JPS6261594A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニンの製造方法Info
- Publication number
- JPS6261594A JPS6261594A JP20233685A JP20233685A JPS6261594A JP S6261594 A JPS6261594 A JP S6261594A JP 20233685 A JP20233685 A JP 20233685A JP 20233685 A JP20233685 A JP 20233685A JP S6261594 A JPS6261594 A JP S6261594A
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- Japan
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- phenylalanine
- acid
- genus
- bacterial cells
- aqueous solution
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＬ−フェニルアラニンの製造方法に関し、詳し
くはフェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−フ
ェニルアラニンを生成する能力を有するミクロコツカス
（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属にＩＩＩスる細菌を用い
て水素ガス高圧下でフェニルピルビン酸と特定のアミノ
基供与体とからＬ−フェニルアラニンを製造する方法に
関する。
くはフェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−フ
ェニルアラニンを生成する能力を有するミクロコツカス
（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属にＩＩＩスる細菌を用い
て水素ガス高圧下でフェニルピルビン酸と特定のアミノ
基供与体とからＬ−フェニルアラニンを製造する方法に
関する。
本発明の方法によって得られるＬ−フェニルアラニンは
必須アミノ酸の一種として栄養上または医薬用途上！要
な物質でめり、また人工甘味料とＬ テ利用されるα−
Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ル（アスパルテーム）の合成原料としても有用な物質で
ある。
必須アミノ酸の一種として栄養上または医薬用途上！要
な物質でめり、また人工甘味料とＬ テ利用されるα−
Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ル（アスパルテーム）の合成原料としても有用な物質で
ある。
従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用いてフェ
ニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−ｙエニルア
ラニンを製造する方法として、例＆ばＬ−グルタミン酸
とフェニルピルビン酸とからアミノ基転移反応によって
酵素的にＬ−フェニルアラニンを製造する際に、ハイド
ロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素およびアミノ
基転移酵素の各々の酵素活性を有するエシェリヒア鳴、
プロテウス属、クロストリジワム属などに属する細菌の
生菌体、菌体破砕物または抽出液を用いて窒素源の存在
下かつ水素ガス雰囲気下でＬ−グルタミン酸の生成反応
とアミノ基転移反応とをＬ−グルタミン酸を介して基質
共範的に行わしめる方法（特公昭３９−５０１１号公報
および特公昭４０−１９９５号公報参照）が知られてい
る。上記の方法においては水素ガスを反応器中に内圧を
もって保留するかまたは吹込むことができるとされてお
り１具体的には反応器中に０．３ Ｋｔ／−の内圧を維
持するように通気する条件下でＬ−フェニルアラニンを
製造する方法が行われている。
ニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−ｙエニルア
ラニンを製造する方法として、例＆ばＬ−グルタミン酸
とフェニルピルビン酸とからアミノ基転移反応によって
酵素的にＬ−フェニルアラニンを製造する際に、ハイド
ロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素およびアミノ
基転移酵素の各々の酵素活性を有するエシェリヒア鳴、
プロテウス属、クロストリジワム属などに属する細菌の
生菌体、菌体破砕物または抽出液を用いて窒素源の存在
下かつ水素ガス雰囲気下でＬ−グルタミン酸の生成反応
とアミノ基転移反応とをＬ−グルタミン酸を介して基質
共範的に行わしめる方法（特公昭３９−５０１１号公報
および特公昭４０−１９９５号公報参照）が知られてい
る。上記の方法においては水素ガスを反応器中に内圧を
もって保留するかまたは吹込むことができるとされてお
り１具体的には反応器中に０．３ Ｋｔ／−の内圧を維
持するように通気する条件下でＬ−フェニルアラニンを
製造する方法が行われている。
Ｌ−フェニルアラニンを工業的に有利に製造するために
は該Ｌ−フェニルアラニンを充分に高い生成速度で製造
することができる方法を採用することが望ましいが、か
かる観点から上記の従来法はＬ−フェニルアラニンの工
業的な製造方法としては必ずしも適当であるとは言い難
い。
は該Ｌ−フェニルアラニンを充分に高い生成速度で製造
することができる方法を採用することが望ましいが、か
かる観点から上記の従来法はＬ−フェニルアラニンの工
業的な製造方法としては必ずしも適当であるとは言い難
い。
しかして、本発明の目的は培養菌体を用いてフェニルピ
ルビン酸かｌ、Ｌ−フェニルアラニンヲ高い生成速度で
かつ好収量で製造することができる工業的に有利な方法
を提供することにある。
ルビン酸かｌ、Ｌ−フェニルアラニンヲ高い生成速度で
かつ好収量で製造することができる工業的に有利な方法
を提供することにある。
本発明によれば、上記の目的は、フェニルピルビン酸と
アミノ基供与体とからＬ−フェニルアラニンを生成する
能力を有するミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｃａｕ
ｓ ）属に属するＩｊＡ！Ｉを、水素ガス高圧下におい
テ（１）フェニルピルビン酸＊ （”ａ）アンモニウム
塩および／またはアンモニア、（３）ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下これをＮＡＤと称する）お
よび／゛！ｔはＮＡＤＯ遺元型遺風型とれをＮＡＤＨと
称する）、（４）分子状水素によりＮＡＤを還元する能
力を有するアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｓ
）Ｊ／ＡまたはクロストリジウＡ （Ｃｌｏａｔｒｉｄ
ｉｕｍ ）属に属する細ｆＬ（ｓ＞Ｌ−フェニルアラニ
ン以外のアは）酸および／またはそのアミノ酸に相応す
るαニケトカｋｙｌｌン酸ならびに（６） Ｌ−フェニ
ルアラニン以外のアミノ酸のデヒドロゲナーゼを含む水
溶液に作用させることを特徴とするＬ−フェニルアラニ
ンの製造方法を提供することによって達成される。
アミノ基供与体とからＬ−フェニルアラニンを生成する
能力を有するミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｃａｕ
ｓ ）属に属するＩｊＡ！Ｉを、水素ガス高圧下におい
テ（１）フェニルピルビン酸＊ （”ａ）アンモニウム
塩および／またはアンモニア、（３）ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下これをＮＡＤと称する）お
よび／゛！ｔはＮＡＤＯ遺元型遺風型とれをＮＡＤＨと
称する）、（４）分子状水素によりＮＡＤを還元する能
力を有するアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｓ
