JPH0528113B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フエニルアラニンの製造方法に関
し、詳しくはフエニルピルビン酸とアミノ基供与
体とからＬ−フエニルアラニンを生成する能力を
有するミクロコツカス（Micrococcus）属に属す
る細菌を用いて水素ガス高圧下でフエニルピルビ
ン酸と特定のアミノ基供与体とからＬ−フエニル
アリニンを製造する方法に関する。 本発明の方法によつて得られるＬ−フエニルア
ラニンは必須アミノ酸の一種として栄養上または
医薬用途上重要な物質であり、また人工甘味料と
して利用されるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエ
ニルアラニンメチルエステル（アスパルテーム）
の合成原料としても有用な物質である。 〔従来の技術〕 従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用
いてフエニルピルビン酸とアミノ基供与体とから
Ｌ−フエニルアラニンを製造する方法として、例
えばＬ−グルタミン酸とフエニルピルピン酸とか
らアミノ基転移反応によつて酵素的にＬ−フエニ
ルアラニンを製造する際に、ハイドロゲナーゼ、
Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素およびアミノ基転移
酵素の各々の酵素活性を有するエシエリヒア属、
プロテウス属、クロストリジウム属などに属する
細菌の生菌体、菌体破砕物または抽出液を用いて
窒素源の存在下かつ水素ガス雰囲気下でＬ−グル
タミン酸の生成反応とアミノ基転移反応とをＬ−
グルタミン酸を介して基質共軛的に行わしめる方
法（特公昭39−5011号公報および特公昭40−1995
号公報参照）が知られている。上記の方法におい
ては水素ガスを反応器中に内圧をもつて保留する
かまたは吹込むことができるとされており、具体
的には反応器中に0.3Kg／cm²の内圧を維持するよ
うに通気する条件下でＬ−フエニルアラニンを製
造する方法が行われている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 Ｌ−フエニルアラニンを工業的に有利に製造す
るためには該Ｌ−フエニルアラニンを充分に高い
生成速度で製造することができる方法を採用する
ことが望ましいが、かかる観点から上記の従来法
はＬ−フエニルアラニンの工業的な製造方法とし
ては必ずしも適当であるとは言い難い。 しかして、本発明の目的は培養菌体を用いてフ
エニルピルビン酸からＬ−フエニルアラニンを高
い生成速度でかつ好収量で製造することができる
工業的に有利な方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、フエニルピル
ビン酸とアミノ基供与体とからＬ−フエニルアラ
ニンを生成する能力を有するミクロコツカス
（Micrococcus）属に属する細菌を、水素ガス高
圧下において、(1)フエニルピルビン酸、(2)アンモ
ニウム塩および／またはアンモニア、(3)ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（以下これを
NADと称する）および／またはその還元型（以
下これをNADHと称する）、(4)分子状水素により
NADを還元する能力を有するアルカリゲネス
（Alcaligenes）属またはクロストリジウム
（Clostridium）属に属する細胞、(5)Ｌ−フエニル
アラニン以外のアミノ酸および／またはそのアミ
ノ酸に相応するα−ケトカルボン酸ならびに(6)Ｌ
−フエニルアラニン以外のアミノ酸のデヒドロゲ
ナーゼを含む水溶液に作用させることを特徴とす
るＬ−フエニルアラニンの製造方法提供すること
によつて達成される。 本発明の方法において推定されるＬ−フエチル
アラニンが生成する反応機構を概念的に次に示
す。

【表】

【表】 ンが効率的に生成されると推定される。 本発明の方法において使用するフエニルピルビ
ン酸とアミノ基供与体とからＬ−フエルアラニン
を生成する能力を有するミクロコツカス属に属す
る細菌としては、例えばミクロコツカス・ルテウ
ス（Micrococcus luteus）Ｂ−５−４菌株（微
工研菌寄第7664号）があり、その菌学的性質を列
挙すると次表のとおりである。

【表】

【表】

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。 実施例 １ ペプトン0.5ｇ、肉エキス0.5ｇ、食塩0.5ｇおよ
びフエニルピルビン酸0.3ｇを純水に溶解し、１
規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えることによ
りPH7.2に調整したのち純水をさらに加えること
によつて容積を100mlにした。この培地500ml容坂
口フラスコに入れ、110℃で10分間、蒸気殺菌を
行つた。上記の坂口フラスコ中の培地にミクロコ
ツカス・ルテウスＢ−５−４菌株を植菌し、35℃
で15時間培養した。培養後、培養液から菌体を遠
心分離し、生理食塩水で洗浄した。 上記のようにして得られたミクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算し
て1.5ｇ）を濃度0.05モル／のトリス−塩酸緩
衝液（PH7.8）50mlに懸濁した。この菌体懸濁液
を濃度４重量％のアルギン酸ナトリウム水溶液50
mlと混合したのち、この混合液を濃度0.1モル／
の塩化カルシウム水溶液中に滴下することによ
