JPH04197190A - Ｌ―アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法によるＬ−アラニンの製造法に関する
ものである。Ｌ−アラニンは周知のごとく、医薬、食品
または化学工業原料として重要なアミノ酸であり、その
需要が近年急激に増加しつつある。

（従来の技術） Ｌ−アラニンの工業的製造法としては、アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素含有菌体を用いて、Ｌ−アスパラギン酸
の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭５３−２７
７９２号公報）が提案されている。

該脱炭酸酵素を含む微生物の培養法としては、培地中に
乳酸やピルビン酸を添加する方法（特公昭６０−１９９
９７号公報）、Ｌ−グルタミン酸を添加する方法（特公
昭５３−２７３５５号公報）などが提案されている。

これらの方法は、原料して比較的高価なし一アスパラギ
ン酸を使用することおよび培地に添加される有機酸やア
ミノ酸も高価であるため、工業的製造法として有利な方
法であるとは言い難い。

比較的安価なＬ−アラニンの製造法として、本発明者ら
は、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体またはその
処理物とアスパルターゼ含有微生物菌体またはその処理
物の存在下に、水性溶媒中でフマル酸またはその塩とア
ンモニアまたはアンモニウムイオンとを単一の反応器で
反応させてＬ−アラニンを生成させるに際し、反応液に
少なくともα−ケト酸を含有させ、４０〜５０℃の反応
温度で該反応を行うＬ−アラニンの製造法を提案してい
る（ヨーロッパ特許公開第０３８６４７６＾１号）。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、工業的に安価に且つ高収量でＬ−アラニンを
製造する方法を提供することを目的とし、フマル酸また
はその塩とアンモニアまたはアンモニウムイオンとを反
応原料として使用してＬ−アラニンを製造する際に、特
定のアスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体を使用する
ことにより、その目的を達成しようというものである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体また
はその処理物とアスパルターゼ含有微生物菌体またはそ
の処理物の存在下に、水性溶媒中でフマル酸またはその
塩とアンモニアまたはアンモニウムイオンとを単一の反
応器で反応させてＬ−アラニンを生成させるに際し、キ
レート剤を含有する培地で培養したアスパラギン酸β−
脱炭酸酵素含有−菌体またはその処理物を用いて該反応
を行うことを特徴とするＬ−アラニンの製造法にある。

（発明の詳細な説明） 本発明によるＬ−アラニンの製造に用いられる反応原料
は、フマル酸またはその塩およびアンモニアまたは、ア
ンモニウムイオンである。

フマル酸の塩としては、例えばアンモニウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを挙げることが
できる。アンモニウムイオン源としては、塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウムなどである。

これら反応原料の使用量は、フマル酸またはその塩の濃
度として、０．５〜３０重量％、好ましくは５〜１５重
量％、アンモニアまたはアンモニウムイオンの添加濃度
として、０．１〜５モル、好ましくは０．５〜３．５モ
ルである。

本発明で使用されるアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含
有する微生物菌体としては、該酵素活性を有しシュード
モナス属に属するものであればいずれの菌体をも用いう
るが、例えばシュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｄａｃｕｎｈａｅ）　Ｉ　Ａ　Ｍ１１５２
、同ＡＴＣＣ２１１９２、シュードモナス・プチダ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　ＡＴＣＣ２１
８１２、同ＩＡＭ１５０６、シュードモナス・フルオレ
ッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅ
ｎｓ）　Ｉ　Ｆ　０３０８１、シュードモナス・アエル
ギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）　Ｉ　ＡＭ　１０５４などが挙げられ、これらの菌
体が好適に用いられる。愛な、上記微生物菌体の処理物
、即ち菌体の破壊物を使用することもできる。菌体の破
壊は、それ自体既知の、例えば超音波処理、圧搾などの
方法を用いて行うことができる。

アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有微生物菌体の調製に
使用される培地としては、一般に使用されるものでよい
が、本発明゛ではこの培地にキレート剤を存在させるこ
とが特徴である。