）Ｊ／ＡまたはクロストリジウＡ （Ｃｌｏａｔｒｉｄ
ｉｕｍ ）属に属する細ｆＬ（ｓ＞Ｌ−フェニルアラニ
ン以外のアは）酸および／またはそのアミノ酸に相応す
るαニケトカｋｙｌｌン酸ならびに（６） Ｌ−フェニ
ルアラニン以外のアミノ酸のデヒドロゲナーゼを含む水
溶液に作用させることを特徴とするＬ−フェニルアラニ
ンの製造方法を提供することによって達成される。
本発明の方法において推定されるし一フェニルアラニン
が生成する反応機構を概念的に次に示す。
が生成する反応機構を概念的に次に示す。
Ｈｚ Ｈ”
アルカリゲネス属または
クロストリジウム属に属する細菌
ミクロコツカス属に属する細菌
このように、本発明の方法によれば３種類の反応の有機
的な組合わせによｊ５Ｌ−フェニルアラニンが効率的に
生成されると推定される。
的な組合わせによｊ５Ｌ−フェニルアラニンが効率的に
生成されると推定される。
本発明の方法において使用するフェニルピルビン酸とア
ミノ基供与体とからＬ−フェニルアラニンを生成する能
力を有するミクロコツカス属に属する細菌としては、例
えばミクロコツカス・ルテウ、ｚ、 （Ｍｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕａ １ｕｔｅｕｓ ） Ｂ −５−４９株（微工
研菌寄第７６６４号）があり、その菌学的性質を列挙す
ると次表のとおりである。
ミノ基供与体とからＬ−フェニルアラニンを生成する能
力を有するミクロコツカス属に属する細菌としては、例
えばミクロコツカス・ルテウ、ｚ、 （Ｍｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕａ １ｕｔｅｕｓ ） Ｂ −５−４９株（微工
研菌寄第７６６４号）があり、その菌学的性質を列挙す
ると次表のとおりである。
（注１）：生理学的性質において、＋、士および−は次
のことを意味する。
のことを意味する。
＋・・・・・・その性質また絋その生成あり士・・・・
・・その性質またはその生成の有無が判定し礫い −・・・・・・その性質またはその生成なしく注２）：
ヒエー・アンド・ライ７ソン培地の炭素源をそれぞれＳ
類１−１５と代え九培地での菌による糖類からの酸の生
成およびガスの発生を観察したものである。
・・その性質またはその生成の有無が判定し礫い −・・・・・・その性質またはその生成なしく注２）：
ヒエー・アンド・ライ７ソン培地の炭素源をそれぞれＳ
類１−１５と代え九培地での菌による糖類からの酸の生
成およびガスの発生を観察したものである。
＋・・・・・・酸の生成またはガスの発生あり±・・・
・・・酸の生成またはガスの発生の有無が判定し態い −・・・・・・酸の生成また社ガスの発生なし上記の表
に示した菌学的性質に基づき、ミクロコツカス・ルテク
スＢ−５−４菌株の同定を行った。ばクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株は球菌であること、運動性がない
こと、ダラム染色が陽性であることなどの顕微鏡的所見
およびカタラーゼ反応が陽性であること、好気性である
ことなどの生理学的性質からパージエイズ・マニュアル
・オプ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇ）第８版に基づき
、ミクロコツカス属に属する細菌であると同定した。さ
らに、この菌株はコミニーが黄色である点ならびにグル
コ−スからの酸の生成およびガスの発生がない点から、
ミクロコツカス属のルテウス種に属する細菌であると同
定した。
・・・酸の生成またはガスの発生の有無が判定し態い −・・・・・・酸の生成また社ガスの発生なし上記の表
に示した菌学的性質に基づき、ミクロコツカス・ルテク
スＢ−５−４菌株の同定を行った。ばクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株は球菌であること、運動性がない
こと、ダラム染色が陽性であることなどの顕微鏡的所見
およびカタラーゼ反応が陽性であること、好気性である
ことなどの生理学的性質からパージエイズ・マニュアル
・オプ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇ）第８版に基づき
、ミクロコツカス属に属する細菌であると同定した。さ
らに、この菌株はコミニーが黄色である点ならびにグル
コ−スからの酸の生成およびガスの発生がない点から、
ミクロコツカス属のルテウス種に属する細菌であると同
定した。
本発明の方法を実施するに際しては、上記のフェニルピ
ルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−フェニルアラニン
を生成する能力を有するミクロコツカス属に属する細菌
を栄養培地で培養し、これによシ得られる画体培養液ま
たはこれよシ分離した生菌体もしくはその乾燥菌体を使
用する。フェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ
−７エニルアラニンを生成する能力を有するミクロコツ
カス属に属する細菌の栄養培地での培養は、−殺微生物
の培養と同様に行われるが、通常は液体培地によろ振盪
培養法または通気攪拌培養法により行われる。栄養培地
としては上記の細菌が資化利用できる栄養源を含有する
ものでろればよい。炭素源としては１例えばグルコース
、サッカロース、ｖル）−ス、ｆリセリン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス１コーンステイーグリカーなどの
１ｔｊｌまたは２櫨以上が、通常的０．１〜５重量−の
濃度で用いられる。また窒素源としては、例えば硫酸ア
ンモニウム、［化アンモニウム、硝酸アンモニウムなど
の無機窒素源、またはペプトン、肉エキスなどの有機窒
素源が用いられる。また、この他にリン酸水素２カリウ
ム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシクムなどの無
機塩類、必要に応じてさらにビタミン類が添加される。
ルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−フェニルアラニン
を生成する能力を有するミクロコツカス属に属する細菌
を栄養培地で培養し、これによシ得られる画体培養液ま
たはこれよシ分離した生菌体もしくはその乾燥菌体を使
用する。フェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ
−７エニルアラニンを生成する能力を有するミクロコツ
カス属に属する細菌の栄養培地での培養は、−殺微生物
の培養と同様に行われるが、通常は液体培地によろ振盪
培養法または通気攪拌培養法により行われる。栄養培地
としては上記の細菌が資化利用できる栄養源を含有する
ものでろればよい。炭素源としては１例えばグルコース
、サッカロース、ｖル）−ス、ｆリセリン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス１コーンステイーグリカーなどの
１ｔｊｌまたは２櫨以上が、通常的０．１〜５重量−の
濃度で用いられる。また窒素源としては、例えば硫酸ア
ンモニウム、［化アンモニウム、硝酸アンモニウムなど
の無機窒素源、またはペプトン、肉エキスなどの有機窒
素源が用いられる。また、この他にリン酸水素２カリウ
ム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシクムなどの無
機塩類、必要に応じてさらにビタミン類が添加される。
なお、上記の細菌のＬ−フェニルアラニン生成能を増強
させるために培地に少量のフェニルピルビン酸’ｔたけ
Ｌ−７二二ルアラ二ンを添加しておくのが好ましいｇ培
養条件に特徴はないが、通常２５〜３７℃の温度でＩ’
ｌ１６〜１１の条件下で約６〜２４時間振盪培養または
通気攪拌培養を行う。培養後、培養液中の菌体は濾過ま
九は遠心分離などにょシ容易に分離でき、分離された生
菌体は常法により乾燥菌体とすることができる。このよ
うにして得られる生菌体また社その乾燥菌体はこれらを
担体に固定化して使用することが好ましい。固定化され
た生菌体およびその乾燥菌体はそれらが有する酵素活性
が長期にわたって維持され易く、また反応混合液から容