つてビーズ型（直径約３mm）に成型した。 リン酸水素２カリウム0.44ｇ、リン酸２水素カ
リウム0.15ｇおよび塩化アンモニウム0.1ｇを純
水に溶解して容積を100mlにし、この溶液を500ml
容坂口フラスコに入れ、110℃で10分間蒸気殺菌
を行つた。蒸気の坂口フラスコ中の溶液に滅菌処
理を施した(1)濃度20重量％の硫酸マグネシウム水
溶液0.1ml、(2)塩化カルシウム・２水和物10.3ｇ、
塩化鉄（）６水和物16.2ｇ、塩化ニツケル
（）６水和物118mg、塩化クロム（）６水和物
113mg、硫酸銅（）５水和物100mgおよびクエン
酸15.6ｇを純水で溶解して得られた1000mlの溶液
のうちの0.1mlならびに(3)濃度15重量％のフラク
トース水溶液２mlをそれぞれ加えた。この培地50
mlを500ml容坂口フラスコに入れ、それにアルカ
リゲネス・エウトロフアスH16菌株を植菌したの
ち30℃で20時間培養した。培養後、培養液から菌
体を遠心分離し、生理食塩水で洗浄した。 上記のようにして得られたアルカリゲネス・エ
ウトロフアスH16菌株の菌体（乾燥菌体に換算し
て0.5ｇ）濃度0.05モル／のトリス−塩酸緩衝
液（PH7.8）50mlに懸濁した。この菌体懸濁液を
イクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体
の固定化と同様な方法で処理してアルカリゲネ
ス・エウトロフアスH16菌株の菌体の固定化を行
つた。 ゼラチン0.1ｇを濃度0.05モル／のトリス−
塩酸緩衝液（PH7.8）１mlに加熱下に溶解させた
のち110℃で10分間蒸気殺菌した。このゼラチン
溶液にバシルス・スブチリス（Bacillus
subtilis）種に属する細菌起源のアラニン−デヒ
ドロゲナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｌ
−アラニン脱水素酵素）0.8mgと濃度0.05モル／
のトリス−塩酸緩衝液（PH7.8）１mlとからな
る溶液を加え、テフロン膜上に円形に展開したの
ち冷却下に凝固させ、室温下で１晩乾燥させた。
これを濃度1.25重量％のグルタルアルデヒド水溶
液中に３分浸漬漬したのち濃度0.05モル／のト
リス−塩酸緩衝液（PH7.8）で洗浄することによ
つて直径約５cmの円形のフイルムを得た（酵素の
有効量16.8単位）。 上記のようにして得られたミクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株の菌体を固定化したビーズ
1.5cm³（含有されている菌体は乾燥菌体に換算し
て30mg）、アルカリゲネス・エウトロフアスH16
菌株の菌体を固定化したビーズ1.5cm²（含有され
ている菌体は乾燥菌体に換算して10mg）およびア
ラニン−デヒドロゲナーゼを固定化したフイルム
（酵素の有効量16.8単位）を濃度0.1モル／のフ
エニルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル／
のＬ−アラニン水溶液0.5ml、濃度１モル／の
塩化アンモニウム水溶液0.8ml、NAD2.1mg
（0.0032ミリモル）および濃度0.05モル／のト
リス−塩酸緩衝液（PH7.8）2.2mlとともに内容25
mlのステンレス製高圧反応器中に仕込んだ。反応
器内の雰囲気を水素ガスによつて置換したのち水
素ガスで100気圧（絶対圧）に加圧した。かかる
水素ガスの圧力を100気圧（絶対圧）に、反応温
度を37℃にそれぞれ維持しながら10時間反応を行
つた。反応中において反応液の微量を経時時に抜
き取り、それを液体クロマトグラフイーで分析し
た結果、Ｌ−フエニルアラニンの生成速度は0.57
マイクロモル／分／ｇ（ミクロコツカス・ルテウ
スＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であることが判明
した。反応終了後、反応液中のＬ−フエニルアラ
ニンを液体クロマトグラフイーにより定量したと
ころ、Ｌ−フエニルアラニンの生成量は1.7mgで
あつた。 実施例 ２ 実施例１において反応器内の水素ガスの圧力を
20気圧（絶対圧）に維持して反応を行う以外は実
施例１と同様にして菌の培養、菌体およびアラニ
ン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を行
つた。Ｌ−フエニルアラニンの生成速度は0.28マ
イクロモル／分／ｇ（ミクロコツカス・ルテウス
Ｂ−５−４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フエニ
ルアラニンの生成量は0.83mgであつた。 比較例 実施例１において反応器内の水素ガスの圧力を
1.3気圧（絶対圧）に維持して反応を行う以外は
実施例１と同様にして菌の培養、菌体およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を
行つた。Ｌ−フエニルアラニンの生成速度は0.13
マイクロモル／分／ｇ（ミクロコツカス・ルテウ
スＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フエ
ニルアラニンの生成量は0.83mgであつた。 実施例 ３ 実施例１において高圧反応器中に濃度１モル／
の塩化アンモニウム水溶液0.8mlの代りに濃度
１モル／の酢酸アンモニウム水溶液0.8mlを仕
込み、またNAD2.1mg（0.0032ミリモル）の代り
にNADH2.1mg（0.0032ミリモル）を仕込む以外
は実施例１と同様にして菌の培養、菌体およびア
