JPS6142555B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、エシエリヒア属に属するトリプトフ
アン・シンセターゼ（インドールとＬ−セリンか
らＬ−トリプトフアンを合成する反応も触媒する
酵素）生産菌を、酵素活性が高く且つ高収量で培
養する培養方法に関するものである。 近年、Ｌ−トリプトフアンは医薬用のみならず
飼料用としての効果が世の注目を集めるに至り、
工業的規模による安価な本物質生産の期待が高ま
つてきている。Ｌ−トリプトフアンを製造する方
法の中で非常に有望視されている方法の一つにイ
ンドールとＬ−セリンからＬ−トリプトフアンを
製造する酵素的生産方法がある。該反応を触媒す
る酵素が、トリプトフアン・シンセターゼであ
り、主として遺伝的に改良されたエシエリヒア属
に属する微生物の菌体内に大量に生産される。本
酵素は菌体そのまま、或いは無細胞抽出液などで
反応に使用されるが、この酵素を商業的規模で使
用しうるためには、酵素活性（単位時間、単位菌
体量当りのＬ−トリプトフアン合成能）の高い本
酵素生産菌を高収量で効率よく培養する方法の開
発が望まれる。 従来、トリプトフアン・シンセターゼ生産菌の
培養のための炭素源として、グルコースを使用す
ることは知られているが、いずれも培養に使用し
たグルコースの量が少ないために得られる菌体収
量も低く、酵素活性の高い該菌を高収量で得る試
みは全くなされていなかつた。更に、培養条件と
酵素活性の関係も殆んど知られておらず、従来は
グルコースを比較的低濃度（主として２％以下）
で培養開始時に一括に仕込んで培養しているにす
ぎなかつた。 本発明者らは、トリプトフアン・シンセターゼ
活性の高い該酵素生産菌を、しかも高収量で培養
する培養条件を種々検討した結果、培地中のグル
コース濃度を１％以下になるように、グルコース
を連続的又は断続的に添加しながら培養した場
合、グルコースを培養開始時に一括に仕込んだ場
合に比較して著しく高収量で且つ酵素活性の高い
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌が得られる
ことを見出し本発明を完成させた。 本発明はトリプトフアン・シンセターゼ生産菌
であるエシエリヒア・コリMT−10232（FERM
BP−19）またはエシエリヒア・コリMT−10242
（FERM BP−20）を培地中のグルコース濃度が
１％以下に保たれるように、グルコースを連続的
または断続的に添加しながら培養することによつ
て、トリプトフアン・シンセターゼ活性の高い菌
体を高収量で得るトリプトフアン・シンセターゼ
生産菌の培養方法に関するものである。本発明を
完成させるために種々検討した結果によれば、培
養開始時間の培地のグルコース濃度を比較的低濃
度、通常１％以下、に一括仕込めば、一定濃度の
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌を得るに要
する培養時間は比較的短時間ですむが、高濃度の
菌体を得られない欠点があり、一方、培養開始時
の培地のグルコース濃度を高濃度、通常２％以上
にすると、或る一定濃度の菌体を得るのに非常に
長時間の培養時間を要し且つ得られた菌体の酵素
活性も低いという欠点を有していた。本発明によ
れば、酵素活性の高いトリプトフアン・シンセタ
ーゼ生産菌を、高収量で且つ短かい培養時間で得
られるのであり、その工業的意義は極めて大きい
ものと思われる。 本発明に使用する培地の窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝
酸カリ、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニ
アなどが適当であり、無機物としては、リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛
等が用いられ、成長促進物質としては、サイアミ
ン、ピチオン等のビタミン類、メチオニン、シス
テイン等のアミノ酸、あるいはこれらの物質を全
部ないしは部分的に含有する酵母エキス、コー
ン・ステイーブ・リカー、糖蜜、肉エキス、ポリ
ペプトン、カザミノ酸等が用いられる。尚、遺伝
的に改良されたトリプトフアン・シンセターゼ生
産菌は、生育するのにトリプトフアンまたはイン
ドールを栄養要求するので、培養するときはこれ
らの物質のいずれかを培地に添加しなければなら
ない。更に、炭素源（グルコース）以外の上記栄
養源は本生産菌を培養するときには、制限基質と
ならないように培地に充分量加えておかなければ
ならない。 培養温度は、10〜45℃、好ましくは、30〜40℃