易に分離回収され、再使用することができる。
させるために培地に少量のフェニルピルビン酸’ｔたけ
Ｌ−７二二ルアラ二ンを添加しておくのが好ましいｇ培
養条件に特徴はないが、通常２５〜３７℃の温度でＩ’
ｌ１６〜１１の条件下で約６〜２４時間振盪培養または
通気攪拌培養を行う。培養後、培養液中の菌体は濾過ま
九は遠心分離などにょシ容易に分離でき、分離された生
菌体は常法により乾燥菌体とすることができる。このよ
うにして得られる生菌体また社その乾燥菌体はこれらを
担体に固定化して使用することが好ましい。固定化され
た生菌体およびその乾燥菌体はそれらが有する酵素活性
が長期にわたって維持され易く、また反応混合液から容
易に分離回収され、再使用することができる。
担体としては、例えばポリアクリルアミド、カラギーナ
ン、フィブロイン、ゼラチン、コラーゲン、寒天、アル
ギン酸塩、ジエチルアミンエチルセファデックス、ポリ
エチレングリコールまたはボリフ゛ロビレングリコール
のジアクリレートなどをプレポリマーとする光硬化性樹
脂などが便用される。
ン、フィブロイン、ゼラチン、コラーゲン、寒天、アル
ギン酸塩、ジエチルアミンエチルセファデックス、ポリ
エチレングリコールまたはボリフ゛ロビレングリコール
のジアクリレートなどをプレポリマーとする光硬化性樹
脂などが便用される。
生菌体またはその乾燥菌体の担体中における濃度は、乾
燥菌体に換算して担体１ｊに対して通常的１〜１００
ｔ １好適には約５〜５０ｆである。
燥菌体に換算して担体１ｊに対して通常的１〜１００
ｔ １好適には約５〜５０ｆである。
本発明の方法は水素ガス高圧下において実施される。水
素ガスの分圧が高くなるほどＬ−フェニルアラニンの生
成速度が高くなる。水素ガスの分圧は好ましくは１０気
圧（絶対圧）以上、より好ましくは２０気圧（絶対圧）
以上であり、また工業的に効率よくＬ−フェニルアラニ
ンを製造する観点から、さらに好ましくは５０気圧（絶
対圧）以上であり、特に好ましくは８０気圧（絶対圧）
以上である。水素ガス分圧の上限については特に制限さ
れないが、耐圧性の反も器などの製造装置に要する設備
費などを考慮すると水素ガス分圧の上限は通常約２００
気圧（絶対圧）、好適には約１５０気圧（絶対圧）であ
る。
素ガスの分圧が高くなるほどＬ−フェニルアラニンの生
成速度が高くなる。水素ガスの分圧は好ましくは１０気
圧（絶対圧）以上、より好ましくは２０気圧（絶対圧）
以上であり、また工業的に効率よくＬ−フェニルアラニ
ンを製造する観点から、さらに好ましくは５０気圧（絶
対圧）以上であり、特に好ましくは８０気圧（絶対圧）
以上である。水素ガス分圧の上限については特に制限さ
れないが、耐圧性の反も器などの製造装置に要する設備
費などを考慮すると水素ガス分圧の上限は通常約２００
気圧（絶対圧）、好適には約１５０気圧（絶対圧）であ
る。
本発明の方法においてアミノ基供与体として作用するア
ンモニウム塩およびアンモニアは、それぞれ単独でまた
は組合わせて使用される。アミノ基供与体の使用量はフ
ェニルピルビン酸１モルに対して通常約１〜５０モルと
なるような量である。
ンモニウム塩およびアンモニアは、それぞれ単独でまた
は組合わせて使用される。アミノ基供与体の使用量はフ
ェニルピルビン酸１モルに対して通常約１〜５０モルと
なるような量である。
アンモニウム塩としては塩化アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、リン酸水素２アンモニウム、リン酸２水素
アンモニウムなどが用いられる。またＮＡＤおよびＮＡ
ＤＨはそれぞれ単独でまたは組合わせて、その童が水溶
液中での濃度で通常的０．２〜１０ミリモル／ｊとなる
ように使用される。分子状水素によりＮＡＤを還元する
能力を有するアルカリゲネス属に属する細菌としては、
例えばアルカリゲネス・エウトロファス（Ａｌｃａｌｊ
ｇａｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ） Ｈ！ ６９株（Ａ
ＴＣＣ１７６９９）、アルカリゲネス・エウトロファス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ 二郵動二）Ｈ２Ｏ２株（Ａ
ＴＣＣ１７７０７） などが使用され、またクロストリ
ジウム属に属する細菌としては、例えばクロストリジウ
ム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔ）ｙｒ
ｉｃｕｍ ） Ｉ Ｆ ０３８５８菌株、クロストリジ
ウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｎ ） Ｉ ＡＭ１９０１１
薗株、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ａｅｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ） Ｉ
Ａ Ｍ １９０１２菌株、クロストリジウム・アセト
ブチリカム（９ｏｓｔｒｉｄｉ■ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒ
ｉｃｕｍ ） Ｉ Ａ Ｍ １９０１４１株、りｏスト
リジウム令ベルフリンジエンス（Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＩＩＤ５２０菌株などが
使用される。かかるアルカリゲネス属またはクロストリ
ジウム属に属する細菌としては、前述のミクロコツカス
属に属する細菌の場合と同様にして得られる画体培養液
またはこれより分離した生菌体もしくはその乾燥菌体が
用いられる。アルカリゲネス属またはクロストリジウム
属に属する細菌の生菌体またはその乾燥菌体は、ミクロ
コツカス属に属する細菌の場合と同様な方法で担体に固
定化して使用することが好筐しい。生菌体またはその乾
燥１体の担体中における濃度は、乾燥菌体に換算して担
体１ｊに対して通常的１〜１００ｒ、好適には約５〜５
０？である。さらに、本発明の方法ではＬ−フェニルア
ラニン以外のアミノ酸としてし一アラニン、グリシン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アスパラギン酸、
Ｌ−メチオニン、Ｌ−システィンかとが使用され、また
これらのアミノ酸に相応するα−ケトカルボン酸、例え
ばピルビン酸、グリオキサール酸、α−ケトグルタル酸
、６−アミノ−２−オキソヘキサン酸、オキサロ酢酸、
４−メチルチオ−２−オキソ酪酸、メルカプトピルビン
酸などが使用される。かかるアミノ酸のうちＬ−アラニ
ン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシンなどを使
用することが好ましく、またこれらのアばノ酸に相応す
るピルビン酸、グリオキサール酸、α−ケトグルタル酸
、６−アミノ−２−オキソヘキサン酸などのα−ケトカ
ルボン酸を使用すルピン酸をそれぞれ単独でまたは組合
わせて使用するととが特に好ましい。上記のアミノ酸お
よびα−ケトカルボン酸はそれぞれ単独でまたは組合わ
せて、その量がフェニルピルビン酸の１モルに対して通
常的０．１〜１０モルの割合、好ましくは約０．５〜７
モルの割合となるように使用される。
ニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、リン酸水素２アンモニウム、リン酸２水素
アンモニウムなどが用いられる。またＮＡＤおよびＮＡ
ＤＨはそれぞれ単独でまたは組合わせて、その童が水溶
液中での濃度で通常的０．２〜１０ミリモル／ｊとなる
ように使用される。分子状水素によりＮＡＤを還元する
能力を有するアルカリゲネス属に属する細菌としては、
例えばアルカリゲネス・エウトロファス（Ａｌｃａｌｊ
ｇａｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ） Ｈ！ ６９株（Ａ
ＴＣＣ１７６９９）、アルカリゲネス・エウトロファス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ 二郵動二）Ｈ２Ｏ２株（Ａ
ＴＣＣ１７７０７） などが使用され、またクロストリ
ジウム属に属する細菌としては、例えばクロストリジウ
