JPH0528113B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はL−フエニルアラニンの製造方法に関
し、詳しくはフエニルピルビン酸とアミノ基供与
体とからL−フエニルアラニンを生成する能力を
有するミクロコツカス(Micrococcus)属に属す
る細菌を用いて水素ガス高圧下でフエニルピルビ
ン酸と特定のアミノ基供与体とからL−フエニル
アリニンを製造する方法に関する。 本発明の方法によつて得られるL−フエニルア
ラニンは必須アミノ酸の一種として栄養上または
医薬用途上重要な物質であり、また人工甘味料と
して利用されるα−L−アスパルチル−L−フエ
ニルアラニンメチルエステル(アスパルテーム)
の合成原料としても有用な物質である。 〔従来の技術〕 従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用
いてフエニルピルビン酸とアミノ基供与体とから
L−フエニルアラニンを製造する方法として、例
えばL−グルタミン酸とフエニルピルピン酸とか
らアミノ基転移反応によつて酵素的にL−フエニ
ルアラニンを製造する際に、ハイドロゲナーゼ、
L−グルタミン酸脱水素酵素およびアミノ基転移
酵素の各々の酵素活性を有するエシエリヒア属、
プロテウス属、クロストリジウム属などに属する
細菌の生菌体、菌体破砕物または抽出液を用いて
窒素源の存在下かつ水素ガス雰囲気下でL−グル
タミン酸の生成反応とアミノ基転移反応とをL−
グルタミン酸を介して基質共軛的に行わしめる方
法(特公昭39−5011号公報および特公昭40−1995
号公報参照)が知られている。上記の方法におい
ては水素ガスを反応器中に内圧をもつて保留する
かまたは吹込むことができるとされており、具体
的には反応器中に0.3Kg/cm2の内圧を維持するよ
うに通気する条件下でL−フエニルアラニンを製
造する方法が行われている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 L−フエニルアラニンを工業的に有利に製造す
るためには該L−フエニルアラニンを充分に高い
生成速度で製造することができる方法を採用する
ことが望ましいが、かかる観点から上記の従来法
はL−フエニルアラニンの工業的な製造方法とし
ては必ずしも適当であるとは言い難い。 しかして、本発明の目的は培養菌体を用いてフ
エニルピルビン酸からL−フエニルアラニンを高
い生成速度でかつ好収量で製造することができる
工業的に有利な方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、フエニルピル
ビン酸とアミノ基供与体とからL−フエニルアラ
ニンを生成する能力を有するミクロコツカス
(Micrococcus)属に属する細菌を、水素ガス高
圧下において、(1)フエニルピルビン酸、(2)アンモ
ニウム塩および/またはアンモニア、(3)ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド(以下これを
NADと称する)および/またはその還元型(以
下これをNADHと称する)、(4)分子状水素により
NADを還元する能力を有するアルカリゲネス
(Alcaligenes)属またはクロストリジウム
(Clostridium)属に属する細胞、(5)L−フエニル
アラニン以外のアミノ酸および/またはそのアミ
ノ酸に相応するα−ケトカルボン酸ならびに(6)L
−フエニルアラニン以外のアミノ酸のデヒドロゲ
ナーゼを含む水溶液に作用させることを特徴とす
るL−フエニルアラニンの製造方法提供すること
によつて達成される。 本発明の方法において推定されるL−フエチル
アラニンが生成する反応機構を概念的に次に示
す。
し、詳しくはフエニルピルビン酸とアミノ基供与
体とからL−フエニルアラニンを生成する能力を
有するミクロコツカス(Micrococcus)属に属す
る細菌を用いて水素ガス高圧下でフエニルピルビ
ン酸と特定のアミノ基供与体とからL−フエニル
アリニンを製造する方法に関する。 本発明の方法によつて得られるL−フエニルア
ラニンは必須アミノ酸の一種として栄養上または
医薬用途上重要な物質であり、また人工甘味料と
して利用されるα−L−アスパルチル−L−フエ
ニルアラニンメチルエステル(アスパルテーム)
の合成原料としても有用な物質である。 〔従来の技術〕 従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用
いてフエニルピルビン酸とアミノ基供与体とから
L−フエニルアラニンを製造する方法として、例
えばL−グルタミン酸とフエニルピルピン酸とか
らアミノ基転移反応によつて酵素的にL−フエニ
ルアラニンを製造する際に、ハイドロゲナーゼ、
L−グルタミン酸脱水素酵素およびアミノ基転移
酵素の各々の酵素活性を有するエシエリヒア属、
プロテウス属、クロストリジウム属などに属する
細菌の生菌体、菌体破砕物または抽出液を用いて
窒素源の存在下かつ水素ガス雰囲気下でL−グル
タミン酸の生成反応とアミノ基転移反応とをL−
グルタミン酸を介して基質共軛的に行わしめる方
法(特公昭39−5011号公報および特公昭40−1995
号公報参照)が知られている。上記の方法におい
ては水素ガスを反応器中に内圧をもつて保留する
かまたは吹込むことができるとされており、具体
的には反応器中に0.3Kg/cm2の内圧を維持するよ
うに通気する条件下でL−フエニルアラニンを製
