属する放線
菌をフエニルピルビン酸とアミノ基供与体とを含
む水溶液に作用させることによりL−フエニルア
ラニンを製造する方法を見出した(特願昭59−
178966号明細書、特開昭61−56088号公報参照)。
この方法によればフエニルピルビン酸と種々のア
ミノ基供与体とから好収量でかつ容易にL−フエ
ニルアラニンを製造することが可能であるが、さ
らに効率的にL−フエニルアラニンを製造するこ
とができればより好ましい。 しかして、本発明の目的は、フエニルピルビン
酸またはその塩とアミノ基供与体とからL−フエ
ニルアラニンを生成する能力を有するノカルデイ
ア属に属する放線菌を用いてフエニルピルビン酸
またはその塩とアミノ基供与体とから直接L−フ
エニルアラニンを効率的に製造する方法を提供す
ることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、フエニルピル
ビン酸またはその塩とアミノ基供与体とからL−
フエニルアラニンを生成する能力を有するノカル
デイア(Nocardia)属に属する放線菌を、水素
ガス雰囲気下においてフエニルピルビン酸または
その塩とアンモニウム塩およびアンモニアからな
る群から選ばれるアミノ基供与体とを含む水溶液
に作用させることを特徴とするL−フエニルアラ
ニンの製造方法を提供することによつて達成され
る。 本発明の方法におけるフエニルピルビン酸また
はその塩とアミノ基供与体とからL−フエニルア
ラニンを生成する能力を有するノカルデイア
(Nocardia)属に属する放線菌としては、例えば
ノカルデイア・オパカ(Nocardia opaca)C−
8−5菌株(微工研条寄第1119号)、ノカルデイ
ア・コエリアカ(Nocardia coeliaca)C−7−
5菌株(微工研条寄第1117号)およびノカルデイ
ア・エリスロポリス(Nocardia erythropolis)
C−6−2菌株(微工研条寄第1118号)があり、
それぞれの菌学的性質を列挙すると次表のとおり
である。
し、詳しくはフエニルピルビン酸またはその塩と
アミノ基供与体とからL−フエニルアラニンを生
成する能力を有するノカルデイア(Nocardia)
属に属する放線菌を、水素ガス雰囲気下において
フエニルピルビン酸またはその塩とアミノ基供与
体とを含む水溶液に作用させることによつてL−
フエニルアラニンを製造する方法に関する。 本発明の方法によつて得られるL−フエニルア
ラニンは必須アミノ酸の一種として栄養上または
医薬用途上重要な物質であり、また人工甘味料と
して利用されるα−L−アスパルチル−L−フエ
ニルアラニンメチルエステル(アスパルテーム)
の合成原料としても有用な物質である。 〔従来の技術〕 従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用
いてフエニルピルビン酸またはその塩とアミノ基
供与体とからL−フエニルアラニンを製造する方
法として、例えば(1)アルカリゲネス属、シユウド
モナス属などに属する細菌を栄養培地で培養して
得られる菌体培養液、これより分離した生菌体も
しくはその乾燥菌体またはアスペルギルス属、ペ
ニシリウム属などに属するかびの培養液から得ら
れるフエニルピルビン酸トランスアミナーゼをフ
エニルピルビン酸とL−アスパラギン酸、L−グ
ルタミン酸などのアミノ基供与体との混合物に作
用させることによりL−フエニルアラニンを製造
する方法(特公昭37−10672号公報および特公昭
45−20556号公報参照)、(2)L−グルタミン酸とフ
エニルピルビン酸とから酵素的にアミノ基転移反
応によつてL−フエニルアラニンを製造する際に
ハイドロゲナーゼ、L−グルタミン酸脱水素酵素
およびアミノ基転移酵素の各々の酵素活性を有す
るエシエリヒア属、プロテウス属、クロストリジ
ウム属などに属する細菌の生菌体、菌体破砕物ま
たは抽出液を用いて窒素源の存在下かつ水素ガス
雰囲気でL−グルタミン酸の生成反応とアミノ基
転移反応とをL−グルタミン酸を仲介として基質
共軛的に行わしめる方法(特公昭39−5011号公報
および特公昭40−1995号公報参照)、(3)デヒドロ
ゲナーゼおよびトランスアミナーゼを生産するエ
シエリシア属、エンテロバクター属などに属する
細菌の培養物を用いて、フエニルピルビン酸とア
ンモニアとを、前記細菌の培養物により代謝され
て還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフエート、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドなどの補酵素を与えるグルコースな
どの炭素源の存在下に反応させることによるL−
フエニルアラニンの製造方法(特開昭60−91992
号公報参照)、(4)ブレビバクテリウム
(Brevibacterium)種DSM2448菌株から得られ
るL−フエニルアラニンデヒドロゲナーゼを用い
てフエニルピルビン酸と塩化アンモニウムなどの
アンモニウムイオンとをニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの存在下で作用させることにより
L−フエニルアラニンを製造する方法(特開昭59
−198972号公報参照)などが知られている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 フエニルピルビン酸とアミノ基供与体とからL
−フエニルアラニンを製造する際に利用できる微
生物菌体または微生物起源の酵素として具体的に
知られているのは上述のとおり細菌菌体または細
菌起源もしくはかび起源の酵素に限られていた。
L−フエニルアラニンを製造する際に利用する微
生物をより広い範囲の微生物の中から選択しうる
ことは望ましいことである。 本発明者らのうちの1人を含む数人はかかる観
点から先にフエニルピルビン酸とアミノ基供与体
とからL−フエニルアラニンを生成する能力を有
するノカルデイア(Nocardia)属に属する放線
菌をフエニルピルビン酸とアミノ基供与体とを含
む水溶液に作用させることによりL−フエニルア
ラニンを製造する方法を見出した(特願昭59−
178966号明細書、特開昭61−56088号公報参照)。
この方法によればフエニルピルビン酸と種々のア
ミノ基供与体とから好収量でかつ容易にL−フエ
ニルアラニンを製造することが可能であるが、さ
らに効率的にL−フエニルアラニンを製造するこ
とができればより好ましい。 しかして、本発明の目的は、フエニルピルビン
酸またはその塩とアミノ基供与体とからL−フエ
ニルアラニンを生成する能力を有するノカルデイ
ア属に属する放線菌を用いてフエニルピルビン酸
またはその塩とアミノ基供与体とから直接L−フ
エニルアラニンを効率的に製造する方法を提供す
ることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、フエニルピル
ビン酸またはその塩とアミノ基供与体とからL−
フエニルアラニンを生成する能力を有するノカル
デイア(Nocardia)属に属する放線菌を、水素
ガス雰囲気下においてフエニルピルビン酸または
その塩とアンモニウム塩およびアンモニアからな
る群から選ばれるアミノ基供与体とを含む水溶液
に作用させることを特徴とするL−フエニルアラ
ニンの製造方法を提供することによつて達成され
る。 本発明の方法におけるフエニルピルビン酸また
はその塩とアミノ基供与体とからL−フエニルア
ラニンを生成する能力を有するノカルデイア
(Nocardia)属に属する放線菌としては、例えば
ノカルデイア・オパカ(Nocardia opaca)C−
8−5菌株(微工研条寄第1119号)、ノカルデイ
ア・コエリアカ(Nocardia coeliaca)C−7−
5菌株(微工研条寄第1117号)およびノカルデイ
ア・エリスロポリス(Nocardia erythropolis)
C−6−2菌株(微工研条寄第1118号)があり、
それぞれの菌学的性質を列挙すると次表のとおり
である。
【表】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。 実施例 1 肉エキス1.0g、ペプトン1.0g、食塩0.5gおよ
びL−フエニルアラニン0.3gを純水に溶解した
のち1規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えるこ
とによりPHを7.2に調整し、さらに純水を加える
ことにより容積を100mlとした。このようにして
得られた培地(以下、これを培地1と称する)
100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で10
分間、蒸気殺菌を行つた。培地1と同じ培地に寒
天を加えて調製した寒天斜面培地で増殖させたノ
カルデイア・オパカC−8−5菌株の1白金耳
を、上記の500ml容坂口フラスコ中の培地1に植
菌し、34℃で10時間培養した。培養後、培養液か
ら菌体を遠心分離し、濃度0.05モル/のトリス
−塩酸緩衝液で洗滌した。 上記のようにして得られたノカルデイア・オパ
カC−8−5菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
1.5g)を濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝
液(PH7.8)40mlに懸濁した。この菌体懸濁液を
濃度4重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液40ml
と混合したのち、この混合液を濃度0.5モル/
の塩化カルシウム水溶液中に滴下することによつ
てビーズ型(直径約3mm)に成型した。得られた
ノカルデイア・オパカC−8−5菌株の菌体を固
定化したビーズ0.7cm3(含有される菌体は乾燥菌
体に換算して12mg)を培地1と同じ培地10ml中に
37℃で36時間浸漬させたのち、濃度0.05モル/
