JPH048297A - Ｄ―アスパラギン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ１発明の目的 （産業上の利用分野） 本発明は、化学合成法および酵素反応法の融合技術によ
るＤ−アスパラギン酸の製造法に関するものである。本
発明によれは高収量で効率良くＤ−アスパラギン酸を製
造することが出来る。

Ｄ−アスパラギン酸は、周知の如く、医薬、農薬等の中
間原料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年増
加しつつある。

（従来の技術と課題） Ｄ−アスパラギン酸のの工業的製法としては、ＤＬ−ア
スパラギン酸の酵素的脱炭酸によりＬ−アスパラギン酸
からＬ−アラニンを生成せしめ、その後未反応Ｄ−アス
パラギン酸とＬ−アラニンとを分離してＤ−アスパラギ
ン酸を製造する方法（特公昭５３−１８３１号公報）が
提案されている。

しかしこの製造法では、ＤＬ−アスパラギン酸からのＤ
−アスパラギン酸の収量は５０％であること、またＤ−
アスパラギン酸の生産量はＬ−アラニンの需要により制
約を受けること等の問題があり、Ｄ−アスパラギン酸の
より効果的な製造法の開発が望まれていた。

本発明者らは、Ｄ−アスパラギン酸の高効率製造プロセ
スの開発につき鋭意検討を行い、化学合成法と酵素反応
法とを組み合せた融合技術により安価なフマル酸より高
効率にＤ−アスパラギン酸を製造する方法を見いだし本
発明を完成するに到った。

（発明の構成及び効果） 本発明は以下の（１）〜（４）の工程を順に繰り返すこ
とにより、効率良くＤ−アスパラギン酸を製造する方法
を提供するものである。

■　フマル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウム
イオンを水性溶媒中１００℃以上の温度で加熱処理する
ことにより化学合成法によりＤＬ−アスパラギン酸を製
造する。

■　ＤＬ−アスパラギン酸にアスパルターゼを含有する
微生物又はその処理物を作用させて、Ｌ−アスパラギン
酸のみをフマル酸とアンモニアに分解する。

■　クロマト分離により未反応Ｄ−アスパラギン酸とフ
マル酸とを分離する。

■　分離したフマル酸は再度（１）の工程に供する。

本発明によれは、Ｄ−アスパラギン酸をフマル酸から高
効率に製造することができる。

（発明の詳細な説明） 本発明は前記（１）〜（４）の４工程から成り、　「■
工程」では、フマル酸又はその塩およびアンモニア又は
アンモニウムイオンの存在下、１００−１７０℃、好ま
しくは、１３０〜１６０℃で加熱処理することにより効
率良＜ＤＬ−アスパラギン酸を製造する。

フマル酸又はその塩の仕込み濃度は、０．　５〜５モル
／！Ｑ１　　好ましくは、１〜３モル／２である。

また、アンモニア又はアンモニウムイオンの仕込み濃度
は、０．５〜１０モル／ｌ、好ましくは１〜７モル／１
である。反応時のｐＨは６〜１１、好ましくは８〜１０
である。また、反応時間は、１〜４８時間、好ましくは
、２〜２４時間である。

■工程で使用する微生物としては、アスパルターゼを含
有する微生物であれば限定されるものではないが、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｕ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ
−４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９８）、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２
７３２５、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃ。

１ｉ）　Ｂ　　ＡＴＣＣ１１３０３等が好適に用いられ
る。

本発明に用いられる上記微生物は、菌体のまま用いるこ
とも出来るし、超音波破砕等の処理により破砕した菌体
の破砕物をも使用することが出来る。また、菌体又は菌
体破砕物をポリアクリルアミド、アルギン酸、に−カラ
ギーナン等の適当な固定化剤に固定化して使用すること
も出来る。

本発明の方法に使用される上記微生物菌体の調製に使用
する培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物
に使用されるものでよい。例えは・ブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ）属に属する微生物
では、培地の炭素源としては、例えは、グルコース、エ
タノール、フマル酸、リンゴ酸等が使用出来る。培地の
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩を用
いることが出来るし、また、ペプトン、酵母エキス、コ
ーンスチーブリカー、カザミノｒｉ１等の有機栄養源も
使用することが出来る。無機塩としては、リン酸−水素
カリウム、リン酸二水素カリウム、＠酸マグネシウム等
が用いられる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で行う
。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近に
て行い、培養中のｐＨの調整には、酸又はアルカリを添
加して行う・　培養開始時の培地中の炭素源の濃度は０
．０５〜１０重量％が用いられ、具体例としてグルコー
スを使用する場合、グルコース濃度は、好ましくは０．
０５〜１．　０重量％、更に好ましくは０．　１〜０．
３重量％が適する。培養期間は１０時間〜４日間、最適
期間は１５時間〜３日間である。