造する方法が行われている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 L−フエニルアラニンを工業的に有利に製造す
るためには該L−フエニルアラニンを充分に高い
生成速度で製造することができる方法を採用する
ことが望ましいが、かかる観点から上記の従来法
はL−フエニルアラニンの工業的な製造方法とし
ては必ずしも適当であるとは言い難い。 しかして、本発明の目的は培養菌体を用いてフ
エニルピルビン酸からL−フエニルアラニンを高
い生成速度でかつ好収量で製造することができる
工業的に有利な方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、フエニルピル
ビン酸とアミノ基供与体とからL−フエニルアラ
ニンを生成する能力を有するミクロコツカス
(Micrococcus)属に属する細菌を、水素ガス高
圧下において、(1)フエニルピルビン酸、(2)アンモ
ニウム塩および/またはアンモニア、(3)ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド(以下これを
NADと称する)および/またはその還元型(以
下これをNADHと称する)、(4)分子状水素により
NADを還元する能力を有するアルカリゲネス
(Alcaligenes)属またはクロストリジウム
(Clostridium)属に属する細胞、(5)L−フエニル
アラニン以外のアミノ酸および/またはそのアミ
ノ酸に相応するα−ケトカルボン酸ならびに(6)L
−フエニルアラニン以外のアミノ酸のデヒドロゲ
ナーゼを含む水溶液に作用させることを特徴とす
るL−フエニルアラニンの製造方法提供すること
によつて達成される。 本発明の方法において推定されるL−フエチル
アラニンが生成する反応機構を概念的に次に示
す。
【表】
【表】
ンが効率的に生成されると推定される。
本発明の方法において使用するフエニルピルビ
ン酸とアミノ基供与体とからL−フエルアラニン
を生成する能力を有するミクロコツカス属に属す
る細菌としては、例えばミクロコツカス・ルテウ
ス(Micrococcus luteus)B−5−4菌株(微
工研菌寄第7664号)があり、その菌学的性質を列
挙すると次表のとおりである。
ン酸とアミノ基供与体とからL−フエルアラニン
を生成する能力を有するミクロコツカス属に属す
る細菌としては、例えばミクロコツカス・ルテウ
ス(Micrococcus luteus)B−5−4菌株(微
工研菌寄第7664号)があり、その菌学的性質を列
挙すると次表のとおりである。
【表】
【表】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。 実施例 1 ペプトン0.5g、肉エキス0.5g、食塩0.5gおよ
びフエニルピルビン酸0.3gを純水に溶解し、1
規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えることによ
りPH7.2に調整したのち純水をさらに加えること
によつて容積を100mlにした。この培地500ml容坂
口フラスコに入れ、110℃で10分間、蒸気殺菌を
行つた。上記の坂口フラスコ中の培地にミクロコ
ツカス・ルテウスB−5−4菌株を植菌し、35℃
で15時間培養した。培養後、培養液から菌体を遠
心分離し、生理食塩水で洗浄した。 上記のようにして得られたミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算し
て1.5g)を濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩
衝液(PH7.8)50mlに懸濁した。この菌体懸濁液
を濃度4重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液50
mlと混合したのち、この混合液を濃度0.1モル/
の塩化カルシウム水溶液中に滴下することによ
つてビーズ型(直径約3mm)に成型した。 リン酸水素2カリウム0.44g、リン酸2水素カ
リウム0.15gおよび塩化アンモニウム0.1gを純
水に溶解して容積を100mlにし、この溶液を500ml
容坂口フラスコに入れ、110℃で10分間蒸気殺菌
を行つた。蒸気の坂口フラスコ中の溶液に滅菌処
理を施した(1)濃度20重量%の硫酸マグネシウム水
溶液0.1ml、(2)塩化カルシウム・2水和物10.3g、
塩化鉄()6水和物16.2g、塩化ニツケル
()6水和物118mg、塩化クロム()6水和物
113mg、硫酸銅()5水和物100mgおよびクエン
酸15.6gを純水で溶解して得られた1000mlの溶液
のうちの0.1mlならびに(3)濃度15重量%のフラク
トース水溶液2mlをそれぞれ加えた。この培地50
mlを500ml容坂口フラスコに入れ、それにアルカ
リゲネス・エウトロフアスH16菌株を植菌したの
ち30℃で20時間培養した。培養後、培養液から菌
体を遠心分離し、生理食塩水で洗浄した。 上記のようにして得られたアルカリゲネス・エ
ウトロフアスH16菌株の菌体(乾燥菌体に換算し
て0.5g)濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝
液(PH7.8)50mlに懸濁した。この菌体懸濁液を
イクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体
の固定化と同様な方法で処理してアルカリゲネ
ス・エウトロフアスH16菌株の菌体の固定化を行
つた。 ゼラチン0.1gを濃度0.05モル/のトリス−