のトリス−塩酸緩衝液(PH7.8)で洗滌した。 濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝液(PH
7.8)にフエニルピルビン酸を10ミリモル/の
濃度となるように加え、ついで塩化アンモニウム
を0.2モル/の濃度になるように加えて混合し、
得られた溶液10mlと上記で得られたビーズとを内
容50mlのステンレス製高圧反応器中に仕込み、反
応器内部の雰囲気を水素ガスで置換したのち、水
素ガスで100気圧(絶対圧)に加圧した。水素ガ
スの圧力を100気圧(絶対圧)に維持し、反応温
度を37℃に維持しながら10時間反応を行つた。反
応終了後、反応液をバイオアツセイ法で分析する
とともに高速液体クロマトグラフイーで分析した
結果、フエニルピルビン酸が1.4mg残存し、L−
フエニルアラニンが12.8mg生成していることが判
明した。L−フエニルアラニンの生成速度は10.8
マイクロモル/分/g(乾燥菌体)であつた。L
−フエニルアラニンの収率は使用したフエニルピ
ルビン酸基準で78%であり、またL−フエニルア
ラニンへの選択率は85%であつた。 実施例 2 実施例1におけると同様な操作を行うことによ
つてL−フエニルアラニンを生成させた(1回目
の反応)。反応後、菌体を含有するビーズを回収
し、これを培地1と同じ培地10ml中に37℃で14時
間浸漬させたのち、濃度0.05モル/のトリス−
塩酸緩衝液(PH7.8)で洗滌した。実施例1にお
いてこのように回収し処理して得られたビーズを
使用する以外は同様の操作を行うことによりL−
フエニルアラニンを生成させた(2回目の反応)。
反応後、前記と同様にして回収し処理して得られ
たビーズを同様の反応に付するという操作を繰返
すことによつてそれぞれL−フエニルアラニンを
生成させた(3回目以降の反応)。各反応におい
て得られた結果を第1表に示す。
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。 実施例 1 肉エキス1.0g、ペプトン1.0g、食塩0.5gおよ
びL−フエニルアラニン0.3gを純水に溶解した
のち1規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えるこ
とによりPHを7.2に調整し、さらに純水を加える
ことにより容積を100mlとした。このようにして
得られた培地(以下、これを培地1と称する)
100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で10
分間、蒸気殺菌を行つた。培地1と同じ培地に寒
天を加えて調製した寒天斜面培地で増殖させたノ
カルデイア・オパカC−8−5菌株の1白金耳
を、上記の500ml容坂口フラスコ中の培地1に植
菌し、34℃で10時間培養した。培養後、培養液か
ら菌体を遠心分離し、濃度0.05モル/のトリス
−塩酸緩衝液で洗滌した。 上記のようにして得られたノカルデイア・オパ
カC−8−5菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
1.5g)を濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝
液(PH7.8)40mlに懸濁した。この菌体懸濁液を
濃度4重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液40ml
と混合したのち、この混合液を濃度0.5モル/
の塩化カルシウム水溶液中に滴下することによつ
てビーズ型(直径約3mm)に成型した。得られた
ノカルデイア・オパカC−8−5菌株の菌体を固
定化したビーズ0.7cm3(含有される菌体は乾燥菌
体に換算して12mg)を培地1と同じ培地10ml中に
37℃で36時間浸漬させたのち、濃度0.05モル/
のトリス−塩酸緩衝液(PH7.8)で洗滌した。 濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝液(PH
7.8)にフエニルピルビン酸を10ミリモル/の
濃度となるように加え、ついで塩化アンモニウム
を0.2モル/の濃度になるように加えて混合し、
得られた溶液10mlと上記で得られたビーズとを内
容50mlのステンレス製高圧反応器中に仕込み、反
応器内部の雰囲気を水素ガスで置換したのち、水
素ガスで100気圧(絶対圧)に加圧した。水素ガ
スの圧力を100気圧(絶対圧)に維持し、反応温
度を37℃に維持しながら10時間反応を行つた。反
応終了後、反応液をバイオアツセイ法で分析する
とともに高速液体クロマトグラフイーで分析した
結果、フエニルピルビン酸が1.4mg残存し、L−
フエニルアラニンが12.8mg生成していることが判
明した。L−フエニルアラニンの生成速度は10.8
マイクロモル/分/g(乾燥菌体)であつた。L
−フエニルアラニンの収率は使用したフエニルピ
ルビン酸基準で78%であり、またL−フエニルア
