JP3003966B2 - Ｄｌ−アラニンの製造法 - Google Patents
Ｄｌ−アラニンの製造法Info
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- JP3003966B2 JP3003966B2 JP4016664A JP1666492A JP3003966B2 JP 3003966 B2 JP3003966 B2 JP 3003966B2 JP 4016664 A JP4016664 A JP 4016664A JP 1666492 A JP1666492 A JP 1666492A JP 3003966 B2 JP3003966 B2 JP 3003966B2
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- enzyme
- alanine
- acid
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素法のよるＤＬ−ア
ラニンの製造法に関するものである。ＤＬ−アラニン
は、医薬、食品または化学工業原料として重要なアミノ
酸である。
ラニンの製造法に関するものである。ＤＬ−アラニン
は、医薬、食品または化学工業原料として重要なアミノ
酸である。
【０００２】
【従来の技術】ＤＬ−アラニンの工業的製造法として
は、アセトアルデヒドおよび青酸を原料とする化学合成
法（ストレッカー法及びブッヒュラー法）が知られてい
る。
は、アセトアルデヒドおよび青酸を原料とする化学合成
法（ストレッカー法及びブッヒュラー法）が知られてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記従来法において
は、有毒な原料（アセトアルデヒド及び青酸）を用いる
ため、その取り扱いが難しく安全上の問題があった。本
発明は、上記課題を解決し、より安全性の高い、安価な
基質を用いてＤＬ−アラニンを製造する方法の提供を目
的としてなされたものである。
は、有毒な原料（アセトアルデヒド及び青酸）を用いる
ため、その取り扱いが難しく安全上の問題があった。本
発明は、上記課題を解決し、より安全性の高い、安価な
基質を用いてＤＬ−アラニンを製造する方法の提供を目
的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、酵素法によりフマ
ル酸またはその塩とアンモニアまたはアンモニウム塩か
らＤＬ−アラニンを製造する方法を見いだし、本発明を
完成するに至った。かくして、本発明によれば、アスパ
ルターゼ、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素およびア
ラニンラセミ化酵素の存在下に、フマル酸またはその塩
をアンモニアまたはアンモニウム塩と反応させることを
特徴とするＤＬ−アラニンの製造法が提供される。
を達成すべく鋭意検討を行った結果、酵素法によりフマ
ル酸またはその塩とアンモニアまたはアンモニウム塩か
らＤＬ−アラニンを製造する方法を見いだし、本発明を
完成するに至った。かくして、本発明によれば、アスパ
ルターゼ、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素およびア
ラニンラセミ化酵素の存在下に、フマル酸またはその塩
をアンモニアまたはアンモニウム塩と反応させることを
特徴とするＤＬ−アラニンの製造法が提供される。
【０００５】本発明に使用されるアスパルターゼ〔EC4.
3.1.1〕は、フマル酸にアンモニウムイオンを付加する
反応を可逆的に触媒する酵素［以下、酵素Ａと略称す
る。］である。Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素〔EC
4.1.1.12〕は、Ｌ−アスパラギンのβ−位のカルボキシ
ル基を脱炭酸する反応を触媒する酵素［以下、酵素Ｂと
略称する。］である。アラニンラセミ化酵素は、Ｌ−又
はＤ−アラニンをラセミ化しＤＬ−アラニンを生成する
反応を触媒する活性を有する酵素であり、アラニンラセ
マーゼ〔EC5.1.1.1〕、低基質特異性アミノ酸ラセマー
ゼ［ソーダ・ケイとオースミ・ティー(Soda,K & Osumi,
T)著、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods inE
nzymology)17B巻 629〜636(1971) アカデミック・プレ
ス(Academic Press)社刊参照］等が好適に用いられる
［以下、酵素Ｃと略称する。］。
3.1.1〕は、フマル酸にアンモニウムイオンを付加する
反応を可逆的に触媒する酵素［以下、酵素Ａと略称す
る。］である。Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素〔EC
4.1.1.12〕は、Ｌ−アスパラギンのβ−位のカルボキシ
ル基を脱炭酸する反応を触媒する酵素［以下、酵素Ｂと
略称する。］である。アラニンラセミ化酵素は、Ｌ−又
はＤ−アラニンをラセミ化しＤＬ−アラニンを生成する
反応を触媒する活性を有する酵素であり、アラニンラセ
マーゼ〔EC5.1.1.1〕、低基質特異性アミノ酸ラセマー
ゼ［ソーダ・ケイとオースミ・ティー(Soda,K & Osumi,
T)著、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods inE
nzymology)17B巻 629〜636(1971) アカデミック・プレ
ス(Academic Press)社刊参照］等が好適に用いられる
［以下、酵素Ｃと略称する。］。