塩酸緩衝液(PH7.8)1mlに加熱下に溶解させた
のち110℃で10分間蒸気殺菌した。このゼラチン
溶液にバシルス・スブチリス(Bacillus
subtilis)種に属する細菌起源のアラニン−デヒ
ドロゲナーゼ(ベーリンガー・マンハイム社製L
−アラニン脱水素酵素)0.8mgと濃度0.05モル/
のトリス−塩酸緩衝液(PH7.8)1mlとからな
る溶液を加え、テフロン膜上に円形に展開したの
ち冷却下に凝固させ、室温下で1晩乾燥させた。
これを濃度1.25重量%のグルタルアルデヒド水溶
液中に3分浸漬漬したのち濃度0.05モル/のト
リス−塩酸緩衝液(PH7.8)で洗浄することによ
つて直径約5cmの円形のフイルムを得た(酵素の
有効量16.8単位)。 上記のようにして得られたミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の菌体を固定化したビーズ
1.5cm3(含有されている菌体は乾燥菌体に換算し
て30mg)、アルカリゲネス・エウトロフアスH16
菌株の菌体を固定化したビーズ1.5cm2(含有され
ている菌体は乾燥菌体に換算して10mg)およびア
ラニン−デヒドロゲナーゼを固定化したフイルム
(酵素の有効量16.8単位)を濃度0.1モル/のフ
エニルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/
のL−アラニン水溶液0.5ml、濃度1モル/の
塩化アンモニウム水溶液0.8ml、NAD2.1mg
(0.0032ミリモル)および濃度0.05モル/のト
リス−塩酸緩衝液(PH7.8)2.2mlとともに内容25
mlのステンレス製高圧反応器中に仕込んだ。反応
器内の雰囲気を水素ガスによつて置換したのち水
素ガスで100気圧(絶対圧)に加圧した。かかる
水素ガスの圧力を100気圧(絶対圧)に、反応温
度を37℃にそれぞれ維持しながら10時間反応を行
つた。反応中において反応液の微量を経時時に抜
き取り、それを液体クロマトグラフイーで分析し
た結果、L−フエニルアラニンの生成速度は0.57
マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ルテウ
スB−5−4菌株の乾燥菌体)であることが判明
した。反応終了後、反応液中のL−フエニルアラ
ニンを液体クロマトグラフイーにより定量したと
ころ、L−フエニルアラニンの生成量は1.7mgで
あつた。 実施例 2 実施例1において反応器内の水素ガスの圧力を
20気圧(絶対圧)に維持して反応を行う以外は実
施例1と同様にして菌の培養、菌体およびアラニ
ン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を行
つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.28マ
イクロモル/分/g(ミクロコツカス・ルテウス
B−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエニ
ルアラニンの生成量は0.83mgであつた。 比較例 実施例1において反応器内の水素ガスの圧力を
1.3気圧(絶対圧)に維持して反応を行う以外は
実施例1と同様にして菌の培養、菌体およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を
行つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.13
マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ルテウ
スB−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエ
ニルアラニンの生成量は0.83mgであつた。 実施例 3 実施例1において高圧反応器中に濃度1モル/
の塩化アンモニウム水溶液0.8mlの代りに濃度
1モル/の酢酸アンモニウム水溶液0.8mlを仕
込み、またNAD2.1mg(0.0032ミリモル)の代り
にNADH2.1mg(0.0032ミリモル)を仕込む以外
は実施例1と同様にして菌の培養、菌体およびア
ラニン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応
を行つた。L−フエニルアラニンの生成速度は
0.62マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−
フエニルアラニンの生成量は1.8mgであつた。 実施例 4 ミクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株およ
びアルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株を実
施例1と同様にしてそれぞれ培養したのちに得ら
れた菌体ならびにアラニン−デヒドロゲナーゼを
固定化することなく高圧反応器に仕込み、かつ
NADの代りにNADH0.53g(0.8ミリモル)を仕
込む以外は実施例1と同様に反応を行つた。L−
フエニルアラニンの生成速度は0.47マイクロモ
ル/分/g(ミクロコツカス・ルテウスB−5−
4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエニルアラニ
ンの生成量は1.4mgであつた。 実施例 5 ミクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株およ
びアルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株を実
施例1と同様にしてそれぞれ培養したのち、それ
ぞれの菌体を得た。ミクロコツカス・ルテウスB
−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算して1.5g)
を濃度0.1モル/のリン酸緩衝液(PH7.8)50ml
に懸濁させた。この菌体懸濁液を濃度4重量%の
観点水溶液50mlと混合したのち0℃に冷却するこ
とによつて凝固させ、それを小片(一辺の長さが
約5mmの立方体)に切断し、濃度0.1モル/の
リン酸緩衝液中で保存した。また、アルカリゲネ
ス・エウトロフアスH16菌株の菌体(乾燥菌体に
換算して0.5g)を濃度0.1モル/のリン酸緩衝
液(PH7.8)50mlに懸濁させたのち、同様にして
アルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株の菌体
を寒天中に固定化した。 アラニン−デヒドロゲナーゼの代りにウシの肝
臓(Bovine liver)起源のグルタミン酸−デヒド
ロゲナーゼ〔シグマ社製L−グルタミン酸−デヒ
ドロゲナーゼ(L−Glutamic dehydrogenase)
G2009〕0.8mg(32単位)を用いる以外は実施例
1と同様にしてグルタミン酸−デヒドロゲナーゼ
をアルギン酸塩中に固定化した(酵素の有効量22
単位)。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)、アルカリゲネス・エウト
ロフアスH16菌株の菌体(乾燥菌体に換算して10
mg)およびグルタミン酸−デヒドロゲナーゼ(酵
素の有効量22単位)を濃度0.1モル/のフエニ
ルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/のL
−グルタミン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/の
硫酸アンモニウム水溶液0.8ml、NAKD0.53g
(0.8ミリモル)および濃度0.05モル/のリン酸
緩衝液(PH7.8)2.2mlとともに内容25mlのステン
レス製高圧反応器中に仕込み、実施例1と同様に
して反応を行つた。L−フエニルアラニンの生成
速度は0.50マイクロモル/分/g(ミクロコツカ
ス・ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であ
り、L−フエルアラニンの生成量は1.5mgであつ
た。 実施例 6 グルコース1g、ペプトン0.4g、肉エキス0.2
g、酵母エキス0.4g、リン酸水素2カリウム
1.25gおよび硫酸鉄()0.05gを純水に溶解し
たのち1規定の塩酸でPHを7.0に調整し、純水を
さらに加えることによつて容積を100mlにした。
この培地50mlを500ml容坂口フラスコに入れ、110
℃で10分間蒸気殺菌ののちクロストリジウム・ブ
チリカムIFO3858菌株を植菌し、嫌気性条件下に
おいて37℃で10時間培養した。得られたクロスト
リジウム・ブチリカムIFO3858菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して0.5g)濃度0.05モル/のトリ
ス−塩酸緩衝液(PH7.8)50mlに懸濁した。この
菌体懸濁液を濃度4重量%のアルギン酸ナトリウ
ム水溶液50mlと混合したのち、この混合液を濃度
0.1モル/の塩化カルシウム水溶液中に滴下す
ることによつてビーズ型(直径約3mm)に成型し
た。 実施例1と同様にしてミクロコツカス・ルテウ
スB−5−4菌株の培養、それによつて得られた
菌体の固定化およびアラニン−デヒドロゲナーゼ
の固定化を行つた。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)、クロストリジウム・ブチ
リカムIFO3858菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
10mg)およびアラニン−デヒドロゲナーゼ(酵素
の有効量16.8単位)を用いる以外は実施例1と同
様にして反応を行つた。L−フエニルアラニンの
生成速度は0.50マイクロモル/分/g(ミクロコ
ツカス・ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)で
あり、L−フエニルアラニンの生成量は1.5mgで
あつた。 実施例 7 実施例1と同様に培養して得られたミクロコツ
カス・ルテウスB−5−4菌株の菌体を実施例5
と同様にして寒天中に固定化した。実施例6と同
様に培養して得られたクロストリジウム・ブチリ
カムIFO3858菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
0.5g)を濃度0.1モル/のリン酸緩衝液(PH
7.8)50mlに懸濁させたのち、アカリゲネス・エ
ウトロフアスH16菌株の菌体の代りにクロストリ
ジウム・ブチリカムIFO3858菌株の菌体を用いる
以外は実施例5と同様にして菌体を寒天中に固定
した。実施例1と同様にしてアラニン−デヒドロ
ゲナーゼの固定化を行つた。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)、クロストリジウム・ブチ
リカムIFO3858菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
