JPS6261594A - L−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

L−フエニルアラニンの製造方法

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JPS6261594A
JPS6261594A JP20233685A JP20233685A JPS6261594A JP S6261594 A JPS6261594 A JP S6261594A JP 20233685 A JP20233685 A JP 20233685A JP 20233685 A JP20233685 A JP 20233685A JP S6261594 A JPS6261594 A JP S6261594A
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acid
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はL−フェニルアラニンの製造方法に関し、詳し
くはフェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからL−フ
ェニルアラニンを生成する能力を有するミクロコツカス
(Micrococcus)属にIIIスる細菌を用い
て水素ガス高圧下でフェニルピルビン酸と特定のアミノ
基供与体とからL−フェニルアラニンを製造する方法に
関する。
本発明の方法によって得られるL−フェニルアラニンは
必須アミノ酸の一種として栄養上または医薬用途上!要
な物質でめり、また人工甘味料とL テ利用されるα−
L−アスパルチルーL−フェニルアラニンメチルエステ
ル(アスパルテーム)の合成原料としても有用な物質で
ある。
〔従来の技術〕
従来、微生物菌体または微生物起源の酵素を用いてフェ
ニルピルビン酸とアミノ基供与体とからL−yエニルア
ラニンを製造する方法として、例&ばL−グルタミン酸
とフェニルピルビン酸とからアミノ基転移反応によって
酵素的にL−フェニルアラニンを製造する際に、ハイド
ロゲナーゼ、L−グルタミン酸脱水素酵素およびアミノ
基転移酵素の各々の酵素活性を有するエシェリヒア鳴、
プロテウス属、クロストリジワム属などに属する細菌の
生菌体、菌体破砕物または抽出液を用いて窒素源の存在
下かつ水素ガス雰囲気下でL−グルタミン酸の生成反応
とアミノ基転移反応とをL−グルタミン酸を介して基質
共範的に行わしめる方法(特公昭39−5011号公報
および特公昭40−1995号公報参照)が知られてい
る。上記の方法においては水素ガスを反応器中に内圧を
もって保留するかまたは吹込むことができるとされてお
り1具体的には反応器中に0.3 Kt/−の内圧を維
持するように通気する条件下でL−フェニルアラニンを
製造する方法が行われている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
L−フェニルアラニンを工業的に有利に製造するために
は該L−フェニルアラニンを充分に高い生成速度で製造
することができる方法を採用することが望ましいが、か
かる観点から上記の従来法はL−フェニルアラニンの工
業的な製造方法としては必ずしも適当であるとは言い難
い。
しかして、本発明の目的は培養菌体を用いてフェニルピ
ルビン酸かl、L−フェニルアラニンヲ高い生成速度で
かつ好収量で製造することができる工業的に有利な方法
を提供することにある。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明によれば、上記の目的は、フェニルピルビン酸と
アミノ基供与体とからL−フェニルアラニンを生成する
能力を有するミクロコツカス(Micro−cocau
s )属に属するIjA!Iを、水素ガス高圧下におい
テ(1)フェニルピルビン酸* (”a)アンモニウム
塩および/またはアンモニア、(3)ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド(以下これをNADと称する)お
よび/゛!tはNADO遺元型遺風型とれをNADHと
称する)、(4)分子状水素によりNADを還元する能