【０００６】酵素Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ精製された
純粋な蛋白質の形態で用いることができるが、通常は該
酵素活性を含有する生物体、特に好ましくは微生物菌体
又はその処理物の形態で用いられる。ここでいう「処理
物」とは、例えば菌体の破砕物（破砕はそれ自体既知
の、例えば超音波処理、圧搾などの方法を用いて行うこ
とができる。）、菌体又は菌体の破砕物の固定化物（固
定化はそれ自体既知の、例えばポリアクリルアミドゲ
ル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲルへの抱括処理等
の方法を用いて行うことができる。）等を意味する。さ
らに微生物菌体を用いるときは、酵素Ａ、Ｂ及びＣの一
種類をそれぞれ実質的に含有する菌体を組み合わせて用
いることができるが、二種類以上の活性を同時に含有す
る菌体を組み合わせて、あるいは単独で用いることが、
好ましい態様である。
純粋な蛋白質の形態で用いることができるが、通常は該
酵素活性を含有する生物体、特に好ましくは微生物菌体
又はその処理物の形態で用いられる。ここでいう「処理
物」とは、例えば菌体の破砕物（破砕はそれ自体既知
の、例えば超音波処理、圧搾などの方法を用いて行うこ
とができる。）、菌体又は菌体の破砕物の固定化物（固
定化はそれ自体既知の、例えばポリアクリルアミドゲ
ル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲルへの抱括処理等
の方法を用いて行うことができる。）等を意味する。さ
らに微生物菌体を用いるときは、酵素Ａ、Ｂ及びＣの一
種類をそれぞれ実質的に含有する菌体を組み合わせて用
いることができるが、二種類以上の活性を同時に含有す
る菌体を組み合わせて、あるいは単独で用いることが、
好ましい態様である。
【０００７】本発明で使用される酵素Ａを含有する微生
物菌体としては、ブレビバクテリウム属に属する酵素Ａ
含有菌体、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）、同MJ-233
-AB-41（FERM BP-1498）等が好適に用いられる。酵素Ｂ
を含有する微生物菌体としては、シュードモナス属の属
する酵素Ｂ含有菌体、例えばシュードモナス・ダクネー
（Pseudomonas dacunhae）IAM 1152、同ATCC 21192、シ
ュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 218
12、同IAM 1506、シュードモナス・フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescens）IFO 3081、シュードモナ
ス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）IAM105
4等を挙げることができる。酵素Ｃを含有する微生物菌
体としては、例えば上記シュードモナス・ダクネーIAM
1152、同ATCC 21192、シュードモナス・プチダ IFO 129
96、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas s
p.）ATCC 23713、サルモネラ・ティフィムリウム（Salm
onella typhimurium）ATCC 19585、バチルス・サブティ
ルス（Bacillussubtilis）ATCC 6051、バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Bacillus stearo-thermophilus）
ATCC 12980等が挙げられる。
物菌体としては、ブレビバクテリウム属に属する酵素Ａ
含有菌体、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）、同MJ-233
-AB-41（FERM BP-1498）等が好適に用いられる。酵素Ｂ
を含有する微生物菌体としては、シュードモナス属の属
する酵素Ｂ含有菌体、例えばシュードモナス・ダクネー
（Pseudomonas dacunhae）IAM 1152、同ATCC 21192、シ
ュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 218
12、同IAM 1506、シュードモナス・フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescens）IFO 3081、シュードモナ
ス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）IAM105
4等を挙げることができる。酵素Ｃを含有する微生物菌
体としては、例えば上記シュードモナス・ダクネーIAM
1152、同ATCC 21192、シュードモナス・プチダ IFO 129
96、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas s
p.）ATCC 23713、サルモネラ・ティフィムリウム（Salm
onella typhimurium）ATCC 19585、バチルス・サブティ
ルス（Bacillussubtilis）ATCC 6051、バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Bacillus stearo-thermophilus）
ATCC 12980等が挙げられる。
【０００８】本発明の方法に用いられる酵素の供給源と
して使用される微生物菌体の培養は、上記微生物を通常
の方法で行うことができる。培地に用いられる炭素源と