10mg)およびアラニン−デヒドロゲナーゼ(酵素
の有効量16.8単位)を、濃度0.1モル/のフエ
ニルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/の
L−アラニン水溶液0.5ml、濃度1モル/のア
ンモニア水溶液0.8ml、NAD2.1mg(0.0032ミリモ
ル)および濃度0.05モル/のリン酸緩衝液(PH
7.8)2.2mlとともに内容25mlのステンレス製高圧
反応器中に仕込んだ。反応器内の雰囲気を水素ガ
スで置換したのち水素ガスで80気圧(絶対圧)に
加圧し、水素ガスの圧力を80気圧(絶対圧)に、
反応温度を37℃にそれぞれ維持しながら10時間反
応を行つた。L−フエニルアラニンの生成速度は
0.45マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−
フエニルアラニンの生成量は1.3mgであつた。 実施例 8 アラニン−デヒドロゲナーゼを1.8mg用いる以
外は実施例1と同様な方法によりアラニン−デヒ
ドロゲナーゼを固定化した直径約5cmのフイルム
を作製した。同様な方法によつて作製したフイル
ム3枚を用い、かつ濃度0.5モル/のL−アラ
ニン水溶液の代りに濃度0.5モル/のピルビン
酸水溶液を用いる以外は実施例1と同様にして菌
の培養、菌体の固定化および反応を行つた。L−
フエニルアラニンの生成速度は0.52マイクロモ
ル/分/g(ミクロコツカス・ルテウスB−5−
4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエニルアラニ
ンの生成量は1.5mgであつた。 〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなと
おり、フエニルピルビン酸とアンモニウム塩およ
び/またはアンモニアから高い生成速度かつ好収
量でしかも容易にL−フエニルアラニンを製造す
ることができる
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。 実施例 1 ペプトン0.5g、肉エキス0.5g、食塩0.5gおよ
びフエニルピルビン酸0.3gを純水に溶解し、1
規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えることによ
りPH7.2に調整したのち純水をさらに加えること
によつて容積を100mlにした。この培地500ml容坂
口フラスコに入れ、110℃で10分間、蒸気殺菌を
行つた。上記の坂口フラスコ中の培地にミクロコ
ツカス・ルテウスB−5−4菌株を植菌し、35℃
で15時間培養した。培養後、培養液から菌体を遠
心分離し、生理食塩水で洗浄した。 上記のようにして得られたミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算し
て1.5g)を濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩
衝液(PH7.8)50mlに懸濁した。この菌体懸濁液
を濃度4重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液50
mlと混合したのち、この混合液を濃度0.1モル/
の塩化カルシウム水溶液中に滴下することによ
つてビーズ型(直径約3mm)に成型した。 リン酸水素2カリウム0.44g、リン酸2水素カ
リウム0.15gおよび塩化アンモニウム0.1gを純
水に溶解して容積を100mlにし、この溶液を500ml
容坂口フラスコに入れ、110℃で10分間蒸気殺菌
を行つた。蒸気の坂口フラスコ中の溶液に滅菌処
理を施した(1)濃度20重量%の硫酸マグネシウム水
溶液0.1ml、(2)塩化カルシウム・2水和物10.3g、
塩化鉄()6水和物16.2g、塩化ニツケル
()6水和物118mg、塩化クロム()6水和物
113mg、硫酸銅()5水和物100mgおよびクエン
酸15.6gを純水で溶解して得られた1000mlの溶液
のうちの0.1mlならびに(3)濃度15重量%のフラク
トース水溶液2mlをそれぞれ加えた。この培地50
mlを500ml容坂口フラスコに入れ、それにアルカ
リゲネス・エウトロフアスH16菌株を植菌したの
ち30℃で20時間培養した。培養後、培養液から菌
体を遠心分離し、生理食塩水で洗浄した。 上記のようにして得られたアルカリゲネス・エ
ウトロフアスH16菌株の菌体(乾燥菌体に換算し
て0.5g)濃度0.05モル/のトリス−塩酸緩衝
液(PH7.8)50mlに懸濁した。この菌体懸濁液を
イクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体
の固定化と同様な方法で処理してアルカリゲネ
ス・エウトロフアスH16菌株の菌体の固定化を行
つた。 ゼラチン0.1gを濃度0.05モル/のトリス−
塩酸緩衝液(PH7.8)1mlに加熱下に溶解させた
のち110℃で10分間蒸気殺菌した。このゼラチン
溶液にバシルス・スブチリス(Bacillus
subtilis)種に属する細菌起源のアラニン−デヒ
ドロゲナーゼ(ベーリンガー・マンハイム社製L
−アラニン脱水素酵素)0.8mgと濃度0.05モル/
のトリス−塩酸緩衝液(PH7.8)1mlとからな
る溶液を加え、テフロン膜上に円形に展開したの
ち冷却下に凝固させ、室温下で1晩乾燥させた。
これを濃度1.25重量%のグルタルアルデヒド水溶
液中に3分浸漬漬したのち濃度0.05モル/のト