ム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔ）ｙｒ
ｉｃｕｍ ） Ｉ Ｆ ０３８５８菌株、クロストリジ
ウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｎ ） Ｉ ＡＭ１９０１１
薗株、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ａｅｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ） Ｉ
Ａ Ｍ １９０１２菌株、クロストリジウム・アセト
ブチリカム（９ｏｓｔｒｉｄｉ■ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒ
ｉｃｕｍ ） Ｉ Ａ Ｍ １９０１４１株、りｏスト
リジウム令ベルフリンジエンス（Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＩＩＤ５２０菌株などが
使用される。かかるアルカリゲネス属またはクロストリ
ジウム属に属する細菌としては、前述のミクロコツカス
属に属する細菌の場合と同様にして得られる画体培養液
またはこれより分離した生菌体もしくはその乾燥菌体が
用いられる。アルカリゲネス属またはクロストリジウム
属に属する細菌の生菌体またはその乾燥菌体は、ミクロ
コツカス属に属する細菌の場合と同様な方法で担体に固
定化して使用することが好筐しい。生菌体またはその乾
燥１体の担体中における濃度は、乾燥菌体に換算して担
体１ｊに対して通常的１〜１００ｒ、好適には約５〜５
０？である。さらに、本発明の方法ではＬ−フェニルア
ラニン以外のアミノ酸としてし一アラニン、グリシン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アスパラギン酸、
Ｌ−メチオニン、Ｌ−システィンかとが使用され、また
これらのアミノ酸に相応するα−ケトカルボン酸、例え
ばピルビン酸、グリオキサール酸、α−ケトグルタル酸
、６−アミノ−２−オキソヘキサン酸、オキサロ酢酸、
４−メチルチオ−２−オキソ酪酸、メルカプトピルビン
酸などが使用される。かかるアミノ酸のうちＬ−アラニ
ン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシンなどを使
用することが好ましく、またこれらのアばノ酸に相応す
るピルビン酸、グリオキサール酸、α−ケトグルタル酸
、６−アミノ−２−オキソヘキサン酸などのα−ケトカ
ルボン酸を使用すルピン酸をそれぞれ単独でまたは組合
わせて使用するととが特に好ましい。上記のアミノ酸お
よびα−ケトカルボン酸はそれぞれ単独でまたは組合わ
せて、その量がフェニルピルビン酸の１モルに対して通
常的０．１〜１０モルの割合、好ましくは約０．５〜７
モルの割合となるように使用される。
本発明の方法で使用されるＬ−フェニルアラニン以外の
上記のアミノ酸のデヒドロゲナーゼの種類は使用するＬ
−フェニルアラニン以外のアミノ酸およびそれに相応す
るα−ケトカルボン酸の［類に応じて異なる。例えば、
Ｌ−アラニンまたはピルビン酸を用いる場合にはアラニ
ン−デヒドロゲナーゼが使用され、またＬ−グルタミン
酸ま九はα−ケトグルタル酸を用いる場合にはグルタミ
ン酸−デヒドロゲナーゼが使用される。デヒドロゲナー
ゼとしてはＬ−フェニルアラニン以外のアミノ酸に相応
するα−ケトカルボン酸を還元アミ゛）化してアミノ酸
を生成する能力を有するものであればよく、その起源、
純度などは特に限定されることなく容易に入手できる公
知の動植物のホモジネート、微生物一体、その破砕物、
抽出物などに含まれるデヒドロゲナーゼを用いることが
できる。
上記のアミノ酸のデヒドロゲナーゼの種類は使用するＬ
−フェニルアラニン以外のアミノ酸およびそれに相応す
るα−ケトカルボン酸の［類に応じて異なる。例えば、
Ｌ−アラニンまたはピルビン酸を用いる場合にはアラニ
ン−デヒドロゲナーゼが使用され、またＬ−グルタミン
酸ま九はα−ケトグルタル酸を用いる場合にはグルタミ
ン酸−デヒドロゲナーゼが使用される。デヒドロゲナー
ゼとしてはＬ−フェニルアラニン以外のアミノ酸に相応
するα−ケトカルボン酸を還元アミ゛）化してアミノ酸
を生成する能力を有するものであればよく、その起源、
純度などは特に限定されることなく容易に入手できる公
知の動植物のホモジネート、微生物一体、その破砕物、
抽出物などに含まれるデヒドロゲナーゼを用いることが
できる。
かかるデヒドロゲナーゼは水溶液中における濃度が通常
約１〜２００単位／ｄとなるように使用される。デヒド
ロゲナーゼは担体に固定化して使用することが好ましい
。この固定化はミクロコツカス属に１ｇ４する細菌の場
合と同様な方法で行うことができる。デヒドロゲナーゼ
の担体中における濃度は、通常約１〜１００単位／Ａ（
担体）である。
約１〜２００単位／ｄとなるように使用される。デヒド
ロゲナーゼは担体に固定化して使用することが好ましい
。この固定化はミクロコツカス属に１ｇ４する細菌の場
合と同様な方法で行うことができる。デヒドロゲナーゼ
の担体中における濃度は、通常約１〜１００単位／Ａ（
担体）である。
この反応は…約６〜１０の条件下で行うのが好ましい。
この反応系の田値は約７〜９の範囲内であることが好ま
しく、特に約７．５〜８．５の範囲内であることが好ま
しい。反応系のｍｆ［を調整するために、トリス１１衝
液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリシン緩衝液な
どの緩衝液；塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸；ギ酸、
酢酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸
；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム
、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム
などのアルカリ金属またはアルカリゲネス属の水酸化物
または炭酸塩；アンモニア；トリエチルアミンなどのア
ミンなどを反応系に添加することができ、なかでも緩衝
液を添加することが好ましい。反応温度は通常的２０〜
５０℃、好ましくは約３０〜４０℃である。
しく、特に約７．５〜８．５の範囲内であることが好ま
しい。反応系のｍｆ［を調整するために、トリス１１衝
液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリシン緩衝液な
どの緩衝液；塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸；ギ酸、
酢酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸
；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム
、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム
などのアルカリ金属またはアルカリゲネス属の水酸化物
または炭酸塩；アンモニア；トリエチルアミンなどのア
ミンなどを反応系に添加することができ、なかでも緩衝
液を添加することが好ましい。反応温度は通常的２０〜
５０℃、好ましくは約３０〜４０℃である。
反応終了後、反応液中の菌体を濾過又は遠心分離などに
よシ分離除去し、得られた濾液又は上清からイオン交換
樹脂法、晶析法などによシ、上記の反応液中に蓄積され
たＬ−フェニルアラニンを分離取得することができる。
よシ分離除去し、得られた濾液又は上清からイオン交換
樹脂法、晶析法などによシ、上記の反応液中に蓄積され
たＬ−フェニルアラニンを分離取得することができる。
以下、実施例によシ本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例によシ限定されるものではない０ 実施例１ ペプトン０．５Ｆ、肉エキス０．５ｆ１食塩０．５ｆお
よびフェニルピルビン酸０．３２を純水に溶解し、１規