しては、酵素Ａを含有する微生物についてはグルコー
ス、フラクトース等の炭水化物、エタノール、グリセロ
ール等のアルコールを、酵素Ｂを含有する微生物につい
てはフマル酸、コハク酸、アスパラギン酸等の有機酸、
アミノ酸を、酵素Ｃについてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース等の炭化水素、エタ
ノール、酒石酸、コハク酸等を用いることができる。培
地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機
塩を用いることができ、またペプトン、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カザミノ酸等の有機窒素源を使
用することができる。無機塩としては、リン酸一水素カ
リウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸マンガン、硫酸第一鉄等、微生物の培養に通常用いら
れる塩類を使用することができる。
して使用される微生物菌体の培養は、上記微生物を通常
の方法で行うことができる。培地に用いられる炭素源と
しては、酵素Ａを含有する微生物についてはグルコー
ス、フラクトース等の炭水化物、エタノール、グリセロ
ール等のアルコールを、酵素Ｂを含有する微生物につい
てはフマル酸、コハク酸、アスパラギン酸等の有機酸、
アミノ酸を、酵素Ｃについてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース等の炭化水素、エタ
ノール、酒石酸、コハク酸等を用いることができる。培
地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機
塩を用いることができ、またペプトン、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カザミノ酸等の有機窒素源を使
用することができる。無機塩としては、リン酸一水素カ
リウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸マンガン、硫酸第一鉄等、微生物の培養に通常用いら
れる塩類を使用することができる。
【０００９】酵素Ａ含有微生物菌体の培養は通気撹拌、
振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜４０
℃、好ましくは２８〜３７℃で行う。培養途中のｐＨは
５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、培養中のｐＨ
の調整には、酸又はアルカリを添加して行う。培養開始
時の培地の炭素源の濃度は０．０５〜１０（W/V）％で
あり、例えばグルコースを使用する場合、その濃度は好
ましくは０．０５〜１．０（W/V）％、さらに好ましく
は０．１〜０．３（W/V）％である。培養期間は１０時
間〜４日間、好ましくは１５時間〜３日間である。
振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜４０
℃、好ましくは２８〜３７℃で行う。培養途中のｐＨは
５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、培養中のｐＨ
の調整には、酸又はアルカリを添加して行う。培養開始
時の培地の炭素源の濃度は０．０５〜１０（W/V）％で
あり、例えばグルコースを使用する場合、その濃度は好
ましくは０．０５〜１．０（W/V）％、さらに好ましく
は０．１〜０．３（W/V）％である。培養期間は１０時
間〜４日間、好ましくは１５時間〜３日間である。
【００１０】酵素Ｂ含有微生物菌体の培養は通気撹拌、
振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜４０
℃、好ましくは２８〜３２℃で行う。培養途中のｐＨは
５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、培養中のｐＨ
の調整には、酸又はアルカリを添加して行う。培養開始
時の培地の炭素源の濃度は０．０５〜１０（W/V）％で
あり、例えばフマル酸を使用する場合、その濃度は、好
ましくは０．１〜５（W/V）％、さらに好ましくは０．
５〜２（W/V）％である。培養期間は８時間〜４日間、
好ましくは１０時間〜３日間である。
振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜４０
℃、好ましくは２８〜３２℃で行う。培養途中のｐＨは
５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、培養中のｐＨ
の調整には、酸又はアルカリを添加して行う。培養開始
時の培地の炭素源の濃度は０．０５〜１０（W/V）％で
あり、例えばフマル酸を使用する場合、その濃度は、好
ましくは０．１〜５（W/V）％、さらに好ましくは０．
５〜２（W/V）％である。培養期間は８時間〜４日間、
好ましくは１０時間〜３日間である。
【００１１】酵素Ｃ含有微生物菌体の培養は通気撹拌、
振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜９０
℃、好ましくは２８〜８０℃で行う。培養途中のｐＨは
５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、培養中のｐＨ
の調整には、酸又はアルカリを添加して行う。培養開始
時の培地の炭素源の濃度は０．０５〜１０（W/V）％で
あり、例えばグルコースを使用する場合、その濃度は、
好ましくは０．０５〜２（W/V）％、さらに好ましくは