ラニンへの選択率は85%であつた。 実施例 2 実施例1におけると同様な操作を行うことによ
つてL−フエニルアラニンを生成させた(1回目
の反応)。反応後、菌体を含有するビーズを回収
し、これを培地1と同じ培地10ml中に37℃で14時
間浸漬させたのち、濃度0.05モル/のトリス−
塩酸緩衝液(PH7.8)で洗滌した。実施例1にお
いてこのように回収し処理して得られたビーズを
使用する以外は同様の操作を行うことによりL−
フエニルアラニンを生成させた(2回目の反応)。
反応後、前記と同様にして回収し処理して得られ
たビーズを同様の反応に付するという操作を繰返
すことによつてそれぞれL−フエニルアラニンを
生成させた(3回目以降の反応)。各反応におい
て得られた結果を第1表に示す。
【表】
実施例 3
実施例2において各反応後、回収されたビーズ
を濃度0.1モル/のトリス−塩酸緩衝液(PH
8.0)にL−フエニルアラニンを0.3重量%の濃度
となるように含有させて得られた水溶液10ml中に
37℃で14時間浸漬させる以外は同様の操作を行つ
た。得られた結果を第2表に示す。
を濃度0.1モル/のトリス−塩酸緩衝液(PH
8.0)にL−フエニルアラニンを0.3重量%の濃度
となるように含有させて得られた水溶液10ml中に
37℃で14時間浸漬させる以外は同様の操作を行つ
た。得られた結果を第2表に示す。
【表】
【表】
実施例 4
実施例1におけると同様な操作を行うことによ
つてL−フエニルアラニンを生成させた(1回目
の反応)。反応後、菌体を含有するビーズを回収
し、これを濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝
液(PH7.8)で洗滌した。実施例1においてこの
ように回収し処理して得られたビーズを使用する
以外は同様な操作を行うことによりL−フエニル
アラニンを生成させた(2回目の反応)。各反応
において得られた結果を第3表に示す。
つてL−フエニルアラニンを生成させた(1回目
の反応)。反応後、菌体を含有するビーズを回収
し、これを濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝
液(PH7.8)で洗滌した。実施例1においてこの
ように回収し処理して得られたビーズを使用する
以外は同様な操作を行うことによりL−フエニル
アラニンを生成させた(2回目の反応)。各反応
において得られた結果を第3表に示す。
【表】
実施例 5
実施例1において5.3mgのNADHを反応系に添
加し、かつ反応時間を5時間とする以外は同様の
操作を行つた。得られた反応液中にはフエニルピ
ルビン酸が9.0mg、L−フエニルアラニンが6.9mg
それぞれ含まれていた。L−フエニルアラニンの
生成速度は11.7マイクロモル/分/g(乾燥菌
体)であつた。L−フエニルアラニンの収率は使
用したフエニルピルビン酸基準で42%であり、ま
たL−フエニルアラニンへの選択率は93%であつ
た。 実施例 6 実施例1において、ノカルデイア・オパカC−
8−5菌株の菌体を固定化して得られたビーズ
1.5cm3(含有される菌体は乾燥菌体に換算して25
mg)を培地1中に浸漬することなくそのまま反応
に使用し、かつ反応系の水溶液中での塩化アンモ
ニウムの初期濃度を0.2モル/から0.5モル/
に変更する以外は同様の操作を行つた。得られた
反応液中にはフエニルピルビン酸が2.8mg、L−
フエニルアラニンが10.9mgそれぞれ含まれてい
た。L−フエニルアラニンの生成速度は4.4マイ
クロモル/分/g(乾燥菌体)であつた。L−フ
エニルアラニンの収率は使用したフエニルピルビ
ン酸基準で66%であり、またL−フエニルアラニ
ンへの選択率は80%であつた。 実施例 7 肉エキス0.5g、ペプトン0.5g、食塩0.5gおよ
びフエニルピルビン酸0.3gを純水に溶解したの
ち1規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えること
によりPHを7.2に調整し、さらに純水を加えるこ
とにより容積を100mlとした。このようにして得
られた培地50mlを500ml容坂口フラスコに入れ110
℃で10分間、蒸気殺菌を行つたのち、ノカルデイ
ア・オパカC−8−5菌株を植菌し、34℃で15時
間培養した。培養後、培養液から菌体を遠心分離
し、生理食塩水で洗滌した。 上記のようにして得られたノカルデイア・オパ
カC−8−5菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
1.5g)を濃度0.2モル/のトリス−塩酸緩衝液
(PH7.8)50mlに懸濁した。この菌体懸濁液を濃度
4重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液50mlと混
合したのち、この混合液を濃度0.1モル/の塩
化カルシウム水溶液中に滴下することによつてビ
ーズ型(直径約3mm)に成型した。得られたノカ
