JPH0391489A - Ｌ―セリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｌ−酒石酸を原料として酵素法によりＬ−セ
リンを製造する方法に関する。Ｌ−セリンは医薬原料、
化粧品原料、トリプトファン等の他種アミノ酸の合成中
間体等として種々の産業分野において広い用途を有して
いる。

（従来の技術） Ｌ−セリンの製造法は、人別して、化学的合成法、発酵
法及び酵素的合成法が知られている。化学的合成法はア
ジリジンカルボン酸、α−イソシアノ酢酸アミド等を原
料として合成されるが、いずれの場合もＤＬ一体が合成
され、Ｌ一体を得るには更に光学分割処理を施す必要が
あり、工業的製法としては有利とは言えない。発酵法に
おいてはグリシンを前駆体としてコリネバクテリウム属
菌、ザルシナ属菌、シュードモナス属菌等の微生物を栄
養培地に培養し、培養物中に蓄積したＬ−セリンを分離
・精製して製造される。この場合はＬ一体のみの生産が
行なわれるが、培養物中への蓄積量が少ないこと、また
多種の成分を含んだ発酵液から精製単離する必要があり
、精製コストが嵩むこと、更には大型設備を要すること
等の問題があり、これも工業的に有利な方法とは言えな
い。

一方、酵素的合成法としては、従来、メタノール資化性
菌であるシュードモナス属菌、ハイホミクロビウム属菌
の生産するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
の酵素作用を利用して、グリシンとメタノールまたはホ
ルムアルデヒドから合成する方法が知られている。

しかし、この方法においては原料メタノールまたはホル
ムアルデヒドが反応に阻害的であるため、低濃度で取扱
う必要があること、また、もう一方の原料であるグリシ
ンのＬ−セリンへの変換効率が低いこと等のために、工
業的なＬ−セリンの製法としては必ずしも有利な方法で
はない。従って、より効率的で安価なＬ−セリンの製造
法の開発が望まれている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、工業的に安価に人手し得るＬ−酒石酸を原料
として酵素法を用いてＬ−セリンを製造する方法に関す
るものであり、その目的とするところは、医薬用、化粧
品用、他のアミノ酸等の中間原料として有用なＬ−セリ
ンを工業的に有利に製造する方法を提供することにある
。

（課題を解決する為の手段） 前記課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究を行
なった結果、本発明に到達した。すなわち本発明はＤ−
グリセリン酸にＮＡＤの存在下にＤ−乳酸脱水素酵素、
グリオキシル酸還元酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素
およびβ−ヒドロキシピルビン酸還元酵素からなる群か
ら選ばれた１種また−は２種以上の酵素を作用させてβ
−ヒドロキシピルビン酸を生成させ、該β−ヒドロキシ
ピルビン酸とアンモニアにＮＡＤＨの存在下にＬ−アラ
ニン脱水素酵素またはＬ−セリン脱水素酵素を作用させ
てＬ−セリンを製造することを特徴とするＬ−セリンの
製造法であり、またＬ−酒石酸にＮＡＤの存在下にＬ−
洒石酸脱炭酸酵素を作用させてＤ−グリセリン酸を生成
させ、該Ｄ−グリセリン酸にＮＡＤの存在下にＤ−乳酸
脱水素酵素、グリオキシル酸還元酵素、Ｄ−グリセリン
酸脱水素酵素およびβ−ヒドロキシピルビン酸還元酵素
からなる群から選ばれたＩＭまたは２種以上の酵素を作
用させてβ−ヒドロキシピルビン酸を生成させ、該ヒド
ロキシピルビン酸とアンモニアにＮＡＤＨの存在下にＬ
−アラニン脱水素酵素またはＬ−セリン脱水素酵素を作
用させてＬ−セリンを製造することを特徴とするＬ−セ
リンの製造法である。