０．０５〜１．５（W/V）％である。培養期間は８時間
〜５日間、好ましくは１０時間〜４日間である。
振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜９０
℃、好ましくは２８〜８０℃で行う。培養途中のｐＨは
５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、培養中のｐＨ
の調整には、酸又はアルカリを添加して行う。培養開始
時の培地の炭素源の濃度は０．０５〜１０（W/V）％で
あり、例えばグルコースを使用する場合、その濃度は、
好ましくは０．０５〜２（W/V）％、さらに好ましくは
０．０５〜１．５（W/V）％である。培養期間は８時間
〜５日間、好ましくは１０時間〜４日間である。
【００１２】本発明の方法においては、上記のようにし
て調製された微生物菌体又はその処理物の存在下、フマ
ル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウム塩を含有
する水溶液に酵素を反応させる。ここで該水溶液に添加
されるフマル酸又はその塩の濃度は、０．５〜５０（W/
V）％、好ましくは３〜３０（W/V）％である。アンモニ
ア又はアンモニウム塩の添加濃度としては、アンモニウ
ム濃度として０．１〜５mol/l、好ましくは０．５〜５m
ol/lである。該水溶液にはさらに、ピリドキサル５’−
リン酸を０．０００５〜０．０５（W/V）％、好ましく
は０．００１〜０．０１(W/V)％、塩化カルシウム、水
酸化カルシウム等のカルシウム塩または塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩を、カルシウ
ム又はマグネシウムの濃度として１〜５０mM、好ましく
は５〜４０mM用いることができる。さらに必要な場合に
は、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレン
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート等を０．０１〜０．５（W/V）％、
好ましくは０．０３〜０．２（W/V）％を添加すること
ができる。また必要な場合には、ピルビン酸、α−ケト
酪酸等のα−ケト酸を０．０００１〜０．５（W/V）
％，好ましくは０．００１〜０．２（W/V）％を用いる
ことができる。
て調製された微生物菌体又はその処理物の存在下、フマ
ル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウム塩を含有
する水溶液に酵素を反応させる。ここで該水溶液に添加
されるフマル酸又はその塩の濃度は、０．５〜５０（W/
V）％、好ましくは３〜３０（W/V）％である。アンモニ
ア又はアンモニウム塩の添加濃度としては、アンモニウ
ム濃度として０．１〜５mol/l、好ましくは０．５〜５m
ol/lである。該水溶液にはさらに、ピリドキサル５’−
リン酸を０．０００５〜０．０５（W/V）％、好ましく
は０．００１〜０．０１(W/V)％、塩化カルシウム、水
酸化カルシウム等のカルシウム塩または塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩を、カルシウ
ム又はマグネシウムの濃度として１〜５０mM、好ましく
は５〜４０mM用いることができる。さらに必要な場合に
は、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレン
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート等を０．０１〜０．５（W/V）％、
好ましくは０．０３〜０．２（W/V）％を添加すること
ができる。また必要な場合には、ピルビン酸、α−ケト
酪酸等のα−ケト酸を０．０００１〜０．５（W/V）
％，好ましくは０．００１〜０．２（W/V）％を用いる
ことができる。
【００１３】本発明における酵素反応時のｐＨは６．０
〜１０．０、好ましくは７．０〜９．０であり、反応温
度は約３０〜５０℃、好ましくは３７〜４７℃であり、
反応は通常５〜７２時間行われる。反応は、反応液中の
菌体又は処理物が反応液と均一に分散する程度の撹拌又
は振盪下に行われる。反応液中の酵素濃度には特に制限
はないが、通常０．１〜５０（W/V）％、好ましくは
０．５〜３０（W/V）％である。酵素Ａ、Ｂ及びＣは同
時に反応液中に投入してもよいし、最終的に基質が目的
のＤＬ−アラニンに変換される限り、順番に、逐次的に
あるいは連続的に投入してもよい。反応液に生成したＤ
Ｌ−アラニンの分離精製は、公知のイオン交換樹脂、晶
析等の手法により行うことができる。
〜１０．０、好ましくは７．０〜９．０であり、反応温
度は約３０〜５０℃、好ましくは３７〜４７℃であり、
反応は通常５〜７２時間行われる。反応は、反応液中の
菌体又は処理物が反応液と均一に分散する程度の撹拌又
は振盪下に行われる。反応液中の酵素濃度には特に制限
はないが、通常０．１〜５０（W/V）％、好ましくは
０．５〜３０（W/V）％である。酵素Ａ、Ｂ及びＣは同
時に反応液中に投入してもよいし、最終的に基質が目的
のＤＬ−アラニンに変換される限り、順番に、逐次的に
あるいは連続的に投入してもよい。反応液に生成したＤ
Ｌ−アラニンの分離精製は、公知のイオン交換樹脂、晶
析等の手法により行うことができる。
【００１４】
【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明す
る。なお、実施例及び参考例において、％は特記しない
限り（W/V）％を意味する。 参考例１ 酵素Ａ含有菌体の調製 培地（尿素 ０．４％、硫酸アンモニウム １．４％、