定の水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより…７．
２に調整したのち純水をさらに加えることによって容積
を１００ＪＩｊにした。この培地５０ｄを５００ｄ容坂
ロフラスコに入れ、１１０℃で１０分間、蒸気殺菌を行
った。上記の坂ロフラスコ中の培地にミクロコツカス・
ルテウスＢ−５−４１１１Ｉ株を植菌し、３５℃で１５
時間培養した。培養後、培養液から菌体を遠心分離し、
生理食塩水で洗浄した。
らの実施例によシ限定されるものではない０ 実施例１ ペプトン０．５Ｆ、肉エキス０．５ｆ１食塩０．５ｆお
よびフェニルピルビン酸０．３２を純水に溶解し、１規
定の水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより…７．
２に調整したのち純水をさらに加えることによって容積
を１００ＪＩｊにした。この培地５０ｄを５００ｄ容坂
ロフラスコに入れ、１１０℃で１０分間、蒸気殺菌を行
った。上記の坂ロフラスコ中の培地にミクロコツカス・
ルテウスＢ−５−４１１１Ｉ株を植菌し、３５℃で１５
時間培養した。培養後、培養液から菌体を遠心分離し、
生理食塩水で洗浄した。
上記のようにして得られたミクロコツカス・ルテウスＢ
−５−４Ｗ株の菌体（乾燥菌体に換算してｘ、ｓｒ）を
濃度０．０５モル／ｌのトリス−塩酸緩衝液（ＦＨ７，
３）５０ｄＫＩｌ！濁した。この菌体懸濁液を濃度４重
量％のアルギン酸ナトリウム水溶液５０ｇｇと混合した
のち、この混合液を濃度０．１モル／ｊの塩化カルシウ
ム水溶液中に滴下することによってビーズ型（直径約ａ
ｍ）に成型した。
−５−４Ｗ株の菌体（乾燥菌体に換算してｘ、ｓｒ）を
濃度０．０５モル／ｌのトリス−塩酸緩衝液（ＦＨ７，
３）５０ｄＫＩｌ！濁した。この菌体懸濁液を濃度４重
量％のアルギン酸ナトリウム水溶液５０ｇｇと混合した
のち、この混合液を濃度０．１モル／ｊの塩化カルシウ
ム水溶液中に滴下することによってビーズ型（直径約ａ
ｍ）に成型した。
リン酸水素２カリウム０．４４９１ リン酸２水素カリ
ウム０．１５９および塩化アンモニウム０．１２を純水
に溶解して容積を１００ ｍｌにし、この溶液を５００
ｄ容坂ロフラスコに入れ、１１０℃で１０分間蒸気殺菌
を行った。上記の坂ロフラスコ中の溶液に滅菌処理を施
した（１）濃度２０重量％の硫酸マグネシウム水溶液０
．１ ｄ、 （２）塩化カルシウム・２水和物１０．：
Ｍ、塩化鉄（Ｉ）６水和物１６．２ｆ。
ウム０．１５９および塩化アンモニウム０．１２を純水
に溶解して容積を１００ ｍｌにし、この溶液を５００
ｄ容坂ロフラスコに入れ、１１０℃で１０分間蒸気殺菌
を行った。上記の坂ロフラスコ中の溶液に滅菌処理を施
した（１）濃度２０重量％の硫酸マグネシウム水溶液０
．１ ｄ、 （２）塩化カルシウム・２水和物１０．：
Ｍ、塩化鉄（Ｉ）６水和物１６．２ｆ。
塩化ニッケル（■）６水和物１１８ｑ、塩化クロム（１
）６水和物１１３η、硫酸鋼（■）５水和物１００■お
よびクエン［１５，６ｆを純水で溶解して得られた１０
００ｄの溶液のうちの０．１ｄならびに（３）濃度１５
ｉ１％のフラクトース水溶液２Ｒ１をそれぞれ加えた。
）６水和物１１３η、硫酸鋼（■）５水和物１００■お
よびクエン［１５，６ｆを純水で溶解して得られた１０
００ｄの溶液のうちの０．１ｄならびに（３）濃度１５
ｉ１％のフラクトース水溶液２Ｒ１をそれぞれ加えた。
この培地５０ａｌを５００ ｄ容坂ロフラスコに入れ、
それにアルカリゲネス・エウトロファスＨ１６ｆｉ株を
植菌したのち３０℃で２０時間培養した。培養後、培養
液から菌体を遠心分離【７、生理食塩水で洗浄した。
それにアルカリゲネス・エウトロファスＨ１６ｆｉ株を
植菌したのち３０℃で２０時間培養した。培養後、培養
液から菌体を遠心分離【７、生理食塩水で洗浄した。
上記のようにして得られたアルカリゲネス・エウトロフ
ァスＨ１６菌株の菌体（乾燥菌体に換算してｏ、ｓｐ）
を濃度Ｏ，ＯＳモル／Ｊのトリス−塩酸緩衝液（Ｐｉ（
７，３） ５０ＩＩＬＩＫ＠濁した。この菌体懸濁液を
ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４［株の菌体の固定
化と同様な方法で処理してアルカリゲネス・エウトロ７
アスＨ１６１株の菌体の固定化を行った。
ァスＨ１６菌株の菌体（乾燥菌体に換算してｏ、ｓｐ）
を濃度Ｏ，ＯＳモル／Ｊのトリス−塩酸緩衝液（Ｐｉ（
７，３） ５０ＩＩＬＩＫ＠濁した。この菌体懸濁液を
ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４［株の菌体の固定
化と同様な方法で処理してアルカリゲネス・エウトロ７
アスＨ１６１株の菌体の固定化を行った。
ゼラチン０．１１を濃度Ｏ，ＯＳモル／ｊのトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，３）１ｔ／に加熱下に溶解させたの
ち１１０℃で１０分間蒸気殺菌した。このゼラチン溶液
にパシルス・スブチリス（勤且■四蝕且ｂ）種に属する
細菌起源のアラニン−デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー
・マンハイム社製Ｌ−アラニン脱水素酵素） ０．８
”ｆと濃度Ｏ，ＯＳモル／１のトリス−塩酸緩衝液（Ｆ
ＩＩ７．３）ｌｄとからなる溶液を加え、テフロン膜上
に円形に展開したのち冷却下に凝固させ、室温下で１晩
乾燥させた。
酸緩衝液（ｐＨ７，３）１ｔ／に加熱下に溶解させたの
ち１１０℃で１０分間蒸気殺菌した。このゼラチン溶液
にパシルス・スブチリス（勤且■四蝕且ｂ）種に属する
細菌起源のアラニン−デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー
・マンハイム社製Ｌ−アラニン脱水素酵素） ０．８
”ｆと濃度Ｏ，ＯＳモル／１のトリス−塩酸緩衝液（Ｆ
ＩＩ７．３）ｌｄとからなる溶液を加え、テフロン膜上
に円形に展開したのち冷却下に凝固させ、室温下で１晩
乾燥させた。
これを濃度１．２５重ｔ％のグルタルアルデヒド水溶液
中に３分間浸漬したのち濃度０．０５モル／Ｉのトリス
−塩酸緩衝液（Ｆ４４７．３）で洗浄することによって
直径約５１の円形のフィルムを得た（酵素の有効ｊ１１
６．８単位）。
中に３分間浸漬したのち濃度０．０５モル／Ｉのトリス
−塩酸緩衝液（Ｆ４４７．３）で洗浄することによって
直径約５１の円形のフィルムを得た（酵素の有効ｊ１１
６．８単位）。
上記のようにして得られたミクロコツカス・ルテウスＢ
−５−４菌株の菌体を固定化したビーズ１、５ ｍ （
含有されている菌体は乾燥菌体に換算して３０ＩＩＦ）
、アルカリゲネス・エウトロファスＨ１ＧＦＩｉ株の菌
体を固定化し九ビーズ１．５ ａＡ（含有されている菌
体は乾燥菌体に換算して１０′ｑ）およびアラニン−デ
ヒドロゲナーゼを固定化したフィルム（酵素の有効量１
６．８単位）を濃度０．１モル／１のフェニルピルビン
酸水浴液０．５ｄ、濃度０．５モル／ＪｃＤＬ−７２ニ
ン水溶液０．５１１Ｅ／、濃度１モル／ｊの塩化アンモ
ニウム水溶液０．８ｔ／、ＮＡＤｏ、５３ ｆ （０，
８ミリモル）および濃度０．０５モル／Ｊのトリス−塩
酸緩衝液（Ｆ４（７，３）２．２ｗＬｌとともに内容２
５ｄのステンレス製高圧反応器中に仕込んだ。反応器内
の雰囲気を水素ガスによって置換したのち水素ガスで１
００気圧（絶対圧）に加圧した。かかる水素ガスの圧力
を１００気圧（絶対圧）Ｋ１反応温度を３７℃にそれぞ
れ維持しながら１０時間反応を行った。反応中において
反応液の微量を経時的に抜き取り、それを液体クロマト
グラフィーで分析した結果、Ｌ−フェニルアラニンの生
成速度は０．５７マイクロモル／分／？（ミクロコツカ
ス・ルテウスＢ−ｓ−４Ｗｉ株の乾燥菌体）であること
が判明した。反応終了後、反応液中のし一フェニルアラ
ニンを液体クロマトグラフィーにより定量したところ、
Ｌ−フェニルアラニンの生成量は１．７ｑであった。
−５−４菌株の菌体を固定化したビーズ１、５ ｍ （
含有されている菌体は乾燥菌体に換算して３０ＩＩＦ）
、アルカリゲネス・エウトロファスＨ１ＧＦＩｉ株の菌
体を固定化し九ビーズ１．５ ａＡ（含有されている菌
体は乾燥菌体に換算して１０′ｑ）およびアラニン−デ