このようにして得られた培養物から各々菌体を集めて、
水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の酵素反応に使用
する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌体
又はその破砕物又はその固定化物の存在下、水性溶媒中
で前記■工程で生成したＤＬ−アスパラギン酸を含有す
る水溶液にて酵素反応せしめる。

ここで該水溶液中に含有するＤＬ−アスパラギン酸の濃
度は０．　３〜４モル／１、好ましくは１〜２モル／尤
である。

なお、ＤＬ−アスパラギン酸は、反応液への溶解度の関
係から溶解させた状態でも粉体で存在（不溶解状態）し
ていてもさしつかえない。反応液のｐＨの調整はアルカ
リ溶液、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の
水溶液が好適に使用される。なお、反応は、アスパルタ
ーゼ活性の低下を防く為、必要によって窒素ガス等の不
活性ガスを通気して行う。本発明において、酵素反応時
のｐＨは７〜１０、好ましくは８〜９てあり、反応温度
は４０〜４７℃、好ましくは４２〜４６℃であり、反応
は通常約３〜４８時間行われる。

なお、反応には、菌体の膜透過性を高めるため、非イオ
ン性の界面活性剤を添加して用いることが出来る。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生成
したフマル酸と未反応Ｄ−アスパラギン酸の分離・精製
は公知の活性炭吸着法又はイオン交換樹脂処理等により
行うことが出来る（前記■工程）。

分離されたフマル酸は、再度前記■工程にてＤＬ−アス
パラギン酸に変換され、これらの工程を繰り返し行うこ
とにより対フマル酸収率８０モル％以上てＤ−アスパラ
ギン酸を製造出来る。

実施例 以下の実施例におけるフマル酸の定量及びアスパラギン
酸の定量は、高速液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−
５Ａ）を用いて行った。また、Ｄ−アスパラギン酸の光
学純度は比旋光度により確認した。

「■工程（第１回目）」： フマル酸からＤＬ−アスパラギン酸の 化学合成工程 反応液（フマル酸１．　１モル／見、アンモニア水（２
５％）３．０モル／１）１０００ｍＪ！を２光圧力容器
に仕込み、１５０℃、３ｋｇ／ｃｍ２て２時間反応させ
た後、該反応液をエバポレーターにて減圧濃縮し、アン
モニアを除去後、２Ｎ−ＮａＯＨにてｐＨを７．５に調
整する。反応液中のＤＬ−アスパラギン酸量は１．　０
モル／１てあった。

「■工程（第１回目）その１」： アスパルターゼ含有菌体の調製 培地（尿素　０．　４％、ｆａ酸アンモニウム　１゜４
％、ＫＨａＰＯｎ　　０．０５％、Ｋ　２　ＨＰ　Ｏａ
　　０゜０５％、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，０５％、Ｃ
ａＣＲ２・２Ｈ２０２ｐｐｍ、　　　Ｆｅ５Ｏａ・７Ｈ
２０２ｐｐｍ−Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４ψ４〜６　Ｈ２０２ｐ
ｐｍ−Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２０２１）　ｐｍ−Ｎ
　＆　Ｃ９２ｐｐｍ、ビオチン　２００　ｕ　ｇ　／　
ｌ、チアミン・ＨＣ尤　１００μｇ／ム　カザミノ酸　
０゜１％、酵母エキス　０．　１％）１００ｍ尤を５０
０　ｍ　Ｎ容三角フラスコに分注、滅菌（ｍ菌後ｐＨ７
，０）Ｌ／た後ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９８）を植菌
し、無菌的に５０　（ＷＴ／Ｖ）％グルコースを４ｍｌ
加え、３０℃にて２日間振盪培養を行った。

次に、本培養培地（ｔ［アンモニウム　２．３％、ＫＨ
２ＰＯ４０，０５％、Ｋ　２ＨＰ　Ｏａ　　Ｏ。

０５％、Ｍｇ５Ｏｔ・７Ｈ２００，０５％、Ｆｅ５Ｏａ
・７Ｈ２０２Ｏｆ）　ｐｍ、Ｍｎ５Ｏａ・４〜６Ｈ２０
２０ｐｐｍ、　　ビオチン　２００　Ｂ　ｇ　／　１１
、チアミン・ＨＣｌ　１００μｇ／Ｊｌ、カザミノ酸０
．　３％、酵母エキス　０．３％）１０００ｍλを２１
容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後
、５０　（ＷＴ／Ｖ）％グルコース４０ｍ見と前記培養
物の２０　ｍ　ｌを添加して、回転数１０００　ｒｐａ
＋、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７゜６にて４８
時間培養を行った。

なお、グルコースは、培養中培地の濃度が１（ＷＴ／Ｖ
）％をこえないように、５０（讐Ｔ／Ｖ）％グルコース
を約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物１０００　ｍ　ｌから遠心分離して
集菌した。