力を有するアルカリゲネス(Alcaligenas 
)J/AまたはクロストリジウA (Cloatrid
ium )属に属する細fL(s>L−フェニルアラニ
ン以外のアは)酸および/またはそのアミノ酸に相応す
るαニケトカkyllン酸ならびに(6) L−フェニ
ルアラニン以外のアミノ酸のデヒドロゲナーゼを含む水
溶液に作用させることを特徴とするL−フェニルアラニ
ンの製造方法を提供することによって達成される。
本発明の方法において推定されるし一フェニルアラニン
が生成する反応機構を概念的に次に示す。
Hz         H” アルカリゲネス属または クロストリジウム属に属する細菌 ミクロコツカス属に属する細菌 このように、本発明の方法によれば3種類の反応の有機
的な組合わせによj5L−フェニルアラニンが効率的に
生成されると推定される。
本発明の方法において使用するフェニルピルビン酸とア
ミノ基供与体とからL−フェニルアラニンを生成する能
力を有するミクロコツカス属に属する細菌としては、例
えばミクロコツカス・ルテウ、z、 (Microco
ccua 1uteus ) B −5−49株(微工
研菌寄第7664号)があり、その菌学的性質を列挙す
ると次表のとおりである。
(注1):生理学的性質において、+、士および−は次
のことを意味する。
+・・・・・・その性質また絋その生成あり士・・・・
・・その性質またはその生成の有無が判定し礫い −・・・・・・その性質またはその生成なしく注2):
ヒエー・アンド・ライ7ソン培地の炭素源をそれぞれS
類1−15と代え九培地での菌による糖類からの酸の生
成およびガスの発生を観察したものである。
+・・・・・・酸の生成またはガスの発生あり±・・・
・・・酸の生成またはガスの発生の有無が判定し態い −・・・・・・酸の生成また社ガスの発生なし上記の表
に示した菌学的性質に基づき、ミクロコツカス・ルテク
スB−5−4菌株の同定を行った。ばクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株は球菌であること、運動性がない
こと、ダラム染色が陽性であることなどの顕微鏡的所見
およびカタラーゼ反応が陽性であること、好気性である
ことなどの生理学的性質からパージエイズ・マニュアル
・オプ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー(B
ergey’s Manual of Determi
native Bacteriolg)第8版に基づき
、ミクロコツカス属に属する細菌であると同定した。さ
らに、この菌株はコミニーが黄色である点ならびにグル
コ−スからの酸の生成およびガスの発生がない点から、
ミクロコツカス属のルテウス種に属する細菌であると同
定した。
本発明の方法を実施するに際しては、上記のフェニルピ
ルビン酸とアミノ基供与体とからL−フェニルアラニン
を生成する能力を有するミクロコツカス属に属する細菌
を栄養培地で培養し、これによシ得られる画体培養液ま
たはこれよシ分離した生菌体もしくはその乾燥菌体を使
用する。フェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからL
−7エニルアラニンを生成する能力を有するミクロコツ
カス属に属する細菌の栄養培地での培養は、−殺微生物
の培養と同様に行われるが、通常は液体培地によろ振盪
培養法または通気攪拌培養法により行われる。栄養培地
としては上記の細菌が資化利用できる栄養源を含有する
ものでろればよい。炭素源としては1例えばグルコース
、サッカロース、vル)−ス、fリセリン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス1コーンステイーグリカーなどの
1tjlまたは2櫨以上が、通常的0.1〜5重量−の
濃度で用いられる。また窒素源としては、例えば硫酸ア
ンモニウム、[化アンモニウム、硝酸アンモニウムなど
の無機窒素源、またはペプトン、肉エキスなどの有機窒
素源が用いられる。また、この他にリン酸水素2カリウ
ム、リン酸2水素カリウム、硫酸マグネシクムなどの無
機塩類、必要に応じてさらにビタミン類が添加される。
なお、上記の細菌のL−フェニルアラニン生成能を増強