本発明では、Ｄ−グリセリン酸にＮＡＤの存在下にＤ−
乳酸脱水素酵素、グリオキシル酸還元酵素、Ｄ−グリセ
リン酸脱水素酵素及びβ−ヒドロキシピルビン酸還元酵
素からなる群から選ばれた１種または２種以上の酵素を
作用させてβ−ヒドロキシピルビン酸を生成させ、同時
に副生したＮＡＤＨを共役させて、該β−ヒドロキシピ
ルビン酸にアンモニア存在下でＬ−アラニン脱水素酵素
を作用させることにより、Ｌ−セリンを効率良く生成し
得る。

更に、Ｌ−酒石酸にＮＡＤの存在下にＬ−洒石酸脱炭酸
酵素を作用させてＤ−グリセリン酸を生成させ、このＤ
−グリセリン酸を前記反応に利用することにより、Ｌ−
酒石酸を原料としてＬ−セリンを効率良く製造し得る。

本発明においては、Ｌ−酒石酸からＤ−グリセリン酸を
生成させる反応においては、Ｌ−洒石酸脱炭酸酵素（Ａ
ｇｒｌｃｕｌｔｕｎａｌ　Ｂｌｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍ１ｓｔｒｙ第５３巻２１０１〜２１０５頁（１９８
９年）に記載）が使用され、また、Ｄ−グリセリン酸よ
りβ−ヒドロキシピルビン酸を生成させる反応において
は、Ｄ−乳酸脱水素酵素（ＥＣＩ、１．１．２７）、グ
リオキシル酸還元酵素（ＥＣＩ、１．１，２１１ｉ）、
Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素（ＥＣＩ　、１，１．２９
）、β−ヒドロキシピルビン酸還元酵素（Ｅｅｌ、Ｉ、
！、８１）からなる群から選ばれた１種または２種以上
の酵素が使用される。

更に、β−ヒドロキシピルビン酸からＬ−セリンを生成
させる反応においては、Ｌ−アラニン脱水素酵素（ＥＣ
Ｉ、４，１．［）またはＬ−セリン脱水素酵素（ＥＣ，
１，４，１，７）が用いられる。これら酵素は公知の動
物、植物または微生物より公知の方法によって調製され
たものを用いることが出来る。またこれらの酵素を用い
る方法としては、これらの酵素をそれぞれ含イ１した動
物、植物または微生物の細胞、これらの酵素の１種また
は２種以上をある特定の動物、植物、または微生物の細
胞に公知の遺伝子組換え技術等の方法によって組換えら
れた細胞、これら細胞の無細胞抽出液、該抽出液から精
製して得られる精製酵素またはこれらの固定化物等とし
て用いることができる。これら酵素の使用濃度は特に限
定されるものでなく、目的に応じて適宜決定されるが、
通常反応液１　ｍ　Ｑ、当り０．１〜１０００単位であ
る。

本発明において原料として使用されるＬ−酒石酸は、化
学合成法によって得られるＬ−酒石酸、ブドウ酒工業に
おいて副産物として得られるＬ−酒石酸等、Ｌ−酒石酸
なら製法を問わず、いずれの方法で得られたものでも使
用可能である。また、酒石酸は遊離の酸として用いられ
るのみならず、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属
塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩
、更には、アンモニウム塩等の塩類としても用いられる
。これら酒石酸または酒石酸塩類の使用濃度は通常０．
１〜１０％で用い得るが、奸ましくは０．５〜１％であ
る。また、本発明において用いられるＤ−グリセリン酸
としては、Ｌ−酒石酸からＬ−洒石酸脱炭酸酵素の作用
によって生成したＤ−グリセリン酸含有反応物または該
反応物より単離されたＤ−グリセリン酸を用いることが
可能である。史に、化学合成法、その他の方法によって
製造されたＤ−グリセリン酸も利用可能である。

そしてこれらは通常、遊離の酸としてのみならず、ナト
リウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マ
グネシウム等のアルカリ土類金ｘ塩、史にはアンモニウ
ム塩等の塩類としても用いられる。