リス−塩酸緩衝液(PH7.8)で洗浄することによ
つて直径約5cmの円形のフイルムを得た(酵素の
有効量16.8単位)。 上記のようにして得られたミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の菌体を固定化したビーズ
1.5cm3(含有されている菌体は乾燥菌体に換算し
て30mg)、アルカリゲネス・エウトロフアスH16
菌株の菌体を固定化したビーズ1.5cm2(含有され
ている菌体は乾燥菌体に換算して10mg)およびア
ラニン−デヒドロゲナーゼを固定化したフイルム
(酵素の有効量16.8単位)を濃度0.1モル/のフ
エニルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/
のL−アラニン水溶液0.5ml、濃度1モル/の
塩化アンモニウム水溶液0.8ml、NAD2.1mg
(0.0032ミリモル)および濃度0.05モル/のト
リス−塩酸緩衝液(PH7.8)2.2mlとともに内容25
mlのステンレス製高圧反応器中に仕込んだ。反応
器内の雰囲気を水素ガスによつて置換したのち水
素ガスで100気圧(絶対圧)に加圧した。かかる
水素ガスの圧力を100気圧(絶対圧)に、反応温
度を37℃にそれぞれ維持しながら10時間反応を行
つた。反応中において反応液の微量を経時時に抜
き取り、それを液体クロマトグラフイーで分析し
た結果、L−フエニルアラニンの生成速度は0.57
マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ルテウ
スB−5−4菌株の乾燥菌体)であることが判明
した。反応終了後、反応液中のL−フエニルアラ
ニンを液体クロマトグラフイーにより定量したと
ころ、L−フエニルアラニンの生成量は1.7mgで
あつた。 実施例 2 実施例1において反応器内の水素ガスの圧力を
20気圧(絶対圧)に維持して反応を行う以外は実
施例1と同様にして菌の培養、菌体およびアラニ
ン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を行
つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.28マ
イクロモル/分/g(ミクロコツカス・ルテウス
B−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエニ
ルアラニンの生成量は0.83mgであつた。 比較例 実施例1において反応器内の水素ガスの圧力を
1.3気圧(絶対圧)に維持して反応を行う以外は
実施例1と同様にして菌の培養、菌体およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を
行つた。L−フエニルアラニンの生成速度は0.13
マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ルテウ
スB−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエ
ニルアラニンの生成量は0.83mgであつた。 実施例 3 実施例1において高圧反応器中に濃度1モル/
の塩化アンモニウム水溶液0.8mlの代りに濃度
1モル/の酢酸アンモニウム水溶液0.8mlを仕
込み、またNAD2.1mg(0.0032ミリモル)の代り
にNADH2.1mg(0.0032ミリモル)を仕込む以外
は実施例1と同様にして菌の培養、菌体およびア
ラニン−デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応
を行つた。L−フエニルアラニンの生成速度は
0.62マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−
フエニルアラニンの生成量は1.8mgであつた。 実施例 4 ミクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株およ
びアルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株を実
施例1と同様にしてそれぞれ培養したのちに得ら
れた菌体ならびにアラニン−デヒドロゲナーゼを
固定化することなく高圧反応器に仕込み、かつ
NADの代りにNADH0.53g(0.8ミリモル)を仕
込む以外は実施例1と同様に反応を行つた。L−
フエニルアラニンの生成速度は0.47マイクロモ
ル/分/g(ミクロコツカス・ルテウスB−5−
4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエニルアラニ
ンの生成量は1.4mgであつた。 実施例 5 ミクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株およ
びアルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株を実
施例1と同様にしてそれぞれ培養したのち、それ
ぞれの菌体を得た。ミクロコツカス・ルテウスB
−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算して1.5g)
を濃度0.1モル/のリン酸緩衝液(PH7.8)50ml
に懸濁させた。この菌体懸濁液を濃度4重量%の
観点水溶液50mlと混合したのち0℃に冷却するこ
とによつて凝固させ、それを小片(一辺の長さが
約5mmの立方体)に切断し、濃度0.1モル/の
リン酸緩衝液中で保存した。また、アルカリゲネ