させるために培地に少量のフェニルピルビン酸’tたけ
L−7二二ルアラ二ンを添加しておくのが好ましいg培
養条件に特徴はないが、通常25〜37℃の温度でI’
l16〜11の条件下で約6〜24時間振盪培養または
通気攪拌培養を行う。培養後、培養液中の菌体は濾過ま
九は遠心分離などにょシ容易に分離でき、分離された生
菌体は常法により乾燥菌体とすることができる。このよ
うにして得られる生菌体また社その乾燥菌体はこれらを
担体に固定化して使用することが好ましい。固定化され
た生菌体およびその乾燥菌体はそれらが有する酵素活性
が長期にわたって維持され易く、また反応混合液から容
易に分離回収され、再使用することができる。
担体としては、例えばポリアクリルアミド、カラギーナ
ン、フィブロイン、ゼラチン、コラーゲン、寒天、アル
ギン酸塩、ジエチルアミンエチルセファデックス、ポリ
エチレングリコールまたはボリフ゛ロビレングリコール
のジアクリレートなどをプレポリマーとする光硬化性樹
脂などが便用される。
生菌体またはその乾燥菌体の担体中における濃度は、乾
燥菌体に換算して担体1jに対して通常的1〜100 
t 1好適には約5〜50fである。
本発明の方法は水素ガス高圧下において実施される。水
素ガスの分圧が高くなるほどL−フェニルアラニンの生
成速度が高くなる。水素ガスの分圧は好ましくは10気
圧(絶対圧)以上、より好ましくは20気圧(絶対圧)
以上であり、また工業的に効率よくL−フェニルアラニ
ンを製造する観点から、さらに好ましくは50気圧(絶
対圧)以上であり、特に好ましくは80気圧(絶対圧)
以上である。水素ガス分圧の上限については特に制限さ
れないが、耐圧性の反も器などの製造装置に要する設備
費などを考慮すると水素ガス分圧の上限は通常約200
気圧(絶対圧)、好適には約150気圧(絶対圧)であ
る。
本発明の方法においてアミノ基供与体として作用するア
ンモニウム塩およびアンモニアは、それぞれ単独でまた
は組合わせて使用される。アミノ基供与体の使用量はフ
ェニルピルビン酸1モルに対して通常約1〜50モルと
なるような量である。
アンモニウム塩としては塩化アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、リン酸水素2アンモニウム、リン酸2水素
アンモニウムなどが用いられる。またNADおよびNA
DHはそれぞれ単独でまたは組合わせて、その童が水溶
液中での濃度で通常的0.2〜10ミリモル/jとなる
ように使用される。分子状水素によりNADを還元する
能力を有するアルカリゲネス属に属する細菌としては、
例えばアルカリゲネス・エウトロファス(Alcalj
ganeseutrophus ) H! 69株(A
TCC17699)、アルカリゲネス・エウトロファス
(Alcaligenes 二郵動二)H2O2株(A
TCC17707) などが使用され、またクロストリ
ジウム属に属する細菌としては、例えばクロストリジウ
ム・ブチリカム(Clostridiumbut)yr
icum ) I F 03858菌株、クロストリジ
ウム・アセトブチリカム(Clostridium a
cetobutyricun ) I AM19011
薗株、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clos
tridium aeetobutyricum) I
 A M 19012菌株、クロストリジウム・アセト
ブチリカム(9ostridi■acetobutyr
icum ) I A M 190141株、りoスト
リジウム令ベルフリンジエンス(Clostrldiu
m perfringens)IID520菌株などが
使用される。かかるアルカリゲネス属またはクロストリ
ジウム属に属する細菌としては、前述のミクロコツカス
属に属する細菌の場合と同様にして得られる画体培養液
またはこれより分離した生菌体もしくはその乾燥菌体が
用いられる。アルカリゲネス属またはクロストリジウム
属に属する細菌の生菌体またはその乾燥菌体は、ミクロ
コツカス属に属する細菌の場合と同様な方法で担体に固
定化して使用することが好筐しい。生菌体またはその乾
燥1体の担体中における濃度は、乾燥菌体に換算して担
体1jに対して通常的1〜100r、好適には約5〜5