ルデイア・オパカC−8−5菌株の菌体を固定化
したビーズ1.5cm3(含有される菌体は乾燥菌体に
換算して30mg)、濃度0.1モル/のフエニルピル
ビン酸水溶液0.5ml、濃度1モル/の塩化アン
モニウム水溶液1ml、NAD0.66mgおよび濃度0.2
モル/のトリス−塩酸緩衝液(PH7.8)3.5mlを
内容25mlのステンレス製高圧反応器中に仕込み、
反応器内部の雰囲気を水素ガスで置換したのち、
水素ガスで100気圧(絶対圧)に加圧した。水素
ガスの圧力を100気圧(絶対圧)に維持し、反応
温度を37℃に維持しながら10時間反応を行つた。
L−フエニルアラニンの生成量は1.6mgであつた。
L−フエニルアラニンの生成速度は0.55マイクロ
モル/分/g(乾燥菌体)であり、またL−フエ
ニルアラニンの収率は使用したフエニルピルビン
酸基準で19%であつた。 実施例 8 実施例7においてNADを反応系に添加しない
以外は実施例7と同様にして菌の培養、菌体の固
定化および反応を行つた。L−フエニルアラニン
の生成量は1.1mgであつた。L−フエニルアラニ
ンの生成速度は0.36マイクロモル/分/g(乾燥
菌体)であり、またL−フエニルアラニンの収率
は使用したフエニルピルビン酸基準で13%であつ
た。 実施例 9 実施例7においてNAD0.66mgの代りに
NADH0.66mgを用いる以外は実施例7と同様に
して菌の培養、菌体の固定化および反応を行つ
た。L−フエニルアラニンの生成量は1.8mgであ
つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.60マ
イクロモル/分/g(乾燥菌体)であり、またL
−フエニルアラニンの収率は使用したフエニルピ
ルビン酸基準で22%であつた。 実施例 10 実施例7においてノカルデイア・オパカC−8
−5菌株の代りににノカルデイア・コエリアカC
−7−5菌株を用いる以外は実施例7と同様にし
て菌の培養、菌体の固定化および反応を行つた。
L−フエニルアラニンの生成量は1.2mgであつた。
L−フエニルアラニンの生成速度は0.40マイクロ
モル/分/g(乾燥菌体)であり、またL−フエ
ニルアラニンの収率は使用したフエニルピルビン
酸基準で15%であつた。 実施例 11 実施例7においてノカルデイア・オパカC−8
−5菌株の代りにノカルデイア・エリスロポリス
C−6−2菌株を用いる以外は実施例7と同様に
して菌の培養、菌体の固定化および反応を行つ
た。L−フエニルアラニンの生成量は1.4mgであ
つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.48マ
イクロモル/分/g(乾燥菌体)であり、またL
−フエニルアラニンの収率は使用したフエニルピ
ルビン酸基準で17%であつた。 実施例 12 実施例8において培養して得られた菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)を固定化することなく反応
に使用する以外は実施例8と同様にして菌の培養
および反応を行つた。L−フエニルアラニンの生
成量は2.4mgであつた。L−フエニルアラニンの
生成速度は0.80マイクロモル/分/g(乾燥菌
体)であり、またL−フエニルアラニンの収率は
使用したフエニルピルビン酸基準で29%であつ
た。 実施例 13 実施例7と同様に培養して得られた菌体(乾燥
菌体に換算して1.5g)を濃度0.1モル/のリン
酸緩衝液(PH7.8)50mlに懸濁させた。この菌体
懸濁液を濃度4重量%の寒天水溶液50mlと混合し
たのち0℃に冷却して凝固させ、それを小片(1
辺の長さが約5mmの立方体)に切断し、濃度0.1
モル/のリン酸緩衝液(PH7.8)中で保存した。 上記のようにして得られた固定化菌体を用いる
以外は実施例8と同様にして反応を行つた。L−
フエニルアラニンの生成量は1.0mgであつた。L
−フエニルアラニンの生成速度は0.35マイクロモ
ル/分/g(乾燥菌体)であり、またL−フエニ
ルアラニンの収率は使用したフエニルピルビン酸
基準で12%であつた。 実施例 14〜16 実施例8において濃度1モル/の塩化アンモ
ニウム水溶液1mlの代りに濃度1モル/(実施
例15のみ0.5モル/)の第4表に示すアミノ基
供与体の水溶液1mlを反応液に加える以外は実施
例8と同様にして菌の培養、菌体の固定化および
反応を行つた。結果を第4表に示す。
加し、かつ反応時間を5時間とする以外は同様の
操作を行つた。得られた反応液中にはフエニルピ
ルビン酸が9.0mg、L−フエニルアラニンが6.9mg
それぞれ含まれていた。L−フエニルアラニンの
生成速度は11.7マイクロモル/分/g(乾燥菌
体)であつた。L−フエニルアラニンの収率は使
用したフエニルピルビン酸基準で42%であり、ま
たL−フエニルアラニンへの選択率は93%であつ
た。 実施例 6 実施例1において、ノカルデイア・オパカC−
8−5菌株の菌体を固定化して得られたビーズ