ヒドロゲナーゼを固定化したフィルム（酵素の有効量１
６．８単位）を濃度０．１モル／１のフェニルピルビン
酸水浴液０．５ｄ、濃度０．５モル／ＪｃＤＬ−７２ニ
ン水溶液０．５１１Ｅ／、濃度１モル／ｊの塩化アンモ
ニウム水溶液０．８ｔ／、ＮＡＤｏ、５３ ｆ （０，
８ミリモル）および濃度０．０５モル／Ｊのトリス−塩
酸緩衝液（Ｆ４（７，３）２．２ｗＬｌとともに内容２
５ｄのステンレス製高圧反応器中に仕込んだ。反応器内
の雰囲気を水素ガスによって置換したのち水素ガスで１
００気圧（絶対圧）に加圧した。かかる水素ガスの圧力
を１００気圧（絶対圧）Ｋ１反応温度を３７℃にそれぞ
れ維持しながら１０時間反応を行った。反応中において
反応液の微量を経時的に抜き取り、それを液体クロマト
グラフィーで分析した結果、Ｌ−フェニルアラニンの生
成速度は０．５７マイクロモル／分／？（ミクロコツカ
ス・ルテウスＢ−ｓ−４Ｗｉ株の乾燥菌体）であること
が判明した。反応終了後、反応液中のし一フェニルアラ
ニンを液体クロマトグラフィーにより定量したところ、
Ｌ−フェニルアラニンの生成量は１．７ｑであった。
実施例２
実施例１において反応器内の水素ガスの圧力を２０気圧
（絶対圧）に維持して反応を行う以外は実施例１と同様
にして菌の培養、菌体およびアラニン−デヒドロゲナー
ゼの固定化ならびに反応を行った。Ｌ−フェニルアラニ
ンの生成速度は０．２８マイクロモル／分／ｆ（ミクロ
コッカス−ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であり
、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は０．８３’ｆであっ
た。
（絶対圧）に維持して反応を行う以外は実施例１と同様
にして菌の培養、菌体およびアラニン−デヒドロゲナー
ゼの固定化ならびに反応を行った。Ｌ−フェニルアラニ
ンの生成速度は０．２８マイクロモル／分／ｆ（ミクロ
コッカス−ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であり
、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は０．８３’ｆであっ
た。
比較例
実施例１において反応器内の水素ガスの圧力を１．３気
圧（絶対圧）に維持して反応を行う以外は実施例１と同
様にして菌の培養、菌体およびアラニン−デヒドロゲナ
ーゼの固定化ならびに反応を行った。Ｌ−フェニルアラ
ニンの生成速度は０．１３マイクロモル／分／ｆ＜ミク
ロコツカス・ルテウスＢ−５−４１１株の乾燥菌体）で
あり、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は０．３８岬であ
った。
圧（絶対圧）に維持して反応を行う以外は実施例１と同
様にして菌の培養、菌体およびアラニン−デヒドロゲナ
ーゼの固定化ならびに反応を行った。Ｌ−フェニルアラ
ニンの生成速度は０．１３マイクロモル／分／ｆ＜ミク
ロコツカス・ルテウスＢ−５−４１１株の乾燥菌体）で
あり、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は０．３８岬であ
った。
実施例３
実施例１において高圧反応器中に濃度１モル／１の塩化
アンモニウム水溶液０．８−の代りに濃度１モル／Ｉの
酢酸アンモニウム水溶液０．８ ｍｌを仕込み、またＮ
ＡＤｏ、５３ ｆ （０，８ｉ Ｌ％ル）Ｏ代シにＮＡ
ＤＨｏ、５３ ｆ （０，８ミリモル）を仕込む以外は
実施例１と同様にして菌の培養、菌体およびアラニン−
デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を行った。Ｌ−
フェニルアラニンの生成速度は０．６２マイクロモル／
分／ｆ（ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の乾
燥菌体）であシ、Ｌ−、エニルアラニンの生成量は１．
８４であっ九実施例４ ミクロコツカス会ルテウスＢ−５−４１１株およびアル
カリゲネス・エウトロファスＨ１６菌株を実施例１と同
様にしてそれぞれ培養したのちに得られた菌体ならびに
アラニンーデヒドロゲナーゼを固定化することなく高圧
反応器に仕込み、かつＮＡＤの代シＫＮＡＤＨ０，５３
ｔ （，０，８ミリモル）を仕込む以外は実施Ｐ１１と
同様にして反応を行つ九。Ｌ−フェニルアラニンの生成
速度は０．４７マイクロモル／分／ｌ（ミクロツカス嗜
ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であシ、Ｌ−フェ
ニルアラニンの生成量は１．４ ｍｌＰであった。
アンモニウム水溶液０．８−の代りに濃度１モル／Ｉの
酢酸アンモニウム水溶液０．８ ｍｌを仕込み、またＮ
ＡＤｏ、５３ ｆ （０，８ｉ Ｌ％ル）Ｏ代シにＮＡ
ＤＨｏ、５３ ｆ （０，８ミリモル）を仕込む以外は
実施例１と同様にして菌の培養、菌体およびアラニン−
デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を行った。Ｌ−
フェニルアラニンの生成速度は０．６２マイクロモル／
分／ｆ（ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の乾
燥菌体）であシ、Ｌ−、エニルアラニンの生成量は１．
８４であっ九実施例４ ミクロコツカス会ルテウスＢ−５−４１１株およびアル
カリゲネス・エウトロファスＨ１６菌株を実施例１と同
様にしてそれぞれ培養したのちに得られた菌体ならびに
アラニンーデヒドロゲナーゼを固定化することなく高圧
反応器に仕込み、かつＮＡＤの代シＫＮＡＤＨ０，５３
ｔ （，０，８ミリモル）を仕込む以外は実施Ｐ１１と
同様にして反応を行つ九。Ｌ−フェニルアラニンの生成
速度は０．４７マイクロモル／分／ｌ（ミクロツカス嗜
ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であシ、Ｌ−フェ
ニルアラニンの生成量は１．４ ｍｌＰであった。
実施例５
ミクロコツカス轡ルテウスＢ−５−４菌株およびアルカ
リゲネス・エウトロ７アスＨ１６菌株を実施例１と同様
にして培養したのち、それぞれの菌体を得た。ミクロコ
ツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換
算して１．５Ｆ）を濃度０．１モル／Ｊのリン酸緩衝液
（ｐＨ７，３）５０ｄＫ懸濁させた。この菌体懸濁液を
濃度４重量％の寒天水溶液５０ｄと混合したのち０℃に
冷却することによって凝固させ、それを小片（−辺の長
さが約５ｍＯ立方体）に切断し、濃度０．１モル／ｊの
リン酸緩衝液中で保存し九〇また、アルカリゲネスＣエ
クトロ７アスＨ１６Ｉ１株の菌体（乾燥菌体に換算して
０．５９）を濃度０．１モル／Ｊのリン酸緩衝液（ＰＨ
７，３） ５０ａｔに懸濁させたのち、同様にしてアル
カリゲネス・エウトロファスＨ１６菌株の菌体を寒天中
に固定化した。
リゲネス・エウトロ７アスＨ１６菌株を実施例１と同様
にして培養したのち、それぞれの菌体を得た。ミクロコ
ツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換
算して１．５Ｆ）を濃度０．１モル／Ｊのリン酸緩衝液
（ｐＨ７，３）５０ｄＫ懸濁させた。この菌体懸濁液を
濃度４重量％の寒天水溶液５０ｄと混合したのち０℃に
冷却することによって凝固させ、それを小片（−辺の長
さが約５ｍＯ立方体）に切断し、濃度０．１モル／ｊの
リン酸緩衝液中で保存し九〇また、アルカリゲネスＣエ
クトロ７アスＨ１６Ｉ１株の菌体（乾燥菌体に換算して
０．５９）を濃度０．１モル／Ｊのリン酸緩衝液（ＰＨ
７，３） ５０ａｔに懸濁させたのち、同様にしてアル
カリゲネス・エウトロファスＨ１６菌株の菌体を寒天中
に固定化した。
アラニン−デヒドロゲナーゼの代シにウシの肝臓（Ｂｏ
ｖｉｎｅ １ｉｖｅｒ ） 起源のグルタミン酸−デ
ヒドロゲナーゼ〔シグマ社＃Ｌ−グルタミン酸−デヒト
ロゲｆ −−ｔ／ （Ｌ −Ｇｌｕｔａｍｉｃ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ） ０２００９）０．８１１Ｆ
（３２単位）を用いる以外は実施例１と同様にしてグル