0?である。さらに、本発明の方法ではL−フェニルア
ラニン以外のアミノ酸としてし一アラニン、グリシン、
L−グルタミン酸、L−リシン、L−アスパラギン酸、
L−メチオニン、L−システィンかとが使用され、また
これらのアミノ酸に相応するα−ケトカルボン酸、例え
ばピルビン酸、グリオキサール酸、α−ケトグルタル酸
、6−アミノ−2−オキソヘキサン酸、オキサロ酢酸、
4−メチルチオ−2−オキソ酪酸、メルカプトピルビン
酸などが使用される。かかるアミノ酸のうちL−アラニ
ン、グリシン、L−グルタミン酸、L−リシンなどを使
用することが好ましく、またこれらのアばノ酸に相応す
るピルビン酸、グリオキサール酸、α−ケトグルタル酸
、6−アミノ−2−オキソヘキサン酸などのα−ケトカ
ルボン酸を使用すルピン酸をそれぞれ単独でまたは組合
わせて使用するととが特に好ましい。上記のアミノ酸お
よびα−ケトカルボン酸はそれぞれ単独でまたは組合わ
せて、その量がフェニルピルビン酸の1モルに対して通
常的0.1〜10モルの割合、好ましくは約0.5〜7
モルの割合となるように使用される。
本発明の方法で使用されるL−フェニルアラニン以外の
上記のアミノ酸のデヒドロゲナーゼの種類は使用するL
−フェニルアラニン以外のアミノ酸およびそれに相応す
るα−ケトカルボン酸の[類に応じて異なる。例えば、
L−アラニンまたはピルビン酸を用いる場合にはアラニ
ン−デヒドロゲナーゼが使用され、またL−グルタミン
酸ま九はα−ケトグルタル酸を用いる場合にはグルタミ
ン酸−デヒドロゲナーゼが使用される。デヒドロゲナー
ゼとしてはL−フェニルアラニン以外のアミノ酸に相応
するα−ケトカルボン酸を還元アミ゛)化してアミノ酸
を生成する能力を有するものであればよく、その起源、
純度などは特に限定されることなく容易に入手できる公
知の動植物のホモジネート、微生物一体、その破砕物、
抽出物などに含まれるデヒドロゲナーゼを用いることが
できる。
かかるデヒドロゲナーゼは水溶液中における濃度が通常
約1〜200単位/dとなるように使用される。デヒド
ロゲナーゼは担体に固定化して使用することが好ましい
。この固定化はミクロコツカス属に1g4する細菌の場
合と同様な方法で行うことができる。デヒドロゲナーゼ
の担体中における濃度は、通常約1〜100単位/A(
担体)である。
この反応は…約6〜10の条件下で行うのが好ましい。
この反応系の田値は約7〜9の範囲内であることが好ま
しく、特に約7.5〜8.5の範囲内であることが好ま
しい。反応系のmf[を調整するために、トリス11衝
液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリシン緩衝液な
どの緩衝液;塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸;ギ酸、
酢酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸
;水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム
、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム
などのアルカリ金属またはアルカリゲネス属の水酸化物
または炭酸塩;アンモニア;トリエチルアミンなどのア
ミンなどを反応系に添加することができ、なかでも緩衝
液を添加することが好ましい。反応温度は通常的20〜
50℃、好ましくは約30〜40℃である。
反応終了後、反応液中の菌体を濾過又は遠心分離などに
よシ分離除去し、得られた濾液又は上清からイオン交換
樹脂法、晶析法などによシ、上記の反応液中に蓄積され
たL−フェニルアラニンを分離取得することができる。
〔実施例〕
以下、実施例によシ本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例によシ限定されるものではない0 実施例1 ペプトン0.5F、肉エキス0.5f1食塩0.5fお
よびフェニルピルビン酸0.32を純水に溶解し、1規
定の水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより…7.