1.5cm3(含有される菌体は乾燥菌体に換算して25
mg)を培地1中に浸漬することなくそのまま反応
に使用し、かつ反応系の水溶液中での塩化アンモ
ニウムの初期濃度を0.2モル/から0.5モル/
に変更する以外は同様の操作を行つた。得られた
反応液中にはフエニルピルビン酸が2.8mg、L−
フエニルアラニンが10.9mgそれぞれ含まれてい
た。L−フエニルアラニンの生成速度は4.4マイ
クロモル/分/g(乾燥菌体)であつた。L−フ
エニルアラニンの収率は使用したフエニルピルビ
ン酸基準で66%であり、またL−フエニルアラニ
ンへの選択率は80%であつた。 実施例 7 肉エキス0.5g、ペプトン0.5g、食塩0.5gおよ
びフエニルピルビン酸0.3gを純水に溶解したの
ち1規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えること
によりPHを7.2に調整し、さらに純水を加えるこ
とにより容積を100mlとした。このようにして得
られた培地50mlを500ml容坂口フラスコに入れ110
℃で10分間、蒸気殺菌を行つたのち、ノカルデイ
ア・オパカC−8−5菌株を植菌し、34℃で15時
間培養した。培養後、培養液から菌体を遠心分離
し、生理食塩水で洗滌した。 上記のようにして得られたノカルデイア・オパ
カC−8−5菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
1.5g)を濃度0.2モル/のトリス−塩酸緩衝液
(PH7.8)50mlに懸濁した。この菌体懸濁液を濃度
4重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液50mlと混
合したのち、この混合液を濃度0.1モル/の塩
化カルシウム水溶液中に滴下することによつてビ
ーズ型(直径約3mm)に成型した。得られたノカ
ルデイア・オパカC−8−5菌株の菌体を固定化
したビーズ1.5cm3(含有される菌体は乾燥菌体に
換算して30mg)、濃度0.1モル/のフエニルピル
ビン酸水溶液0.5ml、濃度1モル/の塩化アン
モニウム水溶液1ml、NAD0.66mgおよび濃度0.2
モル/のトリス−塩酸緩衝液(PH7.8)3.5mlを
内容25mlのステンレス製高圧反応器中に仕込み、
反応器内部の雰囲気を水素ガスで置換したのち、
水素ガスで100気圧(絶対圧)に加圧した。水素
ガスの圧力を100気圧(絶対圧)に維持し、反応
温度を37℃に維持しながら10時間反応を行つた。
L−フエニルアラニンの生成量は1.6mgであつた。
L−フエニルアラニンの生成速度は0.55マイクロ
モル/分/g(乾燥菌体)であり、またL−フエ
ニルアラニンの収率は使用したフエニルピルビン
酸基準で19%であつた。 実施例 8 実施例7においてNADを反応系に添加しない
以外は実施例7と同様にして菌の培養、菌体の固
定化および反応を行つた。L−フエニルアラニン
の生成量は1.1mgであつた。L−フエニルアラニ
ンの生成速度は0.36マイクロモル/分/g(乾燥
菌体)であり、またL−フエニルアラニンの収率
は使用したフエニルピルビン酸基準で13%であつ
た。 実施例 9 実施例7においてNAD0.66mgの代りに
NADH0.66mgを用いる以外は実施例7と同様に
して菌の培養、菌体の固定化および反応を行つ
た。L−フエニルアラニンの生成量は1.8mgであ
つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.60マ
イクロモル/分/g(乾燥菌体)であり、またL
−フエニルアラニンの収率は使用したフエニルピ
ルビン酸基準で22%であつた。 実施例 10 実施例7においてノカルデイア・オパカC−8
−5菌株の代りににノカルデイア・コエリアカC
−7−5菌株を用いる以外は実施例7と同様にし
て菌の培養、菌体の固定化および反応を行つた。
L−フエニルアラニンの生成量は1.2mgであつた。
L−フエニルアラニンの生成速度は0.40マイクロ
モル/分/g(乾燥菌体)であり、またL−フエ
ニルアラニンの収率は使用したフエニルピルビン
酸基準で15%であつた。 実施例 11 実施例7においてノカルデイア・オパカC−8
−5菌株の代りにノカルデイア・エリスロポリス
C−6−2菌株を用いる以外は実施例7と同様に
して菌の培養、菌体の固定化および反応を行つ
た。L−フエニルアラニンの生成量は1.4mgであ
つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.48マ
イクロモル/分/g(乾燥菌体)であり、またL
−フエニルアラニンの収率は使用したフエニルピ
ルビン酸基準で17%であつた。 実施例 12 実施例8において培養して得られた菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)を固定化することなく反応
に使用する以外は実施例8と同様にして菌の培養
および反応を行つた。L−フエニルアラニンの生