の範囲である培地のPHは３〜９、好ましくは、６
〜８の範囲であり、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、またはアンモニウム等で培養中一定に保
持することが望ましい。培養は好気的に行ない、
培養期間中培地の溶存酸素が生育の律速因子にな
らないように通気および撹拌することが好まし
い。 本発明の培地中のグルコース濃度を１％以下に
制御する方法としては、培地中のグルコース濃度
を固定化酸素を使用したグルコース・アナライザ
ー等の分析機器で連続的或いは断続的に定量して
グルコース濃度が１％を超えないように、好まし
くは0.6％を超えないように、更に好ましくは0.3
％を超えないように、グルコースを添加しても良
いし、あるいは前もつてグルコース濃度と溶存酸
素又はPHとの関連を調べ、例えばグルコース濃度
がゼロの場合、溶存酸素又はPHが上昇するという
相関が得られゝば、溶存酸素又はPHが上昇した時
点でグルコースをその濃度が１％を超えないよう
に添加する方法も採用することができる。 本発明の培養方法によれば、トリプトフアン・
シンセターゼ活性も高く、しかも高収量で該酵素
生産菌を得ることができるので、本発明はトリプ
トフアン・シンセターゼ生産菌の工業的生産に大
いに貢献するものと思われる。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ トリプトフアン・シンセターゼ生産菌であるエ
シエリヒア・コリMT−10232、FFRM BP−19を
500mlの坂口フラスコ中の第１表に示す組成物の
培地100mlに接種し、35℃で24時間培養した。こ
の培養液200ml（フラスコ２本）を30のジヤー
フアーメンター中の第２表に示す組成の培地15
に接種し、35℃、PH6.8（28％アンモニア水で調
整）で培養した。培地中の溶存酸素は飽和値の５
％以下にならないように通気量および撹拌回転数
を調整した。あらかじめ、グルコース濃度がゼロ
になると培養液の溶存酸素又はPHが上昇するのを
確認しておき、これらの値が上昇を始めた時点で
グルコースを１％になるように添加した。この操
作を繰り返し最終的に添加したグルコース量が、
５％濃度に相当するように培養を行なつた。比較
例として、培養開始時にグルコース濃度５％（他
の培養組成は第２表に同じ）の培地を使用してグ
ルコースの添加は行なわず培養を実施した。 第 １ 表 エーリツヒ肉エキス 10ｇ ポリペプトン 10ｇ NaCl ５ｇ 蒸溜水で１に希釈して使用（PH6.8） 第 ２ 表 グルコース 10 ｇ KH₂PO₄ ２ ｇ K₂HPO₄ ２ ｇ （NH₄）₂SO₄ 1.5ｇ MgSO₄・7H₂O ２ ｇ ポリペプトン ２ ｇ 酵母エキス ２ ｇ CuCl₂・2H₂O １ mg MnSO₄・5H₂O 10 mg ZnSO₄・7H₂O ２ mg Na₂MoO₄・2H₂O ２ mg H₃BO₃ 0.5mg CaCl₂・2H₂O 40 mg CoCl₂・6H₂O ４ mg FeSO₄・7H₂O 40 mg AlCl₃・6H₂O 10 mg Ｌ−トリプトフアン 300 mg アデカノールLG805 ５ ml 蒸溜水で１に希釈して使用（PH6.8） 一定時間培養後、菌体を遠心分離して集菌し、
乾燥菌体重量およびトリプトフアン・シンセター
ゼ活性を測定した。トリプトフアン・シンセター
ゼ活性は、第３表に示す反応組成の反応液を使用
して35℃で１時間反応し単位乾燥菌体量および単
位時間当りのＬ−トリプトフアン生成量で表示し
た。以上の結果を、第４表に示した。 第 ３ 表 インドール ２ ％ Ｌ−セリン 1.8 ％ トリトン・Ｘ−100 ５ ％ ピリドキサール5′−リン酸 0.01％ （NH₄）₂SO₄ 2.5 ％ 菌体（乾物換算） 0.08％ PH8.5

【表】 実施例 ２ 培養液中のグルコース濃度を連続的に定量し、
グルコース濃度が0.5ｇ/になるように、グルコ
ースを連続的に供給し最終的に添加したグルコー
ス量が５％濃度に相当するようになるまで培養を
行なつた。他は実施例１と同様の操作を施した。
その結果を第５表に示した。

【表】 実施例 ３ トリプトフアン・シンセターゼ生産菌である、
エシエリヒア・コリMT−10242、FERM BP−20
を使用して、実施例１と同様の操作を行なつた。
得られた結果を第６表に示した。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 培地中のグルコース濃度が１％以下に保たれ
   るようにグルコースを連続的または断続的に添加
   することを特徴とするトリプトフアン・シンセタ
   ーゼ生産菌エシエリヒア・コリの培養方法。