2に調整したのち純水をさらに加えることによって容積
を100JIjにした。この培地50dを500d容坂
ロフラスコに入れ、110℃で10分間、蒸気殺菌を行
った。上記の坂ロフラスコ中の培地にミクロコツカス・
ルテウスB−5−4111I株を植菌し、35℃で15
時間培養した。培養後、培養液から菌体を遠心分離し、
生理食塩水で洗浄した。
上記のようにして得られたミクロコツカス・ルテウスB
−5−4W株の菌体(乾燥菌体に換算してx、sr)を
濃度0.05モル/lのトリス−塩酸緩衝液(FH7,
3)50dKIl!濁した。この菌体懸濁液を濃度4重
量%のアルギン酸ナトリウム水溶液50ggと混合した
のち、この混合液を濃度0.1モル/jの塩化カルシウ
ム水溶液中に滴下することによってビーズ型(直径約a
m)に成型した。
リン酸水素2カリウム0.4491 リン酸2水素カリ
ウム0.159および塩化アンモニウム0.12を純水
に溶解して容積を100 mlにし、この溶液を500
d容坂ロフラスコに入れ、110℃で10分間蒸気殺菌
を行った。上記の坂ロフラスコ中の溶液に滅菌処理を施
した(1)濃度20重量%の硫酸マグネシウム水溶液0
.1 d、 (2)塩化カルシウム・2水和物10.:
M、塩化鉄(I)6水和物16.2f。
塩化ニッケル(■)6水和物118q、塩化クロム(1
)6水和物113η、硫酸鋼(■)5水和物100■お
よびクエン[15,6fを純水で溶解して得られた10
00dの溶液のうちの0.1dならびに(3)濃度15
i1%のフラクトース水溶液2R1をそれぞれ加えた。
この培地50alを500 d容坂ロフラスコに入れ、
それにアルカリゲネス・エウトロファスH16fi株を
植菌したのち30℃で20時間培養した。培養後、培養
液から菌体を遠心分離【7、生理食塩水で洗浄した。
上記のようにして得られたアルカリゲネス・エウトロフ
ァスH16菌株の菌体(乾燥菌体に換算してo、sp)
を濃度O,OSモル/Jのトリス−塩酸緩衝液(Pi(
7,3) 50IILIK@濁した。この菌体懸濁液を
ミクロコツカス・ルテウスB−5−4[株の菌体の固定
化と同様な方法で処理してアルカリゲネス・エウトロ7
アスH161株の菌体の固定化を行った。
ゼラチン0.11を濃度O,OSモル/jのトリス−塩
酸緩衝液(pH7,3)1t/に加熱下に溶解させたの
ち110℃で10分間蒸気殺菌した。このゼラチン溶液
にパシルス・スブチリス(勤且■四蝕且b)種に属する
細菌起源のアラニン−デヒドロゲナーゼ(ベーリンガー
・マンハイム社製L−アラニン脱水素酵素) 0.8 
”fと濃度O,OSモル/1のトリス−塩酸緩衝液(F
II7.3)ldとからなる溶液を加え、テフロン膜上
に円形に展開したのち冷却下に凝固させ、室温下で1晩
乾燥させた。
これを濃度1.25重t%のグルタルアルデヒド水溶液
中に3分間浸漬したのち濃度0.05モル/Iのトリス
−塩酸緩衝液(F447.3)で洗浄することによって
直径約51の円形のフィルムを得た(酵素の有効j11
6.8単位)。
上記のようにして得られたミクロコツカス・ルテウスB
−5−4菌株の菌体を固定化したビーズ1、5 m (
含有されている菌体は乾燥菌体に換算して30IIF)
、アルカリゲネス・エウトロファスH1GFIi株の菌
体を固定化し九ビーズ1.5 aA(含有されている菌
体は乾燥菌体に換算して10′q)およびアラニン−デ
ヒドロゲナーゼを固定化したフィルム(酵素の有効量1
6.8単位)を濃度0.1モル/1のフェニルピルビン
酸水浴液0.5d、濃度0.5モル/JcDL−72ニ
ン水溶液0.511E/、濃度1モル/jの塩化アンモ
ニウム水溶液0.8t/、NADo、53 f (0,
8ミリモル)および濃度0.05モル/Jのトリス−塩
酸緩衝液(F4(7,3)2.2wLlとともに内容2
5dのステンレス製高圧反応器中に仕込んだ。反応器内
の雰囲気を水素ガスによって置換したのち水素ガスで1
00気圧(絶対圧)に加圧した。かかる水素ガスの圧力
を100気圧(絶対圧)K1反応温度を37℃にそれぞ
