JPS6142555B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6142555B2 JPS6142555B2 JP56116486A JP11648681A JPS6142555B2 JP S6142555 B2 JPS6142555 B2 JP S6142555B2 JP 56116486 A JP56116486 A JP 56116486A JP 11648681 A JP11648681 A JP 11648681A JP S6142555 B2 JPS6142555 B2 JP S6142555B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose
- culture
- tryptophan
- medium
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、エシエリヒア属に属するトリプトフ
アン・シンセターゼ(インドールとL−セリンか
らL−トリプトフアンを合成する反応も触媒する
酵素)生産菌を、酵素活性が高く且つ高収量で培
養する培養方法に関するものである。 近年、L−トリプトフアンは医薬用のみならず
飼料用としての効果が世の注目を集めるに至り、
工業的規模による安価な本物質生産の期待が高ま
つてきている。L−トリプトフアンを製造する方
法の中で非常に有望視されている方法の一つにイ
ンドールとL−セリンからL−トリプトフアンを
製造する酵素的生産方法がある。該反応を触媒す
る酵素が、トリプトフアン・シンセターゼであ
り、主として遺伝的に改良されたエシエリヒア属
に属する微生物の菌体内に大量に生産される。本
酵素は菌体そのまま、或いは無細胞抽出液などで
反応に使用されるが、この酵素を商業的規模で使
用しうるためには、酵素活性(単位時間、単位菌
体量当りのL−トリプトフアン合成能)の高い本
酵素生産菌を高収量で効率よく培養する方法の開
発が望まれる。 従来、トリプトフアン・シンセターゼ生産菌の
培養のための炭素源として、グルコースを使用す
ることは知られているが、いずれも培養に使用し
たグルコースの量が少ないために得られる菌体収
量も低く、酵素活性の高い該菌を高収量で得る試
みは全くなされていなかつた。更に、培養条件と
酵素活性の関係も殆んど知られておらず、従来は
グルコースを比較的低濃度(主として2%以下)
で培養開始時に一括に仕込んで培養しているにす
ぎなかつた。 本発明者らは、トリプトフアン・シンセターゼ
活性の高い該酵素生産菌を、しかも高収量で培養
する培養条件を種々検討した結果、培地中のグル
コース濃度を1%以下になるように、グルコース
を連続的又は断続的に添加しながら培養した場
合、グルコースを培養開始時に一括に仕込んだ場
合に比較して著しく高収量で且つ酵素活性の高い
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌が得られる
ことを見出し本発明を完成させた。 本発明はトリプトフアン・シンセターゼ生産菌
であるエシエリヒア・コリMT−10232(FERM
BP−19)またはエシエリヒア・コリMT−10242
(FERM BP−20)を培地中のグルコース濃度が
1%以下に保たれるように、グルコースを連続的
または断続的に添加しながら培養することによつ
て、トリプトフアン・シンセターゼ活性の高い菌
体を高収量で得るトリプトフアン・シンセターゼ
生産菌の培養方法に関するものである。本発明を
完成させるために種々検討した結果によれば、培
養開始時間の培地のグルコース濃度を比較的低濃
度、通常1%以下、に一括仕込めば、一定濃度の
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌を得るに要
する培養時間は比較的短時間ですむが、高濃度の
菌体を得られない欠点があり、一方、培養開始時
の培地のグルコース濃度を高濃度、通常2%以上
にすると、或る一定濃度の菌体を得るのに非常に
長時間の培養時間を要し且つ得られた菌体の酵素
活性も低いという欠点を有していた。本発明によ
れば、酵素活性の高いトリプトフアン・シンセタ
ーゼ生産菌を、高収量で且つ短かい培養時間で得
られるのであり、その工業的意義は極めて大きい
ものと思われる。 本発明に使用する培地の窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝
酸カリ、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニ
アなどが適当であり、無機物としては、リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛
等が用いられ、成長促進物質としては、サイアミ
ン、ピチオン等のビタミン類、メチオニン、シス
テイン等のアミノ酸、あるいはこれらの物質を全
部ないしは部分的に含有する酵母エキス、コー
ン・ステイーブ・リカー、糖蜜、肉エキス、ポリ
ペプトン、カザミノ酸等が用いられる。尚、遺伝
的に改良されたトリプトフアン・シンセターゼ生
産菌は、生育するのにトリプトフアンまたはイン
ドールを栄養要求するので、培養するときはこれ