ＫＨ2ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
２ppm、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ppm、ＭｎＳＯ4・４〜
６Ｈ2Ｏ ２ppm、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ppm、ＮａＣｌ
２ppm、ビオチン ２００μｇ／1000ml、チアミン・
ＨＣｌ １００μｇ／1000ml、カザミノ酸 ０．１％及
び酵母エキス ０．１％）１００mlを５００ml容三角フ
ラスコに分注し、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０に調整）した
後、この培地にブレビバクテリウム・フラバムMJ-233
（FERM BP-1497）と、同MJ-233−AB-41（FERM BP-149
8）をそれぞれ別々に植菌し、無菌的に５０％グルコー
スを２ml加え、３０℃にて２日間振盪培養を行った。
る。なお、実施例及び参考例において、％は特記しない
限り（W/V）％を意味する。 参考例１ 酵素Ａ含有菌体の調製 培地（尿素 ０．４％、硫酸アンモニウム １．４％、
ＫＨ2ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
２ppm、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ppm、ＭｎＳＯ4・４〜
６Ｈ2Ｏ ２ppm、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ppm、ＮａＣｌ
２ppm、ビオチン ２００μｇ／1000ml、チアミン・
ＨＣｌ １００μｇ／1000ml、カザミノ酸 ０．１％及
び酵母エキス ０．１％）１００mlを５００ml容三角フ
ラスコに分注し、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０に調整）した
後、この培地にブレビバクテリウム・フラバムMJ-233
（FERM BP-1497）と、同MJ-233−AB-41（FERM BP-149
8）をそれぞれ別々に植菌し、無菌的に５０％グルコー
スを２ml加え、３０℃にて２日間振盪培養を行った。
【００１５】次に、本培養培地（硫酸アンモニウム
２．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ００５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０
５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＦｅＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ２０ppm、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ppm、ビ
オチン ２００μｇ／1000ml、チアミン・ＨＣｌ １０
０μｇ／1000ml、カザミノ酸 ０．３％及び酵母エキス
０．３％）１０００mlを２０００ｍ容通気撹拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、無菌的に５０％グ
ルコース２０mlと前記培養物の２０mlをそれぞれ別々に
添加して、回転数１０００rpm、通気量１vvm、温度３３
℃、ｐＨ７．６にて１５時間培養を行った。なお、グル
コースは、培養中の培地の濃度が１％を越えないよう
に、５０％グルコースを約１〜２時間ごとに断続的に添
加した。培養終了後、培養物１０００mlから遠心分離に
より集菌した。得られた菌体を５％濃度で、［Ｌ−アス
パラギン酸１００ｇ、アンモニア（２８％アンモニア含
有水溶液）１４０ml、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２．２ｇ、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート０．８
ｇ；蒸留水１ｌ中に含有］の水溶液に均一に懸濁した
後、４５℃にて５時間加熱処理し、ついで遠心分離して
菌体を回収した。
２．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ００５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０
５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＦｅＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ２０ppm、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ppm、ビ
オチン ２００μｇ／1000ml、チアミン・ＨＣｌ １０
０μｇ／1000ml、カザミノ酸 ０．３％及び酵母エキス
０．３％）１０００mlを２０００ｍ容通気撹拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、無菌的に５０％グ
ルコース２０mlと前記培養物の２０mlをそれぞれ別々に
添加して、回転数１０００rpm、通気量１vvm、温度３３
℃、ｐＨ７．６にて１５時間培養を行った。なお、グル
コースは、培養中の培地の濃度が１％を越えないよう
に、５０％グルコースを約１〜２時間ごとに断続的に添
加した。培養終了後、培養物１０００mlから遠心分離に