れ維持しながら10時間反応を行った。反応中において
反応液の微量を経時的に抜き取り、それを液体クロマト
グラフィーで分析した結果、L−フェニルアラニンの生
成速度は0.57マイクロモル/分/?(ミクロコツカ
ス・ルテウスB−s−4Wi株の乾燥菌体)であること
が判明した。反応終了後、反応液中のし一フェニルアラ
ニンを液体クロマトグラフィーにより定量したところ、
L−フェニルアラニンの生成量は1.7qであった。
実施例2 実施例1において反応器内の水素ガスの圧力を20気圧
(絶対圧)に維持して反応を行う以外は実施例1と同様
にして菌の培養、菌体およびアラニン−デヒドロゲナー
ゼの固定化ならびに反応を行った。L−フェニルアラニ
ンの生成速度は0.28マイクロモル/分/f(ミクロ
コッカス−ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であり
、L−フェニルアラニンの生成量は0.83’fであっ
た。
比較例 実施例1において反応器内の水素ガスの圧力を1.3気
圧(絶対圧)に維持して反応を行う以外は実施例1と同
様にして菌の培養、菌体およびアラニン−デヒドロゲナ
ーゼの固定化ならびに反応を行った。L−フェニルアラ
ニンの生成速度は0.13マイクロモル/分/f<ミク
ロコツカス・ルテウスB−5−411株の乾燥菌体)で
あり、L−フェニルアラニンの生成量は0.38岬であ
った。
実施例3 実施例1において高圧反応器中に濃度1モル/1の塩化
アンモニウム水溶液0.8−の代りに濃度1モル/Iの
酢酸アンモニウム水溶液0.8 mlを仕込み、またN
ADo、53 f (0,8i L%ル)O代シにNA
DHo、53 f (0,8ミリモル)を仕込む以外は
実施例1と同様にして菌の培養、菌体およびアラニン−
デヒドロゲナーゼの固定化ならびに反応を行った。L−
フェニルアラニンの生成速度は0.62マイクロモル/
分/f(ミクロコツカス・ルテウスB−5−4菌株の乾
燥菌体)であシ、L−、エニルアラニンの生成量は1.
84であっ九実施例4 ミクロコツカス会ルテウスB−5−411株およびアル
カリゲネス・エウトロファスH16菌株を実施例1と同
様にしてそれぞれ培養したのちに得られた菌体ならびに
アラニンーデヒドロゲナーゼを固定化することなく高圧
反応器に仕込み、かつNADの代シKNADH0,53
t (,0,8ミリモル)を仕込む以外は実施P11と
同様にして反応を行つ九。L−フェニルアラニンの生成
速度は0.47マイクロモル/分/l(ミクロツカス嗜
ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であシ、L−フェ
ニルアラニンの生成量は1.4 mlPであった。
実施例5 ミクロコツカス轡ルテウスB−5−4菌株およびアルカ
リゲネス・エウトロ7アスH16菌株を実施例1と同様
にして培養したのち、それぞれの菌体を得た。ミクロコ
ツカス・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換
算して1.5F)を濃度0.1モル/Jのリン酸緩衝液
(pH7,3)50dK懸濁させた。この菌体懸濁液を
濃度4重量%の寒天水溶液50dと混合したのち0℃に
冷却することによって凝固させ、それを小片(−辺の長
さが約5mO立方体)に切断し、濃度0.1モル/jの
リン酸緩衝液中で保存し九〇また、アルカリゲネスCエ
クトロ7アスH16I1株の菌体(乾燥菌体に換算して
0.59)を濃度0.1モル/Jのリン酸緩衝液(PH
7,3) 50atに懸濁させたのち、同様にしてアル
カリゲネス・エウトロファスH16菌株の菌体を寒天中
に固定化した。
アラニン−デヒドロゲナーゼの代シにウシの肝臓(Bo
vine 1iver )  起源のグルタミン酸−デ
ヒドロゲナーゼ〔シグマ社#L−グルタミン酸−デヒト
ロゲf −−t/ (L −Glutamic deh
ydrogenase ) 02009)0.811F
(32単位)を用いる以外は実施例1と同様にしてグル