らの物質のいずれかを培地に添加しなければなら
ない。更に、炭素源(グルコース)以外の上記栄
養源は本生産菌を培養するときには、制限基質と
ならないように培地に充分量加えておかなければ
ならない。 培養温度は、10〜45℃、好ましくは、30〜40℃
の範囲である培地のPHは3〜9、好ましくは、6
〜8の範囲であり、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、またはアンモニウム等で培養中一定に保
持することが望ましい。培養は好気的に行ない、
培養期間中培地の溶存酸素が生育の律速因子にな
らないように通気および撹拌することが好まし
い。 本発明の培地中のグルコース濃度を1%以下に
制御する方法としては、培地中のグルコース濃度
を固定化酸素を使用したグルコース・アナライザ
ー等の分析機器で連続的或いは断続的に定量して
グルコース濃度が1%を超えないように、好まし
くは0.6%を超えないように、更に好ましくは0.3
%を超えないように、グルコースを添加しても良
いし、あるいは前もつてグルコース濃度と溶存酸
素又はPHとの関連を調べ、例えばグルコース濃度
がゼロの場合、溶存酸素又はPHが上昇するという
相関が得られゝば、溶存酸素又はPHが上昇した時
点でグルコースをその濃度が1%を超えないよう
に添加する方法も採用することができる。 本発明の培養方法によれば、トリプトフアン・
シンセターゼ活性も高く、しかも高収量で該酵素
生産菌を得ることができるので、本発明はトリプ
トフアン・シンセターゼ生産菌の工業的生産に大
いに貢献するものと思われる。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 1 トリプトフアン・シンセターゼ生産菌であるエ
シエリヒア・コリMT−10232、FFRM BP−19を
500mlの坂口フラスコ中の第1表に示す組成物の
培地100mlに接種し、35℃で24時間培養した。こ
の培養液200ml(フラスコ2本)を30のジヤー
フアーメンター中の第2表に示す組成の培地15
に接種し、35℃、PH6.8(28%アンモニア水で調
整)で培養した。培地中の溶存酸素は飽和値の5
%以下にならないように通気量および撹拌回転数
を調整した。あらかじめ、グルコース濃度がゼロ
になると培養液の溶存酸素又はPHが上昇するのを
確認しておき、これらの値が上昇を始めた時点で
グルコースを1%になるように添加した。この操
作を繰り返し最終的に添加したグルコース量が、
5%濃度に相当するように培養を行なつた。比較
例として、培養開始時にグルコース濃度5%(他
の培養組成は第2表に同じ)の培地を使用してグ
ルコースの添加は行なわず培養を実施した。 第 1 表 エーリツヒ肉エキス 10g ポリペプトン 10g NaCl 5g 蒸溜水で1に希釈して使用(PH6.8) 第 2 表 グルコース 10 g KH2PO4 2 g K2HPO4 2 g (NH4)2SO4 1.5g MgSO4・7H2O 2 g ポリペプトン 2 g 酵母エキス 2 g CuCl2・2H2O 1 mg MnSO4・5H2O 10 mg ZnSO4・7H2O 2 mg Na2MoO4・2H2O 2 mg H3BO3 0.5mg CaCl2・2H2O 40 mg CoCl2・6H2O 4 mg FeSO4・7H2O 40 mg AlCl3・6H2O 10 mg L−トリプトフアン 300 mg アデカノールLG805 5 ml 蒸溜水で1に希釈して使用(PH6.8) 一定時間培養後、菌体を遠心分離して集菌し、
乾燥菌体重量およびトリプトフアン・シンセター
ゼ活性を測定した。トリプトフアン・シンセター
ゼ活性は、第3表に示す反応組成の反応液を使用
して35℃で1時間反応し単位乾燥菌体量および単
位時間当りのL−トリプトフアン生成量で表示し
た。以上の結果を、第4表に示した。 第 3 表 インドール 2 % L−セリン 1.8 % トリトン・X−100 5 % ピリドキサール5′−リン酸 0.01% (NH4)2SO4 2.5 % 菌体(乾物換算) 0.08% PH8.5
アン・シンセターゼ(インドールとL−セリンか
らL−トリプトフアンを合成する反応も触媒する
酵素)生産菌を、酵素活性が高く且つ高収量で培
養する培養方法に関するものである。 近年、L−トリプトフアンは医薬用のみならず
飼料用としての効果が世の注目を集めるに至り、
工業的規模による安価な本物質生産の期待が高ま
つてきている。L−トリプトフアンを製造する方
法の中で非常に有望視されている方法の一つにイ
ンドールとL−セリンからL−トリプトフアンを
製造する酵素的生産方法がある。該反応を触媒す
る酵素が、トリプトフアン・シンセターゼであ
り、主として遺伝的に改良されたエシエリヒア属
に属する微生物の菌体内に大量に生産される。本
酵素は菌体そのまま、或いは無細胞抽出液などで
反応に使用されるが、この酵素を商業的規模で使
用しうるためには、酵素活性(単位時間、単位菌
体量当りのL−トリプトフアン合成能)の高い本
酵素生産菌を高収量で効率よく培養する方法の開
発が望まれる。 従来、トリプトフアン・シンセターゼ生産菌の
培養のための炭素源として、グルコースを使用す
ることは知られているが、いずれも培養に使用し