これらＤ−グリセリン酸またはその塩の使用濃度は通常
１〜１０％、好ましくは２〜５％である。

本発明においては補酵素としてＮＡＤが使われるが、こ
れは単独で反応系に添加するかまたは公知の方法で固定
化して固定化物として用いることができる。その使用濃
度は通常反応液１．Ｑ当りｏ、ｉ〜５０μ−であり、好
ましくは１〜ｌＯμ−である。また本発明においてはＮ
ＡＤＨも使われるが、これは通常、Ｄ−グリセリン酸か
らβ−ヒドロキシピルビン酸を生成させる反応によって
副次的に生成するので、必ずしも反応系に添加する必要
はない。すなわち下記式に示されるようにＮＡＤからＮ
ＡＤＨへの変換と、ＮＡＤＨからＮＡＤへの変換は、Ｄ
−グリセリン酸からβ−ヒドロキシピルビン酸への変換
とβ−ヒドロキシピルビン酸からＬ−セリンへの変換と
共役しているので、実際１−はＮＡＤを反応系に添加す
るだけで十分である。

Ｄ−グリセリン酸 β−ヒドロキシピルビン酸 このことは、工業的にＬ−セリンを本発明によって製造
する場合、高価なＮＡＤを多量に用いる必要性がないこ
とから上記共役系を用いる本発明の方法は、経済的に極
めて大きな利点となることが期待される。

（実施例） 次に本発明を実施例を用いて更に詳しく説明する。

Ｌ−セリンの定置法は次の方法により行なった。

高速液体クロマトグラフィー（機種：ＴＯ８ＯＨＬＣ−
８０３Ｄ型、使用カラム：ＴＯ８Ｏ０ＤＳ−１２０Ｔカ
ラム（４，６Ｘ２５０■■））を用い、７−５　ｍＭの
オクタンスルホン酸ナトリウム含有の１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ２，６）を溶出溶媒として、ｔ、ｏｍｆｆ／
分の溶出速度で溶出して定量した。また、本発明によっ
て得られたＬ−セリンの光学純度の確認は、Ｃ旧ＲＡＬ
ＰＡＫＷＨカラム（０、５Ｘ　３０　ｃｍ　、ダイセル
化学工業社製）を用い、ｔ、ｏ−／分の流速で０．２５ ｍ　Ｍ　Ｃｕ　Ｓ　Ｏａ水溶液で溶出し、オーセンティ
ブクなＬ−セリンと同じテンシロンタイムを有するか否
かで判定した。

実施例において使用した酵素は、下記の方法に従って調
製した。

Ｌ−洒石酸脱炭酸酵素の調製 に記載の方法に従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ
、　Ｖ　ｅ　−２５ｔｒａｉｎ　　５　Ｄ　Ｉ　Ａの培
養菌体破砕物より得た粗抽出液を用いた。

グリオキシル酸還元酵素の調製 ホウレン草の葉山来の酵素標品（５１ｇ＋＋＋ａ社製。

ｐｒｏｄｕｃｔ　ＮａＧ　−５２５９）を用いた。

Ｄ−乳酸脱水素酵素の調製 ラクトバシルスライヒマンニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓｔ ％１ｃｈｉｔａｎｎｉ　）由来の酵素標品（Ｓｉｇｍａ
社製。

Ｐｒｏｄｕｃｔ　ＮａＬ−２０１１）を用いた。

β−ヒドロキシピルビン酸還元酵素の調製公知文献（Ｊ
、ＢＩｏｌ、Ｃｈｅｓ、２４３巻、２４９４〜２４９９
　（１９６８）の培養菌体に従ってＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ａｃｌｄｏｖｏｒａｎｅ破砕物より精製して得た
酵素を用いた。

Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素の調製 公知文献（Ｍｅｔｈｏｄ　Ｉｎ　Ｅｓｚｙｍｏｌｏｇｙ
ｓ　９巻。