ラニン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応
を行つた。Ｌ−フエニルアラニンの生成速度は
0.62マイクロモル／分／ｇ（ミクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−
フエニルアラニンの生成量は1.8mgであつた。 実施例 ４ ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株およ
びアルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株を実
施例１と同様にしてそれぞれ培養したのちに得ら
れた菌体ならびにアラニン−デヒドロゲナーゼを
固定化することなく高圧反応器に仕込み、かつ
NADの代りにNADH0.53ｇ（0.8ミリモル）を仕
込む以外は実施例１と同様に反応を行つた。Ｌ−
フエニルアラニンの生成速度は0.47マイクロモ
ル／分／ｇ（ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−
４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フエニルアラニ
ンの生成量は1.4mgであつた。 実施例 ５ ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株およ
びアルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株を実
施例１と同様にしてそれぞれ培養したのち、それ
ぞれの菌体を得た。ミクロコツカス・ルテウスＢ
−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して1.5ｇ）
を濃度0.1モル／のリン酸緩衝液（PH7.8）50ml
に懸濁させた。この菌体懸濁液を濃度４重量％の
観点水溶液50mlと混合したのち０℃に冷却するこ
とによつて凝固させ、それを小片（一辺の長さが
約５mmの立方体）に切断し、濃度0.1モル／の
リン酸緩衝液中で保存した。また、アルカリゲネ
ス・エウトロフアスH16菌株の菌体（乾燥菌体に
換算して0.5ｇ）を濃度0.1モル／のリン酸緩衝
液（PH7.8）50mlに懸濁させたのち、同様にして
アルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株の菌体
を寒天中に固定化した。 アラニン−デヒドロゲナーゼの代りにウシの肝
臓（Bovine liver）起源のグルタミン酸−デヒド
ロゲナーゼ〔シグマ社製Ｌ−グルタミン酸−デヒ
ドロゲナーゼ（Ｌ−Glutamic dehydrogenase）
G2009〕0.8mg（32単位）を用いる以外は実施例
１と同様にしてグルタミン酸−デヒドロゲナーゼ
をアルギン酸塩中に固定化した（酵素の有効量22
単位）。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥
菌体に換算して30mg）、アルカリゲネス・エウト
ロフアスH16菌株の菌体（乾燥菌体に換算して10
mg）およびグルタミン酸−デヒドロゲナーゼ（酵
素の有効量22単位）を濃度0.1モル／のフエニ
ルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル／のＬ
−グルタミン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル／の
硫酸アンモニウム水溶液0.8ml、NAKD0.53ｇ
（0.8ミリモル）および濃度0.05モル／のリン酸
緩衝液（PH7.8）2.2mlとともに内容25mlのステン
レス製高圧反応器中に仕込み、実施例１と同様に
して反応を行つた。Ｌ−フエニルアラニンの生成
速度は0.50マイクロモル／分／ｇ（ミクロコツカ
ス・ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であ
り、Ｌ−フエルアラニンの生成量は1.5mgであつ
た。 実施例 ６ グルコース１ｇ、ペプトン0.4ｇ、肉エキス0.2
ｇ、酵母エキス0.4ｇ、リン酸水素２カリウム
1.25ｇおよび硫酸鉄（）0.05ｇを純水に溶解し
たのち１規定の塩酸でPHを7.0に調整し、純水を
さらに加えることによつて容積を100mlにした。
この培地50mlを500ml容坂口フラスコに入れ、110
℃で10分間蒸気殺菌ののちクロストリジウム・ブ
チリカムIFO3858菌株を植菌し、嫌気性条件下に
おいて37℃で10時間培養した。得られたクロスト
リジウム・ブチリカムIFO3858菌株の菌体（乾燥
菌体に換算して0.5ｇ）濃度0.05モル／のトリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.8）50mlに懸濁した。この
菌体懸濁液を濃度４重量％のアルギン酸ナトリウ
ム水溶液50mlと混合したのち、この混合液を濃度
0.1モル／の塩化カルシウム水溶液中に滴下す
ることによつてビーズ型（直径約３mm）に成型し
た。 実施例１と同様にしてミクロコツカス・ルテウ
スＢ−５−４菌株の培養、それによつて得られた
菌体の固定化およびアラニン−デヒドロゲナーゼ
の固定化を行つた。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥
菌体に換算して30mg）、クロストリジウム・ブチ
リカムIFO3858菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