タミ／酸−デヒドロゲナーゼをアルギン酸塩中に固定化
した（酵素の有効量２２単位）。
ｖｉｎｅ １ｉｖｅｒ ） 起源のグルタミン酸−デ
ヒドロゲナーゼ〔シグマ社＃Ｌ−グルタミン酸−デヒト
ロゲｆ −−ｔ／ （Ｌ −Ｇｌｕｔａｍｉｃ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ） ０２００９）０．８１１Ｆ
（３２単位）を用いる以外は実施例１と同様にしてグル
タミ／酸−デヒドロゲナーゼをアルギン酸塩中に固定化
した（酵素の有効量２２単位）。
上記のようにして得られた固定化されたミクロコツカス
・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
３０ｖ）、アルカリゲネス、エウトロ７アスＨ１６菌株
の菌体（乾燥菌体に換算して１ＯｊＩＦ）およびグルタ
ミン酸−デヒドロゲナーゼ（酵素の有効量２２単位）を
濃度０．１モル／ｌのフェニルピルビン酸水溶液０．５
ｘ＃、濃度０．５モル／ノのＬ−グルタばン酸水溶液０
．５ｙｊ、濃度０．５モル／Ｊの硫酸アンモニウム水溶
液０．８ｘ＃、ＮＡＤｏ、５３Ｆ（０，８ミリモル）お
よび濃度０．０５モル／Ｊのリン酸緩衝液（Ｆ４（７，
３）２．２ｍとともに内容Ｑ５ｄのステンレス製高圧反
応器中に仕込み、実施例１と同様にして反応を行った。
・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
３０ｖ）、アルカリゲネス、エウトロ７アスＨ１６菌株
の菌体（乾燥菌体に換算して１ＯｊＩＦ）およびグルタ
ミン酸−デヒドロゲナーゼ（酵素の有効量２２単位）を
濃度０．１モル／ｌのフェニルピルビン酸水溶液０．５
ｘ＃、濃度０．５モル／ノのＬ−グルタばン酸水溶液０
．５ｙｊ、濃度０．５モル／Ｊの硫酸アンモニウム水溶
液０．８ｘ＃、ＮＡＤｏ、５３Ｆ（０，８ミリモル）お
よび濃度０．０５モル／Ｊのリン酸緩衝液（Ｆ４（７，
３）２．２ｍとともに内容Ｑ５ｄのステンレス製高圧反
応器中に仕込み、実施例１と同様にして反応を行った。
Ｌ−フェニルアラニンの生成速度は０．５０マイクロモ
ル／分／ｆ（−ｆクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌
株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フェニルアラニンの生成量
は１．５ ’ＩＰであった。
ル／分／ｆ（−ｆクロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌
株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フェニルアラニンの生成量
は１．５ ’ＩＰであった。
実施例６
グルコース１ｆ１ペプトン０．４ｆ、肉エキス０２ｔ１
酵母エキス０．４ｔ、 リン酸水素２カリクム１．２
５Ｍおよび硫酸鉄（Ｉｆ）０．Ｏｓｒを純水に溶解した
のち１規定の塩酸で州を７．ＯＫ調整し、純水をさらに
加えることによって容積を１００ｇ１ＫＬ九。この培地
５０ｄを５００ｄ容坂ロフラスコに入れ、１１０℃で１
０分間蒸気殺菌ののちクロストリジウム・ブチリカムＩ
ＦＯ３８５８菌株を植菌し、嫌気性条件下において３
７℃で１０時間培養した。得られたクロストリジウム・
ブチリカムＩＦ０３８５８菌株の菌体（乾燥菌体に換算
して０．５２）を濃度０．０５モル／Ｉのトリス−塩酸
緩衝液（田７．３）５０ｍｌに懸濁し九。この菌体懸濁
液を濃度４重１ｉチのアルギン酸ナトリウム水溶液５０
ｄと混合したのち、この混合液を濃度０．１モル／ｊの
塩化カルシウム水溶液中に滴下することによってビーズ
型（直径約ａｕ）に成型した。
酵母エキス０．４ｔ、 リン酸水素２カリクム１．２
５Ｍおよび硫酸鉄（Ｉｆ）０．Ｏｓｒを純水に溶解した
のち１規定の塩酸で州を７．ＯＫ調整し、純水をさらに
加えることによって容積を１００ｇ１ＫＬ九。この培地
５０ｄを５００ｄ容坂ロフラスコに入れ、１１０℃で１
０分間蒸気殺菌ののちクロストリジウム・ブチリカムＩ
ＦＯ３８５８菌株を植菌し、嫌気性条件下において３
７℃で１０時間培養した。得られたクロストリジウム・
ブチリカムＩＦ０３８５８菌株の菌体（乾燥菌体に換算
して０．５２）を濃度０．０５モル／Ｉのトリス−塩酸
緩衝液（田７．３）５０ｍｌに懸濁し九。この菌体懸濁
液を濃度４重１ｉチのアルギン酸ナトリウム水溶液５０
ｄと混合したのち、この混合液を濃度０．１モル／ｊの
塩化カルシウム水溶液中に滴下することによってビーズ
型（直径約ａｕ）に成型した。
実施例１と同様にしてミクロコツカス・ルテウスＢ−５
−４菌株の培養、それによって得られ念菌体の固定化お
よびアラ二／−デヒドロゲナーゼの固定化を行った。
−４菌株の培養、それによって得られ念菌体の固定化お
よびアラ二／−デヒドロゲナーゼの固定化を行った。
上記のようにして得られた固定化されたミクロコツカス
・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
３０■）、クロストリジウム・ブチリカムＩＦ０３８５
８１株の菌体（乾燥菌体に換算して１０■）およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼ（酵素の有効量１６．８単位）
を用いる以外は実施例１と同様にして反応を行つ九。Ｌ
−フェニルアラニンの生成速度は０．５０マイクロモル
／分／２（ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４１１株
の乾燥菌体）であり、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は
１．５１ＪＰであった。
・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
３０■）、クロストリジウム・ブチリカムＩＦ０３８５
８１株の菌体（乾燥菌体に換算して１０■）およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼ（酵素の有効量１６．８単位）
を用いる以外は実施例１と同様にして反応を行つ九。Ｌ
−フェニルアラニンの生成速度は０．５０マイクロモル
／分／２（ミクロコツカス・ルテウスＢ−５−４１１株
の乾燥菌体）であり、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は
１．５１ＪＰであった。
実施“【ダｊ７
実施例１と同僚に培養して得られたミクロコツカス・ル
テウスＢ−５−４菌株の菌体を実施例５と同様にして寒
天中に固定化した。実施例６と同様に培養して得られた
クロストリジウム・ブチリカムＩ Ｆ０３８５８０３８
５８菌乾燥菌体に換算して０５９）を濃度０．１モル／
ｊのリン酸緩衝液（…７．３）５０！！Ｌｌに懸濁させ
たのち、アルカリゲネス・エウトロファスＨ１６菌株の
菌体の代シにクロストリジウム・ブチリカムＩ Ｆｏ
３８５８菌株の菌体を用いる以外は実施例５と同様にし
て菌体を寒天中に固定化した。実施例１と同様にしてア
ラニン−デヒドロゲナーゼの固定化を行った。
テウスＢ−５−４菌株の菌体を実施例５と同様にして寒
天中に固定化した。実施例６と同様に培養して得られた
クロストリジウム・ブチリカムＩ Ｆ０３８５８０３８
５８菌乾燥菌体に換算して０５９）を濃度０．１モル／
ｊのリン酸緩衝液（…７．３）５０！！Ｌｌに懸濁させ
たのち、アルカリゲネス・エウトロファスＨ１６菌株の
菌体の代シにクロストリジウム・ブチリカムＩ Ｆｏ
３８５８菌株の菌体を用いる以外は実施例５と同様にし
て菌体を寒天中に固定化した。実施例１と同様にしてア
ラニン−デヒドロゲナーゼの固定化を行った。
上記のようにして得られた固定化されたミクロコツカス
・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
３０■）、クロストリジウム・ブチリカムＩＦ０３８５
８菌株の菌体（乾燥菌体に換算して１０〜）およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼ（酵素の有効量１６．８単位）
を、濃度０．１モル／ｊのフェニルピルビン酸水溶液０
．５ｄ、濃度０．５モル／ＪのＬ−アラニン水溶液０．