「■工程（第１回目）その２」 アスパルターゼ含有菌体の前処理 （フマラーゼ活性の除去処理） 上記の「■工程（第１回目）その１」にて調製した微生
物菌体内にはアスパルターゼの他に副反応酵素フマラー
ゼが共存する為、原料となるフマル酸が一部リンゴ酸に
変換される問題が生じるので、あらかじめフマラーゼ活
性の除去処理を実施した。

「■工程（′Ｉｆｉ１１回目）そのｌ」にて調製した菌
体を反応Ｗ［Ｌ−アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア
（２８％アンモニア含有水溶液）１４０ｍｌ、ＣａＣ１
２２”　２Ｈ２０２，２ｇ、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート　０．８ｇ；蒸留水１見中に含有］
の１．２に懸濁後、４５℃にて５時間加熱処理を行った
。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をアスパル
ターゼ含有菌体として使用した。

「■工程（第１回目）その３」 Ｌ−アスパラギン酸のみをフマル酸 とアンモニアに分解する工程 上記の「■工程」で合成したＤＬ−アスパラギン酸１モ
ル／１溶液（ｐ　Ｈ７，５）を含む２１反応槽に「■工
程（第１回目）そのｌ」と「■工程（第１回目）その２
」で調製した菌体５０ｇ　（湿菌体）を添加し、４６℃
にて５００　ｒｐｍの攪拌条件下で２０時間反応を行っ
た。反応上清液中のフマル酸およびアスパラギン酸量を
定量したところ、フマル酸０．４８モル／見、アスパラ
ギン酸０゜５０モル／１であった。

「■工程（第１回目）」 クロマトグラフによるＤ−アスパラギン酸とフマルの分
離 上記の「反応液」１０００ｍ１を活性炭（しらさぎＫＬ
、式日薬品ｉｔ）カラムに導通し、蒸留水により溶出す
る。この溶出液を減圧濃縮後、冷エタノールにて結晶を
析出乾燥させた。アスパラギン酸結晶の回収量は６４ｇ
であった。さらに回収したアスパラギン酸結晶について
比旋光度を測定したところ［αコＨ＝−２５．５℃（Ｃ
＝１０．２Ｎ−ＨＣｌで光学純度９８％であった。

「■工程（第１回目）」と「■工程（第２回目）」上記
の「■工程（第１回目）」で活性炭カラムに吸着された
フマル酸を２Ｎ−アンモニア水１゜５１にて溶出後、　
「■工程（第１回目）」と同様の操作により化学合成反
応を行フた。

反応液中に生成したＤＬ−アスパラギン酸は、０．３モ
ル／１てあった。該水溶液からアンモニアを減圧濃縮装
置にて（５０℃、３ｈｒ）蒸発除去後、２Ｎ−ＮａＯＨ
にてｐＨ７，５に調整する。

゛該調整０．４５モル／見のＤＬ−アスパラギン酸溶液
を次記の「■工程」の７スパルタ一ゼ反応に供する。

「■工程（第２回目）」 前記の「■工程（第１回目）その３」と同様の酵素反応
を１０時間行った。

「■工程（第２回目）」 上記の酵素反応終了液１０００　ｍ　ｌを前記の「■工
程（第１回目）その３」と同様に活性炭カラムに導通し
、蒸留水による流出液からアスパラギン酸の結晶を析出
乾燥させた。アスパラギン酸回収量は２９ｇであった。

該結晶の比旋光度は［α］：＝−２５．５（Ｃ＝１０．
２Ｎ−ＨＣｌ）で光学純度９８％であった。

「■工程（第２回目〉」は第１回目と同様に行う。

以上の如く（１）〜（４）の工程を２回繰り返すことに
よりフマル酸原料から６４モル％の収率でＤ−アスパラ
ギン酸が製造され、ざらに繰り返し計４回の繰り返しに
より、対フマル酸収率８２モル％てＤ−アスパラギン酸
を製造出来た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［ I ］フマル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニ
   ウムイオンを反応原料として以下の（１）〜（４）の工
   程を順に繰り返し行ないＤ−アスパラギン酸を製造する
   ことを特徴とするＤ−アスパラギン酸の製造法。 （１）フマル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウ
   ムイオンを水性溶媒中１００℃以上の温度で加熱処理す
   ることにより化学合成法によりＤＬ−アスパラギン酸を
   製造する。（２）ＤＬ−アスパラギン酸にアスパルター
   ゼを含有する微生物又はその処理物を作用させて、Ｌ−
   アスパラギン酸のみをフマル酸とアンモニアに分解する
   。 （３）クロマト分離により未反応Ｄ−アスパラギン酸と
   フマル酸とを分離する。 （４）分離したフマル酸は再度（１）の工程に供する。