ス・エウトロフアスH16菌株の菌体(乾燥菌体に
換算して0.5g)を濃度0.1モル/のリン酸緩衝
液(PH7.8)50mlに懸濁させたのち、同様にして
アルカリゲネス・エウトロフアスH16菌株の菌体
を寒天中に固定化した。 アラニン−デヒドロゲナーゼの代りにウシの肝
臓(Bovine liver)起源のグルタミン酸−デヒド
ロゲナーゼ〔シグマ社製L−グルタミン酸−デヒ
ドロゲナーゼ(L−Glutamic dehydrogenase)
G2009〕0.8mg(32単位)を用いる以外は実施例
1と同様にしてグルタミン酸−デヒドロゲナーゼ
をアルギン酸塩中に固定化した(酵素の有効量22
単位)。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)、アルカリゲネス・エウト
ロフアスH16菌株の菌体(乾燥菌体に換算して10
mg)およびグルタミン酸−デヒドロゲナーゼ(酵
素の有効量22単位)を濃度0.1モル/のフエニ
ルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/のL
−グルタミン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/の
硫酸アンモニウム水溶液0.8ml、NAKD0.53g
(0.8ミリモル)および濃度0.05モル/のリン酸
緩衝液(PH7.8)2.2mlとともに内容25mlのステン
レス製高圧反応器中に仕込み、実施例1と同様に
して反応を行つた。L−フエニルアラニンの生成
速度は0.50マイクロモル/分/g(ミクロコツカ
ス・ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であ
り、L−フエルアラニンの生成量は1.5mgであつ
た。 実施例 6 グルコース1g、ペプトン0.4g、肉エキス0.2
g、酵母エキス0.4g、リン酸水素2カリウム
1.25gおよび硫酸鉄()0.05gを純水に溶解し
たのち1規定の塩酸でPHを7.0に調整し、純水を
さらに加えることによつて容積を100mlにした。
この培地50mlを500ml容坂口フラスコに入れ、110
℃で10分間蒸気殺菌ののちクロストリジウム・ブ
チリカムIFO3858菌株を植菌し、嫌気性条件下に
おいて37℃で10時間培養した。得られたクロスト
リジウム・ブチリカムIFO3858菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して0.5g)濃度0.05モル/のトリ
ス−塩酸緩衝液(PH7.8)50mlに懸濁した。この
菌体懸濁液を濃度4重量%のアルギン酸ナトリウ
ム水溶液50mlと混合したのち、この混合液を濃度
0.1モル/の塩化カルシウム水溶液中に滴下す
ることによつてビーズ型(直径約3mm)に成型し
た。 実施例1と同様にしてミクロコツカス・ルテウ
スB−5−4菌株の培養、それによつて得られた
菌体の固定化およびアラニン−デヒドロゲナーゼ
の固定化を行つた。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)、クロストリジウム・ブチ
リカムIFO3858菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
10mg)およびアラニン−デヒドロゲナーゼ(酵素
の有効量16.8単位)を用いる以外は実施例1と同
様にして反応を行つた。L−フエニルアラニンの
生成速度は0.50マイクロモル/分/g(ミクロコ
ツカス・ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)で
あり、L−フエニルアラニンの生成量は1.5mgで
あつた。 実施例 7 実施例1と同様に培養して得られたミクロコツ
カス・ルテウスB−5−4菌株の菌体を実施例5
と同様にして寒天中に固定化した。実施例6と同
様に培養して得られたクロストリジウム・ブチリ
カムIFO3858菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
0.5g)を濃度0.1モル/のリン酸緩衝液(PH
7.8)50mlに懸濁させたのち、アカリゲネス・エ
ウトロフアスH16菌株の菌体の代りにクロストリ
ジウム・ブチリカムIFO3858菌株の菌体を用いる
以外は実施例5と同様にして菌体を寒天中に固定
した。実施例1と同様にしてアラニン−デヒドロ
ゲナーゼの固定化を行つた。 上記のようにして得られた固定化されたミクロ
コツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥
菌体に換算して30mg)、クロストリジウム・ブチ
リカムIFO3858菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
10mg)およびアラニン−デヒドロゲナーゼ(酵素
の有効量16.8単位)を、濃度0.1モル/のフエ
ニルピルビン酸水溶液0.5ml、濃度0.5モル/の
L−アラニン水溶液0.5ml、濃度1モル/のア
ンモニア水溶液0.8ml、NAD2.1mg(0.0032ミリモ
ル)および濃度0.05モル/のリン酸緩衝液(PH
7.8)2.2mlとともに内容25mlのステンレス製高圧
反応器中に仕込んだ。反応器内の雰囲気を水素ガ
スで置換したのち水素ガスで80気圧(絶対圧)に
加圧し、水素ガスの圧力を80気圧(絶対圧)に、
反応温度を37℃にそれぞれ維持しながら10時間反
応を行つた。L−フエニルアラニンの生成速度は