タミ/酸−デヒドロゲナーゼをアルギン酸塩中に固定化
した(酵素の有効量22単位)。
上記のようにして得られた固定化されたミクロコツカス
・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
30v)、アルカリゲネス、エウトロ7アスH16菌株
の菌体(乾燥菌体に換算して1OjIF)およびグルタ
ミン酸−デヒドロゲナーゼ(酵素の有効量22単位)を
濃度0.1モル/lのフェニルピルビン酸水溶液0.5
x#、濃度0.5モル/ノのL−グルタばン酸水溶液0
.5yj、濃度0.5モル/Jの硫酸アンモニウム水溶
液0.8x#、NADo、53F(0,8ミリモル)お
よび濃度0.05モル/Jのリン酸緩衝液(F4(7,
3)2.2mとともに内容Q5dのステンレス製高圧反
応器中に仕込み、実施例1と同様にして反応を行った。
L−フェニルアラニンの生成速度は0.50マイクロモ
ル/分/f(−fクロコツカス・ルテウスB−5−4菌
株の乾燥菌体)であり、L−フェニルアラニンの生成量
は1.5 ’IPであった。
実施例6 グルコース1f1ペプトン0.4f、肉エキス02t1
酵母エキス0.4t、  リン酸水素2カリクム1.2
5Mおよび硫酸鉄(If)0.Osrを純水に溶解した
のち1規定の塩酸で州を7.OK調整し、純水をさらに
加えることによって容積を100g1KL九。この培地
50dを500d容坂ロフラスコに入れ、110℃で1
0分間蒸気殺菌ののちクロストリジウム・ブチリカムI
 FO3858菌株を植菌し、嫌気性条件下において3
7℃で10時間培養した。得られたクロストリジウム・
ブチリカムIF03858菌株の菌体(乾燥菌体に換算
して0.52)を濃度0.05モル/Iのトリス−塩酸
緩衝液(田7.3)50mlに懸濁し九。この菌体懸濁
液を濃度4重1iチのアルギン酸ナトリウム水溶液50
dと混合したのち、この混合液を濃度0.1モル/jの
塩化カルシウム水溶液中に滴下することによってビーズ
型(直径約au)に成型した。
実施例1と同様にしてミクロコツカス・ルテウスB−5
−4菌株の培養、それによって得られ念菌体の固定化お
よびアラ二/−デヒドロゲナーゼの固定化を行った。
上記のようにして得られた固定化されたミクロコツカス
・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
30■)、クロストリジウム・ブチリカムIF0385
81株の菌体(乾燥菌体に換算して10■)およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼ(酵素の有効量16.8単位)
を用いる以外は実施例1と同様にして反応を行つ九。L
−フェニルアラニンの生成速度は0.50マイクロモル
/分/2(ミクロコツカス・ルテウスB−5−411株
の乾燥菌体)であり、L−フェニルアラニンの生成量は
1.51JPであった。
実施“【ダj7 実施例1と同僚に培養して得られたミクロコツカス・ル
テウスB−5−4菌株の菌体を実施例5と同様にして寒
天中に固定化した。実施例6と同様に培養して得られた
クロストリジウム・ブチリカムI F03858038
58菌乾燥菌体に換算して059)を濃度0.1モル/
jのリン酸緩衝液(…7.3)50!!Llに懸濁させ
たのち、アルカリゲネス・エウトロファスH16菌株の
菌体の代シにクロストリジウム・ブチリカムI Fo 
3858菌株の菌体を用いる以外は実施例5と同様にし
て菌体を寒天中に固定化した。実施例1と同様にしてア
ラニン−デヒドロゲナーゼの固定化を行った。
上記のようにして得られた固定化されたミクロコツカス
・ルテウスB−5−4菌株の菌体(乾燥菌体に換算して
30■)、クロストリジウム・ブチリカムIF0385
8菌株の菌体(乾燥菌体に換算して10〜)およびアラ
ニン−デヒドロゲナーゼ(酵素の有効量16.8単位)
を、濃度0.1モル/jのフェニルピルビン酸水溶液0
.5d、濃度0.5モル/JのL−アラニン水溶液0.