成量は2.4mgであつた。L−フエニルアラニンの
生成速度は0.80マイクロモル/分/g(乾燥菌
体)であり、またL−フエニルアラニンの収率は
使用したフエニルピルビン酸基準で29%であつ
た。 実施例 13 実施例7と同様に培養して得られた菌体(乾燥
菌体に換算して1.5g)を濃度0.1モル/のリン
酸緩衝液(PH7.8)50mlに懸濁させた。この菌体
懸濁液を濃度4重量%の寒天水溶液50mlと混合し
たのち0℃に冷却して凝固させ、それを小片(1
辺の長さが約5mmの立方体)に切断し、濃度0.1
モル/のリン酸緩衝液(PH7.8)中で保存した。 上記のようにして得られた固定化菌体を用いる
以外は実施例8と同様にして反応を行つた。L−
フエニルアラニンの生成量は1.0mgであつた。L
−フエニルアラニンの生成速度は0.35マイクロモ
ル/分/g(乾燥菌体)であり、またL−フエニ
ルアラニンの収率は使用したフエニルピルビン酸
基準で12%であつた。 実施例 14〜16 実施例8において濃度1モル/の塩化アンモ
ニウム水溶液1mlの代りに濃度1モル/(実施
例15のみ0.5モル/)の第4表に示すアミノ基
供与体の水溶液1mlを反応液に加える以外は実施
例8と同様にして菌の培養、菌体の固定化および
反応を行つた。結果を第4表に示す。
【表】
実施例17および18
実施例8において1気圧(絶対圧)または50気
圧(絶対圧)の水素ガスの圧力下で7時間反応さ
せる以外は実施例8と同様にして、菌の培養、菌
体の固定化および反応を行つた。結果を第5表に
示す。
圧(絶対圧)の水素ガスの圧力下で7時間反応さ
せる以外は実施例8と同様にして、菌の培養、菌
体の固定化および反応を行つた。結果を第5表に
示す。
本発明によれば、上記の実施例から明らかなと
おり、フエニルピルビン酸またはその塩とアンモ
ニウム塩およびアンモニアからなる群から選ばれ
るアミノ基供与体とから高い生成速度かつ好収量
でしかも容易にL−フエニルアラニンを製造する
ことができる。
おり、フエニルピルビン酸またはその塩とアンモ
ニウム塩およびアンモニアからなる群から選ばれ
るアミノ基供与体とから高い生成速度かつ好収量
でしかも容易にL−フエニルアラニンを製造する
ことができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 フエニルピルビン酸またはその塩とアミノ基
供与体とからL−フエニルアラニンを生成する能
力を有するノカルデイア(Nocardia)属に属す
る放線菌を、水素ガス雰囲気下においてフエニル
ピルビン酸またはその塩とアンモニウム塩および
アンモニアからなる群から選ばれるアミノ基供与
体とを含む水溶液に作用させることを特徴とする
L−フエニルアラニンの製造方法。 2 水素ガスの分圧が0.5気圧(絶対圧)以上で
ある特許請求の範囲第1項記載の製造方法。 3 放線菌がノカルデイア属オパカ(opaca)種
に属する放線菌である特許請求の範囲第1項記載
の製造方法。 4 放線菌がノカルデイア属コエリアカ
(coeliaca)種に属する放線菌である特許請求の
範囲第1項記載の製造方法。 5 放線菌がノカルデイア属エリスロポリス
(erythropolis)種に属する放線菌である特許請
求の範囲第1項記載の製造方法。 6 放線菌が担体に固定化されたものである特許
請求の範囲第1項記載の製造方法。 7 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよ
びその還元型からなる群から選ばれる少なくとも
一種の補酵素を水溶液に添加する特許請求の範囲
第1項記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19991385 | 1985-09-09 | ||
JP60-199913 | 1985-09-09 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62151191A JPS62151191A (ja) | 1987-07-06 |
JPH0582199B2 true JPH0582199B2 (ja) | 1993-11-17 |
Family
ID=16415685
Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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---|---|
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EP (1) | EP0215414B1 (ja) |
JP (1) | JPS62151191A (ja) |
DE (1) | DE3682555D1 (ja) |
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GB9321764D0 (en) * | 1993-10-21 | 1993-12-15 | Health Lab Service Board | Phenylalanine dehydrogenase production |