たグルコースの量が少ないために得られる菌体収
量も低く、酵素活性の高い該菌を高収量で得る試
みは全くなされていなかつた。更に、培養条件と
酵素活性の関係も殆んど知られておらず、従来は
グルコースを比較的低濃度(主として2%以下)
で培養開始時に一括に仕込んで培養しているにす
ぎなかつた。 本発明者らは、トリプトフアン・シンセターゼ
活性の高い該酵素生産菌を、しかも高収量で培養
する培養条件を種々検討した結果、培地中のグル
コース濃度を1%以下になるように、グルコース
を連続的又は断続的に添加しながら培養した場
合、グルコースを培養開始時に一括に仕込んだ場
合に比較して著しく高収量で且つ酵素活性の高い
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌が得られる
ことを見出し本発明を完成させた。 本発明はトリプトフアン・シンセターゼ生産菌
であるエシエリヒア・コリMT−10232(FERM
BP−19)またはエシエリヒア・コリMT−10242
(FERM BP−20)を培地中のグルコース濃度が
1%以下に保たれるように、グルコースを連続的
または断続的に添加しながら培養することによつ
て、トリプトフアン・シンセターゼ活性の高い菌
体を高収量で得るトリプトフアン・シンセターゼ
生産菌の培養方法に関するものである。本発明を
完成させるために種々検討した結果によれば、培
養開始時間の培地のグルコース濃度を比較的低濃
度、通常1%以下、に一括仕込めば、一定濃度の
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌を得るに要
する培養時間は比較的短時間ですむが、高濃度の
菌体を得られない欠点があり、一方、培養開始時
の培地のグルコース濃度を高濃度、通常2%以上
にすると、或る一定濃度の菌体を得るのに非常に
長時間の培養時間を要し且つ得られた菌体の酵素
活性も低いという欠点を有していた。本発明によ
れば、酵素活性の高いトリプトフアン・シンセタ
ーゼ生産菌を、高収量で且つ短かい培養時間で得
られるのであり、その工業的意義は極めて大きい
ものと思われる。 本発明に使用する培地の窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝
酸カリ、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニ
アなどが適当であり、無機物としては、リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛
等が用いられ、成長促進物質としては、サイアミ
ン、ピチオン等のビタミン類、メチオニン、シス
テイン等のアミノ酸、あるいはこれらの物質を全
部ないしは部分的に含有する酵母エキス、コー
ン・ステイーブ・リカー、糖蜜、肉エキス、ポリ
ペプトン、カザミノ酸等が用いられる。尚、遺伝
的に改良されたトリプトフアン・シンセターゼ生
産菌は、生育するのにトリプトフアンまたはイン
ドールを栄養要求するので、培養するときはこれ
らの物質のいずれかを培地に添加しなければなら
ない。更に、炭素源(グルコース)以外の上記栄
養源は本生産菌を培養するときには、制限基質と
ならないように培地に充分量加えておかなければ
ならない。 培養温度は、10〜45℃、好ましくは、30〜40℃
の範囲である培地のPHは3〜9、好ましくは、6
〜8の範囲であり、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、またはアンモニウム等で培養中一定に保
持することが望ましい。培養は好気的に行ない、
培養期間中培地の溶存酸素が生育の律速因子にな
らないように通気および撹拌することが好まし
い。 本発明の培地中のグルコース濃度を1%以下に
制御する方法としては、培地中のグルコース濃度
を固定化酸素を使用したグルコース・アナライザ
ー等の分析機器で連続的或いは断続的に定量して
グルコース濃度が1%を超えないように、好まし
くは0.6%を超えないように、更に好ましくは0.3
%を超えないように、グルコースを添加しても良
いし、あるいは前もつてグルコース濃度と溶存酸
素又はPHとの関連を調べ、例えばグルコース濃度
がゼロの場合、溶存酸素又はPHが上昇するという
相関が得られゝば、溶存酸素又はPHが上昇した時
点でグルコースをその濃度が1%を超えないよう
に添加する方法も採用することができる。 本発明の培養方法によれば、トリプトフアン・
シンセターゼ活性も高く、しかも高収量で該酵素
生産菌を得ることができるので、本発明はトリプ
トフアン・シンセターゼ生産菌の工業的生産に大
いに貢献するものと思われる。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 1 トリプトフアン・シンセターゼ生産菌であるエ
シエリヒア・コリMT−10232、FFRM BP−19を
500mlの坂口フラスコ中の第1表に示す組成物の
培地100mlに接種し、35℃で24時間培養した。こ
の培養液200ml(フラスコ2本)を30のジヤー
フアーメンター中の第2表に示す組成の培地15
に接種し、35℃、PH6.8(28%アンモニア水で調
整)で培養した。培地中の溶存酸素は飽和値の5