キレート剤としては、培地中の金属イオンとキレートを
形成するものであればいがなるものでも使用することが
でき、例えばエートレンジアミン四酢Ｆｉ（ＥＤＴＡ）
　、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチル）四
酢ｉ１　（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチレンジアミン三
酢酸（ＨＥＤＴＡ）　、ジエチレントリアミン五酢酸（
ＤＴＰＡ）　、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、）リエチレ
ンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）もしくはこれらの塩、
または〇−フェナンスロリンなどが好適に用いられる。

キレート剤の濃度は、用いるキレート剤の種類によって
も異なるが、通常０．００１〜５ｇ／ｌ、好ましくは０
，０１〜２ｇ／ｌが適当て′ある。キレート剤の培地へ
の添加時期は、培養開始前後を問わないが、培養中期ま
でに行うことが好ましい。

アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体の調製に用いら
れる培地の炭素源としては、特に制限はないが、例えば
フマル酸、コハク酸、アスパラギン酸などを挙げること
ができ、中でもフマル酸が好ましい、培地の窒素源とし
ては、アンモニア、８Ｍアンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機塩を用いること
ができるし、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カザミノ酸などの有機栄養源を使用することが
できる。無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムなど−が用いられ
る。

アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有微生物菌体の培養は
、通気撹拌、振盪などの好気的条件下で行い、培養温度
は２０〜４０℃、好ましくは２８〜３２℃である。培養
中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近であり、そ
の調整は酸ｔたはアルカリを用いて行う、培養開始時の
フマル酸濃度は、好ましくは０，１〜５重量％、さらに
好ましくは０．５〜２重量％である。培養時間は１０時
間〜４日間、好ましくは１〜３日間である。

一方、本発明に使用されるアスパルターゼ含有微生物菌
体としては、該酵素活性を有し、コリネ型細菌に属する
ものであればいずれの菌株をも用いうるが、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研条寄
第１４９７号）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　
−２３３−ＡＢ−４１（微工研条寄第１４９８号）、ブ
レビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｓａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）　Ａ　Ｔ　
ＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａａ＋ｉｃｕｍ
）　ＡＴＣＣ３１８３０などを挙げることができ、これ
らの菌が好適に用いられる。また、上記微生物菌体の処
理物、即ち菌体の破壊物を使用することもできる。

アスパルターゼ含有菌体の調製に使用される培地は特に
限定されるものでなく、一般に使用されるものでよい、
培地の炭素源としては、グルコース、エタノール、酢酸
やフマル酸などの有機酸などを用いることができる。窒
素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などを用いること
ができる。無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムなどが用いられ
る。この他に菌の生育およびＬ−アスパラギン酸の生成
に必要であれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンステイープリカー、カザミノ酸、各種ビタミンなど
の栄養素を培地に添加することができる。

アスパルターゼ含有微生物菌体の培養は、通気撹拌、振
盪などの好気的条件下で行い、培養温度は２０〜４０℃
、好ましくは２５〜３５℃である。

培養中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近であり
、その調整は酸またはアルカリを用いて行う、培養時間
は２〜９日間、好ましくは４〜７日間である。

このようにして得ちれる培養物から各々菌体を集めて、
水または適当な緩衝液で洗浄し、本発明の酵素反応に使
用される。

フマル酸またはその塩とアンモニアまたはアンモニウム
イオンとの酵素反応は、単一の反応槽で水性溶媒中で行
われる。

該水性溶媒には、さらにピリドキサル５′−リン酸をｏ
　、　ｏｏｏｓ〜０．０５重量％、好ましくは０．００
１〜０．０１重量％およびピルビン酸、α−ケト酪酸な
とのα−ケト酸を０．０００１〜０．５重量％、好まし
くは０．００１〜０．２重量％添加することができる。