0.45マイクロモル/分/g(ミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であり、L−
フエニルアラニンの生成量は1.3mgであつた。 実施例 8 アラニン−デヒドロゲナーゼを1.8mg用いる以
外は実施例1と同様な方法によりアラニン−デヒ
ドロゲナーゼを固定化した直径約5cmのフイルム
を作製した。同様な方法によつて作製したフイル
ム3枚を用い、かつ濃度0.5モル/のL−アラ
ニン水溶液の代りに濃度0.5モル/のピルビン
酸水溶液を用いる以外は実施例1と同様にして菌
の培養、菌体の固定化および反応を行つた。L−
フエニルアラニンの生成速度は0.52マイクロモ
ル/分/g(ミクロコツカス・ルテウスB−5−
4菌株の乾燥菌体)であり、L−フエニルアラニ
ンの生成量は1.5mgであつた。 〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなと
おり、フエニルピルビン酸とアンモニウム塩およ
び/またはアンモニアから高い生成速度かつ好収
量でしかも容易にL−フエニルアラニンを製造す
ることができる
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 フエニルピルビン酸とアミノ基供与体とから
L−フエニルアラニンを生成する能力を有するミ
クロコツカス(Micrococcus)属に属する細菌
を、水素ガス高圧下において、(1)フエニルピルビ
ン酸、(2)アンモニウム塩および/またはアンモニ
ア、(3)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドお
よび/またはその還元型、(4)分子状水素によりニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する
能力を有するアルカリゲネス(Alcaligenes)属
またはクロストリジウム(Clostridium)属に属
する細胞、(5)L−フエニルアラニン以外のアミノ
酸および/またはそのアミノ酸に相応するα−ケ
トカルボン酸ならびに(6)L−フエニルアラニン以
外のアミノ酸のデヒドロゲナーゼを含む水溶液に
作用させることを特徴とするL−フエニルアラニ
ンの製造方法。 2 水素ガスの分圧が10気圧(絶対圧)以上であ
る特許請求の範囲第1項記載の製造方法。 3 細菌がミクロコツカス属ルテウス(luteus)
種に属する細菌である特許請求の範囲第1項記載
の製造方法。 4 ミクロコツカス属に属する細菌、アルカリゲ
ネス属またはクロストリジウム属に属する細菌な
らびにデヒドロゲナーゼがそれぞれ担体に固定化
されている特許請求の範囲第1項記載の製造方
法。 5 L−フエニルアラニン以外のアミノ酸がL−
アラニンである特許請求の範囲第1項記載の製造
方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20233685A JPS6261594A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | L−フエニルアラニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20233685A JPS6261594A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | L−フエニルアラニンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6261594A JPS6261594A (ja) | 1987-03-18 |
JPH0528113B2 true JPH0528113B2 (ja) | 1993-04-23 |
Family
ID=16455855
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20233685A Granted JPS6261594A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | L−フエニルアラニンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6261594A (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
JPS6043390A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-03-07 | ダブリユ−・ア−ル・グレイス・アンド・カンパニ− | アルフア−ケト酸からl−アミノ酸を製造する方法 |
-
1985
- 1985-09-11 JP JP20233685A patent/JPS6261594A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
JPS6043390A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-03-07 | ダブリユ−・ア−ル・グレイス・アンド・カンパニ− | アルフア−ケト酸からl−アミノ酸を製造する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6261594A (ja) | 1987-03-18 |
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