より集菌した。得られた菌体を５％濃度で、［Ｌ−アス
パラギン酸１００ｇ、アンモニア（２８％アンモニア含
有水溶液）１４０ml、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２．２ｇ、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート０．８
ｇ；蒸留水１ｌ中に含有］の水溶液に均一に懸濁した
後、４５℃にて５時間加熱処理し、ついで遠心分離して
菌体を回収した。
【００１６】参考例２ 酵素Ｂ含有菌体の調製 培地（フマル酸ナトリウム ０．５％、フマル酸アンモ
ニウム １．０％、酵母エキス ０．５％、ＫＨ2ＰＯ4
０．１％及びＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ｐＨ
７．０）１００mlを５００ml容三角フラスコに分注し、
１２０℃で２０分間滅菌したものに、シュードモナス・
ダクネ IAM 1152 を一白金耳植菌し、３０℃で１２時間
振盪培養を行った。上記培地の１５００mlを３０００ml
容ジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分間滅
菌したものに、前記三角フラスコ培養液を３０ml植菌
し、回転数６００rpm、通気量１vvm、３０℃で培養を行
った。濃硫酸を脱イオン水で５倍希釈した液を用いてｐ
Ｈを７．３に調節し、同時に培養途中の溶存酸素濃度を
溶存酸素電極（オリエンタル電気製、Ｓ−１型）を用い
て測定し、炭素源であるフマル酸の消費枯渇に伴う溶存
酸素濃度の上昇を観察した時点で、２０％フマル酸アン
モニウム水溶液（ｐＨ６．５）を１００mlづつ計２回添
加しながら培養を続け、１９時間後に培養を終了し、遠
心分離により培養物１ｌより菌体を回収した。得られた
菌体を０．９％ＮａＣｌ水溶液に懸濁、遠心分離による
洗浄を３回繰り返した。
ニウム １．０％、酵母エキス ０．５％、ＫＨ2ＰＯ4
０．１％及びＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ｐＨ
７．０）１００mlを５００ml容三角フラスコに分注し、
１２０℃で２０分間滅菌したものに、シュードモナス・
ダクネ IAM 1152 を一白金耳植菌し、３０℃で１２時間
振盪培養を行った。上記培地の１５００mlを３０００ml
容ジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分間滅
菌したものに、前記三角フラスコ培養液を３０ml植菌
し、回転数６００rpm、通気量１vvm、３０℃で培養を行
った。濃硫酸を脱イオン水で５倍希釈した液を用いてｐ
Ｈを７．３に調節し、同時に培養途中の溶存酸素濃度を
溶存酸素電極（オリエンタル電気製、Ｓ−１型）を用い
て測定し、炭素源であるフマル酸の消費枯渇に伴う溶存
酸素濃度の上昇を観察した時点で、２０％フマル酸アン
モニウム水溶液（ｐＨ６．５）を１００mlづつ計２回添
加しながら培養を続け、１９時間後に培養を終了し、遠
心分離により培養物１ｌより菌体を回収した。得られた
菌体を０．９％ＮａＣｌ水溶液に懸濁、遠心分離による
洗浄を３回繰り返した。
【００１７】参考例３ 酵素Ｃ含有菌体の調製 培地（グリセロール ２０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １．６ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ５．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３．０ｇ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
８０ｍｇ、酵母エキス １．０ｇ、ペプトン １．０
ｇ、蒸溜水 １０００ml：ｐＨ７．２）１００mlを５０
０ml容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌
処理したものに、シュードモナス・プチダ IFO 12996
を植菌し、３７℃で１日間振盪培養した後、該培養物の
２０mlを同様にして調製した培地１０００mlに接種し、
３７℃にて回転数６００rpm、通気量１vvm、ｐＨ７．２
（２８％アンモニア水で調整）にて１５時間培養した。
培養終了後、該培養液から遠心分離（８０００rpm、１
５分間、４℃）にて集菌した。
Ｋ2ＨＰＯ4 ５．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３．０ｇ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
８０ｍｇ、酵母エキス １．０ｇ、ペプトン １．０
ｇ、蒸溜水 １０００ml：ｐＨ７．２）１００mlを５０
０ml容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌
処理したものに、シュードモナス・プチダ IFO 12996
を植菌し、３７℃で１日間振盪培養した後、該培養物の
２０mlを同様にして調製した培地１０００mlに接種し、
３７℃にて回転数６００rpm、通気量１vvm、ｐＨ７．２
（２８％アンモニア水で調整）にて１５時間培養した。
培養終了後、該培養液から遠心分離（８０００rpm、１
５分間、４℃）にて集菌した。
【００１８】実施例１ 参考例１で調製したブレビバクテリウム・フラバムMJ-2
33（FERM BP-1497）菌体（酵素Ａ）、参考例２で調製し
たシュードモナス・ダクネIAM 1152 菌体（酵素Ｂ及び
Ｃ）各々３ｇを１００mlの反応液（フマル酸アンモニウ
ム１．０M、ピリドキサル５'−リン酸４０μM、ＣａＣ