Family Cites Families (11)
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US3183170A (en) * | 1961-10-03 | 1965-05-11 | Sanraku Ocean Kabushiki Kaisha | Method of l-amino acid manufacture |
CH563344A5 (ja) * | 1970-09-30 | 1975-06-30 | Nisshin Flour Milling Co | |
FR2217296A1 (en) * | 1972-10-10 | 1974-09-06 | Inst Francais Du Petrole | Organic cpds. prepn. by co-enzymatic reduction - with continuous regeneration of the oxidised coenzyme with a reducing agent |
GB2084155B (en) * | 1980-09-17 | 1984-01-11 | Grace W R & Co | Process for production of l-amino acids using immobilized microorganisms |
DE3226888A1 (de) * | 1982-07-17 | 1984-01-19 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Verfahren zur durchfuehrung elektromikrobieller reduktionen |
DE3307095A1 (de) * | 1983-03-01 | 1984-09-06 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Mikrobiologisch hergestellte l-phenylalanin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
NL8401049A (nl) * | 1983-08-05 | 1985-03-01 | Grace W R & Co | Werkwijze voor de bereiding van l-aminozuren uit alfa-ketozuren. |
EP0137646A1 (en) * | 1983-08-16 | 1985-04-17 | Genentech, Inc. | Recombinant process for preparing L-amino acids, recombinant expression vectors and transformed microorganisms for use in the process |
US4783403A (en) * | 1984-02-08 | 1988-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing l-phenylalanine |
JPS6156088A (ja) * | 1984-08-27 | 1986-03-20 | Kuraray Co Ltd | L−フエニルアラニンの製造法 |
-
1986
- 1986-09-05 JP JP61210427A patent/JPS62151191A/ja active Granted
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- 1986-09-08 DE DE8686112399T patent/DE3682555D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-11 US US08/003,820 patent/US5420023A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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JPS62151191A (ja) | 1987-07-06 |
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DE3682555D1 (de) | 1992-01-02 |
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US5420023A (en) | 1995-05-30 |
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