２２１〜２２８頁（１９８Ｂ））に従って、ホウレン草
の葉より抽出精製して得た酵素を用いた。

Ｌ−アラニン脱水素酵素の調製 公知文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｌｅ、７１巻、５５９〜５６
３］１（１９８９））に従って、バシルス属菌株（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ　Ｄ　Ｓ　Ｍ　７３０株）のＬ−ア
ラニン脱水素酵素遺伝子を組込んだ大腸菌（Ｅ、ｚｃｏ
ｌｌｃｅｏｏ株）の培養菌体より抽出精製して得た酵素
を用いた。

Ｌ−セリン脱水素酵素の調製 公知文献（Ｉｚｙ、／Ａｋａｄ、！１ａｕｋ、Ｓ、Ｓ、
Ｓ、Ｒ，Ｓｅｔ；７Ｂｉｏ！３１巻、２９５〜３０１頁
（１９８Ｂ）に従って、パセリン葉から抽出精製して得
た酵素を用いた。

実施例１ 反応液１ｌｌＱ中に、トリス（トリスヒドロキシメチル
アラン）−ＨＣ（、緩衝液（ｐＨ７，５）を１００μＭ
１塩化マグネシウムを０．２μＭ１ＮＡＤ”を１０μＭ
１Ｌ−酒石酸カリウム５００μＭ（Ｌ−酒石酸として７
５■、及びＬ−洒石酸脱炭酸酵素１．０２単位を含むよ
うに反応液を調製し、３０℃で１２０時間反応させた。

その結果、反応液１．Ｑ当り５００μＭ（Ｄ−グリセリ
ン酸として５３■）のＤ−グリセリン酸の生成蓄積を確
認した。次いで反応液ＩＷ、Ｑ中に炭酸す）　ＩＪウム
緩衝液（ｐＨ９，５）ｔｏｏμＭ％ＮＡＤ”　１μＭ１
Ｌ−アラニン脱水素酵素１００噂位またはＬ−セリン脱
水素酵素１００単位及び前記で得たＤ−グリセリン酸２
００μＭ（Ｄ−グリセリン酸として２１−ｇ）を含む反
応液に、グリオキシル酸還元酵素２単位または、Ｌ−乳
酸脱水素酵素２単位、■）−グリセリン酸脱水素酵素２
単位またはβ−ヒドロキシピルビン酸還元酵素２単位を
添加して反応液を調製し、３０℃で２５時間酵素反応を
行なった。その結果を第１表に示す。

以下余白 （発明の効果） 本発明では、Ｄ−グリセリン酸又はＬ−酒石酸を原料と
してＬ−セリンを安価に製造することができる。また、
本発明は他の方法に比べて、原料に対する変換効率がき
わめて高い。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ−グリセリン酸にＮＡＤの存在下にＤ−乳酸脱
   水素酵素、グリオキシル酸還元酵素、Ｄ−グリセリン酸
   脱水素酵素およびβ−ヒドロキシピルビン酸還元酵素か
   らなる群から選ばれた１種または２種以上の酵素を作用
   させてβ−ヒドロキシピルビン酸を生成させ、該β−ヒ
   ドロキシピルビン酸とアンモニアにＮＡＤＨの存在下に
   Ｌ−アラニン脱水素酵素またはＬ−セリン脱水素酵素を
   作用させてＬ−セリンを製造することを特徴とするＬ−
   セリンの製造法。
2. （２）Ｌ−酒石酸にＮＡＤの存在下にＬ−洒石酸脱炭酸
   酵素を作用させてＤ−グリセリン酸を生成させ、該Ｄ−
   グリセリン酸にＮＡＤの存在下にＤ−乳酸脱水素酵素、
   グリオキシル酸還元酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素
   およびβ−ヒドロキシピルビン酸還元酵素からなる群か
   ら選ばれた１種または２種以上の酵素を作用させてβ−
   ヒドロキシピルビン酸を生成させ、該ヒドロキシピルビ
   ン酸とアンモニアにＮＡＤＨの存在下にＬ−アラニン脱
   水素酵素またはＬ−セリン脱水素酵素を作用させてＬ−
   セリンを製造することを特徴とするＬ−セリンの製造法
   。