５ ｔ／％濃度１モル／１のアンモニア水溶液０．８ｄ
、ＮＡＤｏ、５３Ｆ（０，８ミリモル）および濃度０．
０５モル／ｊのリン酸緩衝液（ＰＨ７，３）２．２ｓＥ
／とともに内容２５ｄのステンレス製高圧反応器中に仕
込んだ。反応器内の雰囲気を水素ガスで置換したのち水
素ガスで８０気圧（絶対圧）に加圧し、水素ガスの圧力
を８０気圧（絶対圧）に、反志温度を３７℃にそれぞれ
維持しながら１０時間反応を行った。Ｌ−フェニルアラ
ニンの生成速度は０．４５マイクロモル／分／Ｐ＜ミク
ロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であ
シ、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は１．３１１ＩＰで
あった。
・ルテウスＢ−５−４菌株の菌体（乾燥菌体に換算して
３０■）、クロストリジウム・ブチリカムＩＦ０３８５
８菌株の菌体（乾燥菌体に換算して１０〜）およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼ（酵素の有効量１６．８単位）
を、濃度０．１モル／ｊのフェニルピルビン酸水溶液０
．５ｄ、濃度０．５モル／ＪのＬ−アラニン水溶液０．
５ ｔ／％濃度１モル／１のアンモニア水溶液０．８ｄ
、ＮＡＤｏ、５３Ｆ（０，８ミリモル）および濃度０．
０５モル／ｊのリン酸緩衝液（ＰＨ７，３）２．２ｓＥ
／とともに内容２５ｄのステンレス製高圧反応器中に仕
込んだ。反応器内の雰囲気を水素ガスで置換したのち水
素ガスで８０気圧（絶対圧）に加圧し、水素ガスの圧力
を８０気圧（絶対圧）に、反志温度を３７℃にそれぞれ
維持しながら１０時間反応を行った。Ｌ−フェニルアラ
ニンの生成速度は０．４５マイクロモル／分／Ｐ＜ミク
ロコツカス・ルテウスＢ−５−４菌株の乾燥菌体）であ
シ、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は１．３１１ＩＰで
あった。
実施例８
アラニン−デヒドロゲナーゼを１．８■用いる以外は実
施例１と同様な方法によりアラニン−デヒドロゲナーゼ
を固定化した直径約５１のフィルムを作製した。同様な
方法によって作製したフィルム３枚を用い、かつ濃度０
．５モル／Ｉ（ＤＬ−アラニン水溶液の代りに濃度０．
５モル／ｊのピルビン隣水浴液を用いる以外は実施例１
と同様にして菌の培養、菌体の固定化および反応を行っ
た。Ｌ−フェニルアラニンの生成速度は０．５２マイク
ロモル／分／ｒ（ミクロコツカス・ルテウス Ｂ−５−
４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フェニルアラニンの生
成量は１．５岬であった。
施例１と同様な方法によりアラニン−デヒドロゲナーゼ
を固定化した直径約５１のフィルムを作製した。同様な
方法によって作製したフィルム３枚を用い、かつ濃度０
．５モル／Ｉ（ＤＬ−アラニン水溶液の代りに濃度０．
５モル／ｊのピルビン隣水浴液を用いる以外は実施例１
と同様にして菌の培養、菌体の固定化および反応を行っ
た。Ｌ−フェニルアラニンの生成速度は０．５２マイク
ロモル／分／ｒ（ミクロコツカス・ルテウス Ｂ−５−
４菌株の乾燥菌体）であり、Ｌ−フェニルアラニンの生
成量は１．５岬であった。
本発明によれば、上記の実施例から明らかなとおり、フ
ェニルピルビン酸とアンモニウム塩および／またはアン
モニアから高い生成速度かつ好収量でしかも容易にＬ−
フェニルアラニンを製造することができる
ェニルピルビン酸とアンモニウム塩および／またはアン
モニアから高い生成速度かつ好収量でしかも容易にＬ−
フェニルアラニンを製造することができる
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、フェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからＬ−フ
ェニルアラニンを生成する能力を有するミクロコッカス
（￥Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ￥）属に属する細菌を、水
素ガス高圧下において（１）フェニルピルビン酸、（２
）アンモニウム塩および／またはアンモニア、（３）ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはそ
の還元型、（４）分子状水素によりニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドを還元する能力を有するアルカリゲ
ネス（￥Ａｌｃａｌｉ−ｇｅｎｅｓ￥）属またはクロス
トリジウム（￥Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ￥）属に属する
細菌、（５）Ｌ−フェニルアラニン以外のアミノ酸およ
び／またはそのアミノ酸に相応するα−ケトカルボン酸
ならびに（６）Ｌ−フェニルアラニン以外のアミノ酸の
デヒドロゲナーゼを含む水溶液に作用させることを特徴
とするＬ−フェニルアラニンの製造方法。 ２、水素ガスの分圧が１０気圧（絶対圧）以上である特
許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３、細菌がミクロコッカス属ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）
種に属する細菌である特許請求の範囲第１項記載の製造
方法。 ４、ミクロコッカス属に属する細菌、アルカリゲネス属
またはクロストリジウム属に属する細菌ならびにデヒド
ロゲナーゼがそれぞれ担体に固定化されている特許請求
の範囲第１項記載の製造方法。 ５、Ｌ−フェニルアラニン以外のアミノ酸がＬ−アラニ
ンである特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20233685A JPS6261594A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20233685A JPS6261594A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6261594A true JPS6261594A (ja) | 1987-03-18 |
| JPH0528113B2 JPH0528113B2 (ja) | 1993-04-23 |
Family
ID=16455855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20233685A Granted JPS6261594A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6261594A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
| JPS6043390A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-03-07 | ダブリユ−・ア−ル・グレイス・アンド・カンパニ− | アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を製造する方法 |
-
1985
- 1985-09-11 JP JP20233685A patent/JPS6261594A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
| JPS6043390A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-03-07 | ダブリユ−・ア−ル・グレイス・アンド・カンパニ− | アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を製造する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0528113B2 (ja) | 1993-04-23 |
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