さらに必要ならば、非イオン性の界面活性剤、例えばポ
リオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、ポ
リオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートな
どを０．０１〜０．゛５重量％、好ましくは０．０３〜
０．２重量％添加することができる。　本発明の酵素反
応時のｐＨは６．０〜１０．０．好ましくは７．０〜８
．５であり、反応温度は約４０〜５０℃、好ましくは約
４２〜４７℃であり、反応時間は通常約５〜７２時間で
ある。

このような反応方法により反応液中に生成したＬ−アラ
ニンの分離、精製は、公知のイオン交換樹脂処理などに
より行うことができる。

（実施例） 実験例 以下の実験例において、Ｌ−アラニンの定性は、ベーパ
ークロマトグラフのＲｆ値と高速液体クロマトグラフの
保持時間および精製物の比旋光度により確認した。定量
は高速液体クロマトグラフィー（島原ＬＣ−５Ａ）を併
用して行った。また下記の実験例において、％表示は重
量％を意味する。

実験例−１： アスパルターゼ含有菌体の調製（１） Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３菌体の
培養 培地（尿素０．４％、［酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
，Ｐｏ、　０．０５％、Ｋ、ＩＰＯ，０，０５％、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２００，０５＄、Ｃ−ａｃｌｚ・２Ｈｚ０
　２ｐｐｍ、　　Ｆｅ５Ｏ１・７８２０　２ｐｐｍ、Ｍ
ｎ５Ｏｎ”４〜６Ｈｚ０２ｐｐｍ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈ
ｚ０２ｐｐｍ、　ＮａＣｌ２ｐｐｍ、ビオチン２０ｈｇ
／ｌ、チアミン・ＨＣＩ　１０ｈｇ／ｌ、カザミノ酸０
．１％、酵母エキス０．１％）１００ｍｌ−を５００ｍ
１容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）し
た後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を植
菌し、無菌的にエタノールを２ｍｌ加え、３０℃で２日
間振盪培養を行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、Ｋ、ＨＰＯ，０，０５％、ＭｇＳＯ
４・７Ｈ２００，０５に、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２０
ｐｐｍ、Ｍｎ５Ｏ＜・４’−６）１２０２０ｐｐｍ、ビ
オチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣＩ　１１００ｐ
／ｌ、カザミノ酸０．３％、酵母エキス０．３％）　１
０００ｍ　ｌを２１容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２
０℃、２０分）添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気
量１　ｖｖｎ＋、温度３３℃、ｐＨ７，６にて４８時間
培養を行った。

なお、エタノールは培養中培地の濃度が２容量％を越え
な−いように、約１〜２時間ごと断続的に添加し、最終
的に１０００ｍ　ｌまで添加した。

培養終了後、培養物１０００ｍ　ｌから遠心分離して集
菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）にて調製した微生物菌体内にはアスパルターゼ
の他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料のフ
マル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるので、
あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。

上記Ａ）にて調製した菌体を反応液［Ｌ−アスパラギン
酸１００ｇ、アンモニア（２８％アンモニア含有水溶液
）　１４０ｍ１、ＣａＣＬ・２Ｌ０１　ｇ、ポリオキシ
エチレン（２０）ソルビタンモノラウレート０．８ｇを
蒸留水ｌｌ中に含有］１１に懸濁後、４５℃にて５時間
加熱処理を行った。処理物を遠心分離して集菌し、これ
をアスパルターゼ含有菌体として使用した。

実験例−２＝ アスパルターゼ含有菌体の調製（２） Ａ）ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６
８７２菌体の培養 実験例−１で用いたアスパルターゼ含有菌体の調製培地
１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコに分注、滅菌（
滅菌後ｐＨ７，０）した後、ブレビバクテリウム・アン
モニアゲネスＡＴＣＣ６８７２を植菌し、無菌的に５０
％グルコース溶液２ｍｌを加え、３０℃で２４時間ｉ盪
培養を行った。