5 t/%濃度1モル/1のアンモニア水溶液0.8d
、NADo、53F(0,8ミリモル)および濃度0.
05モル/jのリン酸緩衝液(PH7,3)2.2sE
/とともに内容25dのステンレス製高圧反応器中に仕
込んだ。反応器内の雰囲気を水素ガスで置換したのち水
素ガスで80気圧(絶対圧)に加圧し、水素ガスの圧力
を80気圧(絶対圧)に、反志温度を37℃にそれぞれ
維持しながら10時間反応を行った。L−フェニルアラ
ニンの生成速度は0.45マイクロモル/分/P<ミク
ロコツカス・ルテウスB−5−4菌株の乾燥菌体)であ
シ、L−フェニルアラニンの生成量は1.311IPで
あった。
実施例8 アラニン−デヒドロゲナーゼを1.8■用いる以外は実
施例1と同様な方法によりアラニン−デヒドロゲナーゼ
を固定化した直径約51のフィルムを作製した。同様な
方法によって作製したフィルム3枚を用い、かつ濃度0
.5モル/I(DL−アラニン水溶液の代りに濃度0.
5モル/jのピルビン隣水浴液を用いる以外は実施例1
と同様にして菌の培養、菌体の固定化および反応を行っ
た。L−フェニルアラニンの生成速度は0.52マイク
ロモル/分/r(ミクロコツカス・ルテウス B−5−
4菌株の乾燥菌体)であり、L−フェニルアラニンの生
成量は1.5岬であった。
〔発明の効果〕
本発明によれば、上記の実施例から明らかなとおり、フ
ェニルピルビン酸とアンモニウム塩および/またはアン
モニアから高い生成速度かつ好収量でしかも容易にL−
フェニルアラニンを製造することができる

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、フェニルピルビン酸とアミノ基供与体とからL−フ
    ェニルアラニンを生成する能力を有するミクロコッカス
    (¥Micrococcus¥)属に属する細菌を、水
    素ガス高圧下において(1)フェニルピルビン酸、(2
    )アンモニウム塩および/またはアンモニア、(3)ニ
    コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび/またはそ
    の還元型、(4)分子状水素によりニコチンアミドアデ
    ニンジヌクレオチドを還元する能力を有するアルカリゲ
    ネス(¥Alcali−genes¥)属またはクロス
    トリジウム(¥Clostridium¥)属に属する
    細菌、(5)L−フェニルアラニン以外のアミノ酸およ
    び/またはそのアミノ酸に相応するα−ケトカルボン酸
    ならびに(6)L−フェニルアラニン以外のアミノ酸の
    デヒドロゲナーゼを含む水溶液に作用させることを特徴
    とするL−フェニルアラニンの製造方法。 2、水素ガスの分圧が10気圧(絶対圧)以上である特
    許請求の範囲第1項記載の製造方法。 3、細菌がミクロコッカス属ルテウス(luteus)
    種に属する細菌である特許請求の範囲第1項記載の製造
    方法。 4、ミクロコッカス属に属する細菌、アルカリゲネス属
    またはクロストリジウム属に属する細菌ならびにデヒド
    ロゲナーゼがそれぞれ担体に固定化されている特許請求
    の範囲第1項記載の製造方法。 5、L−フェニルアラニン以外のアミノ酸がL−アラニ
    ンである特許請求の範囲第1項記載の製造方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4304858A (en) * 1979-07-25 1981-12-08 Degussa Aktiengesellschaft Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids
JPS6043390A (ja) * 1983-08-05 1985-03-07 ダブリユ−・ア−ル・グレイス・アンド・カンパニ− アルフア−ケト酸からl−アミノ酸を製造する方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4304858A (en) * 1979-07-25 1981-12-08 Degussa Aktiengesellschaft Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids
JPS6043390A (ja) * 1983-08-05 1985-03-07 ダブリユ−・ア−ル・グレイス・アンド・カンパニ− アルフア−ケト酸からl−アミノ酸を製造する方法

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