10mg）およびアラニン−デヒドロゲナーゼ（酵素
の有効量16.8単位）を用いる以外は実施例１と同
様にして反応を行つた。Ｌ−フエニルアラニンの
生成速度は0.50マイクロモル／分／ｇ（ミクロコ
ツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）で
あり、Ｌ−フエニルアラニンの生成量は1.5mgで
あつた。 実施例 ７ 実施例１と同様に培養して得られたミクロコツ
カス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体を実施例５
と同様にして寒天中に固定化した。実施例６と同
様に培養して得られたクロストリジウム・ブチリ
カムIFO3858菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
0.5ｇ）を濃度0.1モル／のリン酸緩衝液（PH
7.8）50mlに懸濁させたのち、アカリゲネス・エ
ウトロフアスH16菌株の菌体の代りにクロストリ
ジウム・ブチリカムIFO3858菌株の菌体を用いる
以外は実施例５と同様にして菌体を寒天中に固定
した。実施例１と同様にしてアラニン−デヒドロ
ゲナーゼの固定化を行つた。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥
菌体に換算して30mg）、クロストリジウム・ブチ
リカムIFO3858菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
10mg）およびアラニン−デヒドロゲナーゼ（酵素
の有効量16.8単位）を、濃度0.1モル／のフエ
ニルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル／の
Ｌ−アラニン水溶液0.5ml、濃度１モル／のア
ンモニア水溶液0.8ml、NAD2.1mg（0.0032ミリモ
ル）および濃度0.05モル／のリン酸緩衝液（PH
7.8）2.2mlとともに内容25mlのステンレス製高圧
反応器中に仕込んだ。反応器内の雰囲気を水素ガ
スで置換したのち水素ガスで80気圧（絶対圧）に
加圧し、水素ガスの圧力を80気圧（絶対圧）に、
反応温度を37℃にそれぞれ維持しながら10時間反
応を行つた。Ｌ−フエニルアラニンの生成速度は
0.45マイクロモル／分／ｇ（ミクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−
フエニルアラニンの生成量は1.3mgであつた。 実施例 ８ アラニン−デヒドロゲナーゼを1.8mg用いる以
外は実施例１と同様な方法によりアラニン−デヒ
ドロゲナーゼを固定化した直径約５cmのフイルム
を作製した。同様な方法によつて作製したフイル
ム３枚を用い、かつ濃度0.5モル／のＬ−アラ
ニン水溶液の代りに濃度0.5モル／のピルビン
酸水溶液を用いる以外は実施例１と同様にして菌
の培養、菌体の固定化および反応を行つた。Ｌ−
フエニルアラニンの生成速度は0.52マイクロモ
ル／分／ｇ（ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−
４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フエニルアラニ
ンの生成量は1.5mgであつた。 〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなと
おり、フエニルピルビン酸とアンモニウム塩およ
び／またはアンモニアから高い生成速度かつ好収
量でしかも容易にＬ−フエニルアラニンを製造す
ることができる

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フエニルピルビン酸とアミノ基供与体とから
   Ｌ−フエニルアラニンを生成する能力を有するミ
   クロコツカス（Micrococcus）属に属する細菌
   を、水素ガス高圧下において、(1)フエニルピルビ
   ン酸、(2)アンモニウム塩および／またはアンモニ
   ア、(3)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドお
   よび／またはその還元型、(4)分子状水素によりニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する
   能力を有するアルカリゲネス（Alcaligenes）属
   またはクロストリジウム（Clostridium）属に属
   する細胞、(5)Ｌ−フエニルアラニン以外のアミノ
   酸および／またはそのアミノ酸に相応するα−ケ
   トカルボン酸ならびに(6)Ｌ−フエニルアラニン以
   外のアミノ酸のデヒドロゲナーゼを含む水溶液に
   作用させることを特徴とするＬ−フエニルアラニ
   ンの製造方法。 ２ 水素ガスの分圧が10気圧（絶対圧）以上であ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３ 細菌がミクロコツカス属ルテウス（luteus）
   種に属する細菌である特許請求の範囲第１項記載
   の製造方法。 ４ ミクロコツカス属に属する細菌、アルカリゲ
   ネス属またはクロストリジウム属に属する細菌な
   らびにデヒドロゲナーゼがそれぞれ担体に固定化
   されている特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。 ５ Ｌ−フエニルアラニン以外のアミノ酸がＬ−
   アラニンである特許請求の範囲第１項記載の製造
   方法。