%以下にならないように通気量および撹拌回転数
を調整した。あらかじめ、グルコース濃度がゼロ
になると培養液の溶存酸素又はPHが上昇するのを
確認しておき、これらの値が上昇を始めた時点で
グルコースを1%になるように添加した。この操
作を繰り返し最終的に添加したグルコース量が、
5%濃度に相当するように培養を行なつた。比較
例として、培養開始時にグルコース濃度5%(他
の培養組成は第2表に同じ)の培地を使用してグ
ルコースの添加は行なわず培養を実施した。 第 1 表 エーリツヒ肉エキス 10g ポリペプトン 10g NaCl 5g 蒸溜水で1に希釈して使用(PH6.8) 第 2 表 グルコース 10 g KH2PO4 2 g K2HPO4 2 g (NH4)2SO4 1.5g MgSO4・7H2O 2 g ポリペプトン 2 g 酵母エキス 2 g CuCl2・2H2O 1 mg MnSO4・5H2O 10 mg ZnSO4・7H2O 2 mg Na2MoO4・2H2O 2 mg H3BO3 0.5mg CaCl2・2H2O 40 mg CoCl2・6H2O 4 mg FeSO4・7H2O 40 mg AlCl3・6H2O 10 mg L−トリプトフアン 300 mg アデカノールLG805 5 ml 蒸溜水で1に希釈して使用(PH6.8) 一定時間培養後、菌体を遠心分離して集菌し、
乾燥菌体重量およびトリプトフアン・シンセター
ゼ活性を測定した。トリプトフアン・シンセター
ゼ活性は、第3表に示す反応組成の反応液を使用
して35℃で1時間反応し単位乾燥菌体量および単
位時間当りのL−トリプトフアン生成量で表示し
た。以上の結果を、第4表に示した。 第 3 表 インドール 2 % L−セリン 1.8 % トリトン・X−100 5 % ピリドキサール5′−リン酸 0.01% (NH4)2SO4 2.5 % 菌体(乾物換算) 0.08% PH8.5
【表】
実施例 2
培養液中のグルコース濃度を連続的に定量し、
グルコース濃度が0.5g/になるように、グルコ
ースを連続的に供給し最終的に添加したグルコー
ス量が5%濃度に相当するようになるまで培養を
行なつた。他は実施例1と同様の操作を施した。
その結果を第5表に示した。
グルコース濃度が0.5g/になるように、グルコ
ースを連続的に供給し最終的に添加したグルコー
ス量が5%濃度に相当するようになるまで培養を
行なつた。他は実施例1と同様の操作を施した。
その結果を第5表に示した。
【表】
実施例 3
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌である、
エシエリヒア・コリMT−10242、FERM BP−20
を使用して、実施例1と同様の操作を行なつた。
得られた結果を第6表に示した。
エシエリヒア・コリMT−10242、FERM BP−20
を使用して、実施例1と同様の操作を行なつた。
得られた結果を第6表に示した。
Claims (1)
- 1 培地中のグルコース濃度が1%以下に保たれ
るようにグルコースを連続的または断続的に添加
することを特徴とするトリプトフアン・シンセタ
ーゼ生産菌エシエリヒア・コリの培養方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56116486A JPS5820186A (ja) | 1981-07-27 | 1981-07-27 | トリプトフアン・シンセタ−ゼ生産菌の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56116486A JPS5820186A (ja) | 1981-07-27 | 1981-07-27 | トリプトフアン・シンセタ−ゼ生産菌の培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5820186A JPS5820186A (ja) | 1983-02-05 |
JPS6142555B2 true JPS6142555B2 (ja) | 1986-09-22 |
Family
ID=14688303
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56116486A Granted JPS5820186A (ja) | 1981-07-27 | 1981-07-27 | トリプトフアン・シンセタ−ゼ生産菌の培養方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5820186A (ja) |
-
1981
- 1981-07-27 JP JP56116486A patent/JPS5820186A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JOURNAL OF CHEMICAL ENGINEERING OF JAPAN=1979 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5820186A (ja) | 1983-02-05 |
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