次に、実験例−１と同じ本培養培地１０００ｍ　ｌを２
１容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分）後
、５０％グルコース溶液４０ｍ１と前記培養物２０ｍ１
を添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気量１　ｖｖｍ
、温度３３℃、１）８７．６にて２４時間培養を行った
。なお、グルコースは約１〜２時間ごとに５ｇづつ添加
し、最終的には７０ｇまで添加した。培養終了後、培養
物１０００ｍ　ｌから遠心分離して集菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）にて調製した菌体を実験例−ＩＢ）で用いた反
応液１１に懸濁後、４５℃にて２時間加熱処理を行った
。処理物を遠心分離して集菌後、これをアスパルターゼ
含有菌体として使用した。

実験例−３： アスパルターゼ含有菌体の調製（３） Ａ）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８
３０菌体の培養 実験例−１で用いたアスパルターゼ含有菌体の調製培地
１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコに分注、滅菌（
滅菌後ｐＨ７，０）シた後、コリネバクテリウム・グル
タミカムＡＴＣＣ３１８３０を植菌し、無菌的に５０％
グルコース溶液２ｍｌを加え、３０℃で２４時間振盪培
養を行った。

次に、実験例−１と同じ本培養培地１０００ｍ　ｌを２
１容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分）後
、５０％グルコース溶液４０ｍ１と前記培養物２０ｍ１
を添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気量１ｖｖｍ、
温度３３℃、ｐＨ７，６にて２４時間墳培養行った。な
お、グルコースは約１〜２時間ごとに５ｇづつ添加し、
最終的には７０ｇまで添加した。

培養終了後、培養物１０００ｍ　ｌから遠心分離して集
菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）にて調製した菌体を実験例−ＩＢ）で用いた反
応液１１に懸濁後、４５℃にて２時間加熱処理を行った
。処理物を遠心分離して集菌し、これをアスパルターゼ
含有菌体として使用した。

実験例−４： アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体の調製Ａ〉シュ
ードモナス・ダクネー　ＩＡＭ１１５２菌体の培養 培地（フマル酸ナトリウム０，５％、フマル酸アンモニ
ウム１．０％、コーンステイープリカー１．０％、リン
酸−カリウム０．０５％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０
５＄、　ｐ　Ｈ７，０）　１００　ｍ　ｌを５００ｍ１
容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した
後、シュードモナス・ダクネー　ＩＡＭ１１５２を植菌
し、３０℃で１日間振盪培養を行った（前培養）０次に
、上記培地にエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．
１％を添加した培地１１を２１容通気撹拌槽に仕込み、
滅菌（１２０℃、２０分）後、前言己培養物２０ｍ１を
添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気量１　ｖｖｎ、
温度３３℃、ｐＨ７，３にて１日間培養を行った。

培養終了後、培養物１０００ｍ　ｌから遠心分離して集
菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）にて調製した微生物菌体内にはアスパラギン酸
β−脱炭酸酵素の他に副反応酵素フマラーゼが共存する
ため、原料のフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題
が生じるので、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を
行った。

上記Ａ）にて調製した菌体を反応液（ピルビン酸ナトリ
ウム０．１１ｇ　、ピリドキサールら°−リン酸１０ｍ
ｇを蒸留水１！中に含有）１１に懸濁後、５０℃にて２
時間加熱処理を行った。処理物を遠心分離して薬菌後、
これをアスパラギンβ−脱炭酸酵素含有菌体として使用
した。

実施例−１ 実験例−１のＢ）と実験例−４のＢ）にて調製した菌体
の懸濁液２００ｍ１から遠心分離により集菌した各微生
物菌体を合併し、反応液［フマル酸アンモニウム１ｍｏ
ｌ、ピルビン酸ナトリウム５ｎ＋ｍｏｌ、ピリドキサー
ル５′−リン酸０．０４ｍｍｏｌ、ポリオキシエチレン
（２０）ソルビタンモノラウレート０．０５％、ｐＨ７
，５（２８％アンモニア水にて調整）］の２００＋＋＋
ｌに懸濁後、１１容通気撹拌槽に仕込み、３７℃で撹拌
回転数３０　Ｏｒｐｍにて２０時間反応した０反応終了
後、反応液中のアラニンを定量し、その結果を第１表に
示した。