ｌ2 １５mM、ピルビン酸５mM、ｐＨ７．５）に懸濁し、
４５℃にて反応を行った。２４時間後、遠心により菌体
を除去し、上清のアラニン生成量を高速液体クロマトグ
ラフにて測定したところ０．６Mであった。さらに光学
純度を、高速液体クロマトグラフにて光学分割カラム
（クラウンパックＣＲ(＋)）（ダイセル化学社製）を用
いて分析したところ、Ｄ−体、Ｌ−体等モルの混合物で
あることがわかった。
33（FERM BP-1497）菌体（酵素Ａ）、参考例２で調製し
たシュードモナス・ダクネIAM 1152 菌体（酵素Ｂ及び
Ｃ）各々３ｇを１００mlの反応液（フマル酸アンモニウ
ム１．０M、ピリドキサル５'−リン酸４０μM、ＣａＣ
ｌ2 １５mM、ピルビン酸５mM、ｐＨ７．５）に懸濁し、
４５℃にて反応を行った。２４時間後、遠心により菌体
を除去し、上清のアラニン生成量を高速液体クロマトグ
ラフにて測定したところ０．６Mであった。さらに光学
純度を、高速液体クロマトグラフにて光学分割カラム
（クラウンパックＣＲ(＋)）（ダイセル化学社製）を用
いて分析したところ、Ｄ−体、Ｌ−体等モルの混合物で
あることがわかった。
【００１９】実施例２ 参考例２で調製したシュードモナス・ダクネIAM 1152を
５％濃度になるように、ピリドキサル５'−リン酸０．
１mM、ピルビン酸１０mM及びポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート０．０５％からなる水溶液に懸濁
し、５０℃で２時間加熱処理を行った後、遠心分離によ
り菌体を回収した。参考例１で調製したブレビバクテリ
ウム・フラバムMJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、上記の
加熱したシュードモナス菌体、参考例３で調製したシュ
ードモナス・プチダ IFO 12996 菌体各２ｇを１００ml
の実施例１と同じ反応液に懸濁し、４０℃で２０時間反
応を行った。反応液より遠心分離により菌体を除去し、
実施例１と同様に生成アラニン量、純度を測定した。生
成アラニン濃度は０．９Mであり、Ｄ−体、Ｌ−体を等
モル含んでいた。
５％濃度になるように、ピリドキサル５'−リン酸０．
１mM、ピルビン酸１０mM及びポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート０．０５％からなる水溶液に懸濁
し、５０℃で２時間加熱処理を行った後、遠心分離によ
り菌体を回収した。参考例１で調製したブレビバクテリ
ウム・フラバムMJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、上記の
加熱したシュードモナス菌体、参考例３で調製したシュ
ードモナス・プチダ IFO 12996 菌体各２ｇを１００ml
の実施例１と同じ反応液に懸濁し、４０℃で２０時間反
応を行った。反応液より遠心分離により菌体を除去し、
実施例１と同様に生成アラニン量、純度を測定した。生
成アラニン濃度は０．９Mであり、Ｄ−体、Ｌ−体を等
モル含んでいた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:38） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 アスパルターゼ、Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素およびアラニンラセミ化酵素の存在下に、
フマル酸またはその塩をアンモニアまたはアンモニウム
塩と反応させることを特徴とするＤＬ−アラニンの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4016664A JP3003966B2 (ja) | 1992-01-31 | 1992-01-31 | Ｄｌ−アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4016664A JP3003966B2 (ja) | 1992-01-31 | 1992-01-31 | Ｄｌ−アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05211879A JPH05211879A (ja) | 1993-08-24 |
| JP3003966B2 true JP3003966B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=11922599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4016664A Expired - Lifetime JP3003966B2 (ja) | 1992-01-31 | 1992-01-31 | Ｄｌ−アラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3003966B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105624223B (zh) * | 2014-10-29 | 2019-09-03 | 宜兴市前成生物有限公司 | 一种制备dl-丙氨酸和d-丙氨酸的方法 |
-
1992
- 1992-01-31 JP JP4016664A patent/JP3003966B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05211879A (ja) | 1993-08-24 |
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