該反応液の１００ｍ１をｐ　Ｈ４，０に調整後、煮沸沢
過し、該沢液をアンバーライトＩＲＣ−５０（Ｈ”型）
に溝道後、水洗し次いで４．５％アンモニア水で溶出す
る。この溶出液を減圧濃縮後、冷エタノールにて結晶を
析出させ、し−アラニンを回収した。アラニン回収量を
第１表に示す。

この回収アラニンについて比旋光度を測定したところ、
［α］”１４．３°　（Ｃ＝１０．６Ｎ−ＨＣＩ＞であ
った。

なお、比較例として、実験例−４においてキレート剤（
ＥＤＴＡ）を添加せずに培養し、同様にフマラーゼ活性
の除去処理を施した菌体を用いて酵素反応を行った結果
を第１表に示した。

第１表 実施例−２ 実験例−２のＢ）と実験例−４のＢ）にて調製した菌体
の懸濁液２００ｍ１から遠心分離により集菌した各微生
物菌体を合併し、実施例−１と同様の反応液２００＋ｎ
ｌに懸濁後、１１容通気撹拌槽に仕込み、３７℃で撹拌
回転数３０　Ｏｒｐｍにて２０時間反応した０反応終了
後、反応液中のアラニンを定量し、その結果を第２表に
示、した。

該反応液の１００ｍ１から実施例−１と同様の方法でＬ
−アラニンを回収した。アラニン回収量を第２表に示す
。

この回収アラニンについて比旋光度を測定したところ、
［α］”　１４．３’　　（Ｃ＝１０．６Ｎ−ＨＣＩ＞
であった。

なお、比較例として、実験例−４においてキレート剤（
ＥＤＴＡ）を添加せずに培養し、同様にフマラーゼ活性
の除去処理を施した菌体を用いて酵素反応を行った結果
を第２表に示した。

実施例−３ 実験例−３のＢ）と実験例−４のＢ〉にて調製した菌体
の懸濁液２００ｍ１から遠心分離により気菌しな各微生
物菌体を合併し、実施例−１と同様の反応液２００ｍ１
に懸濁後、ＩＩ容通気撹拌槽に仕込み、３７℃で撹拌回
転数３０　Ｏｒｐｍにて２０時間反応した１反応終了後
、反応液中のアラニンを定量し、その結果を第３表に示
した。

該反応液の１００１から実施例−１と同様の方法でＬ−
アラニンを回収した。アラニン回収量を第３表に示す。

この回収アラニンについて比旋光度を測定したところ、
［α］”１４．３°　（Ｃ＝１０．６Ｎ−ＨＣＩ）であ
った。

なお、比較例として、実験例−４においてキレート剤（
ＥＤＴＡ）を添加せずに培養し、同様にフマラーゼ活性
の除去処理を施した菌体を用いて酵素反応を行った結果
を第３表に示した。

（発明の効果） 以上の結果から明らかなように、本発明の方法によりフ
マル酸またはその塩とアンモニアまたはアンモニウムイ
オンとから、効率よく目的のＬ−アラニンを製造するこ
とができる。

特許出願人　　三菱油化株式会社 代理人　弁理士　　曾　我　道　照 代理人　弁理士　　長　谷　正　久

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体またはその
   処理物とアスパルターゼ含有微生物菌体またはその処理
   物の存在下に、水性溶媒中でフマル酸またはその塩とア
   ンモニアまたはアンモニウムイオンとを単一の反応器で
   反応させてＬ−アラニンを生成させるに際し、キレート
   剤を含有する培地で培養したアスパラギン酸β−脱炭酸
   酵素含有菌体またはその処理物を用いて該反応を行うこ
   とを特徴とするＬ−アラニンの製造法。