JP3116102B2 - Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法Info
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- JP3116102B2 JP3116102B2 JP03284569A JP28456991A JP3116102B2 JP 3116102 B2 JP3116102 B2 JP 3116102B2 JP 03284569 A JP03284569 A JP 03284569A JP 28456991 A JP28456991 A JP 28456991A JP 3116102 B2 JP3116102 B2 JP 3116102B2
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
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- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/847—Erwinia
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＬ−３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（以下Ｌ−ＤＯＰＡと略す）の製造
方法に関する。Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン氏病の治療
薬として多用されている。
シフェニルアラニン（以下Ｌ−ＤＯＰＡと略す）の製造
方法に関する。Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン氏病の治療
薬として多用されている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−ＤＯＰＡの製造方法として
は、バニリンを原料とする合成法が知られている。他
方、微生物の有する酵素系を用いたＬ−ＤＯＰＡの製造
法も検討されており、例えば、β−チロシナーゼを利用
してカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンか
ら製造する方法（特公昭４８−３４２３７号公報）、同
じくβ−チロシナーゼを利用してカテコール及びＬ−セ
リンその他のアミノ酸類から製造する方法（特公昭４７
−２２２７５号公報）、アンモニアリアーゼを利用して
ジヒドロキシ桂皮酸及びアンモニウムイオンから製造す
る方法（特公昭６２−２４０７６号公報）、オキシゲナ
ーゼを利用してＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−チロ
シンから製造する方法（特公昭４７−１９０３３号公
報、同４７−１４９１５号公報）、トランスアミナーゼ
を利用して３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸か
ら製造する方法（特公昭５８−１８４７５号公報）等が
知られている。
は、バニリンを原料とする合成法が知られている。他
方、微生物の有する酵素系を用いたＬ−ＤＯＰＡの製造
法も検討されており、例えば、β−チロシナーゼを利用
してカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンか
ら製造する方法（特公昭４８−３４２３７号公報）、同
じくβ−チロシナーゼを利用してカテコール及びＬ−セ
リンその他のアミノ酸類から製造する方法（特公昭４７
−２２２７５号公報）、アンモニアリアーゼを利用して
ジヒドロキシ桂皮酸及びアンモニウムイオンから製造す
る方法（特公昭６２−２４０７６号公報）、オキシゲナ
ーゼを利用してＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−チロ
シンから製造する方法（特公昭４７−１９０３３号公
報、同４７−１４９１５号公報）、トランスアミナーゼ
を利用して３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸か
ら製造する方法（特公昭５８−１８４７５号公報）等が
知られている。
【０００３】しかしながら、これらの方法はいずれも製
造コストが高く、安価かつ効率的なＬ−ＤＯＰＡの製造
方法の開発が求められていた。
造コストが高く、安価かつ効率的なＬ−ＤＯＰＡの製造
方法の開発が求められていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物のβ−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方
法を改良することにより、従来から知られているＬ−Ｄ
ＯＰＡの各種製造法よりも安価かつ効率的なＬ−ＤＯＰ
Ａの製造方法を提供することである。
物のβ−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方
法を改良することにより、従来から知られているＬ−Ｄ
ＯＰＡの各種製造法よりも安価かつ効率的なＬ−ＤＯＰ
Ａの製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物の
β−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、β−チロシナーゼ含有培
養物の調製方法、反応系でのアンモニウムイオン源の種
類及び／または反応基質の添加方法を改良することによ
ってＬ−ＤＯＰＡの生産性が大幅に向上することを見い
出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
β−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、β−チロシナーゼ含有培
養物の調製方法、反応系でのアンモニウムイオン源の種
類及び／または反応基質の添加方法を改良することによ
ってＬ−ＤＯＰＡの生産性が大幅に向上することを見い
出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、エルビニア属に属
し、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該
培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の
処理物をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオ
ンまたはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させてＬ
−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方
法において、当該微生物の生育が定常期に達した後、ｐ
Ｈを７．０ないし８．３に制御しつつ６ないし２４時間
培養を続けることにより得られる培養物、該培養物より
分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を使
用することを特徴とするＬ−３，４−ジヒドロキシフェ
ニルアラニンの製造方法を提供するものである。
し、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該
培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の
処理物をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオ
ンまたはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させてＬ
−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方
法において、当該微生物の生育が定常期に達した後、ｐ
Ｈを７．０ないし８．３に制御しつつ６ないし２４時間
培養を続けることにより得られる培養物、該培養物より
分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を使
用することを特徴とするＬ−３，４−ジヒドロキシフェ
ニルアラニンの製造方法を提供するものである。
【０００７】また、本発明は、エルビニア属に属し、β
−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該培養物
より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物
をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンに接
触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニ
ンを製造する方法において、アンモニウムイオン源とし
て塩化アンモニウムを使用することを特徴とするＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法を提
供するものである。
−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該培養物
より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物
をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンに接
触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニ
ンを製造する方法において、アンモニウムイオン源とし
て塩化アンモニウムを使用することを特徴とするＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法を提
供するものである。
【０００８】さらに、本発明は、エルビニア属に属し、
β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該培養
物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理
物をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンま
たはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させてＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法
において、カテコールを含む水溶液を反応系にカテコー
ル濃度が１．０％以下となるように連続的もしくは断続
的に添加しつつ反応させることを特徴とするＬ−３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法を提供する
ものである。
β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該培養
物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理
物をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンま
たはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させてＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法
において、カテコールを含む水溶液を反応系にカテコー
ル濃度が１．０％以下となるように連続的もしくは断続
的に添加しつつ反応させることを特徴とするＬ−３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法を提供する
ものである。
【０００９】本発明に使用する微生物は、エルビニア属
に属し、β−チロシナーゼ（チロシンフェノールリアー
ゼ、ＥＣ４．１．９９．２）活性を有する微生物であれ
ばいずれでも使用できるが、具体的に例示すると以下の
ものが挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣ
Ｃ２１４３３
に属し、β−チロシナーゼ（チロシンフェノールリアー
ゼ、ＥＣ４．１．９９．２）活性を有する微生物であれ
ばいずれでも使用できるが、具体的に例示すると以下の
ものが挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣ
Ｃ２１４３３
【００１０】さらにこのような微生物に変異処理を施し
たり、あるいは遺伝子組換え技術等により育種すること
によってＬ−ＤＯＰＡ生産能を向上させた微生物も使用
することができる。
たり、あるいは遺伝子組換え技術等により育種すること
によってＬ−ＤＯＰＡ生産能を向上させた微生物も使用
することができる。
【００１１】これらの微生物の培養物を調製するには、
炭素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質を含有す
る培地に培養すればよい。炭素源としては、グリセロー
ル、フマル酸、糖類等が用いられ、また窒素源として
は、硫酸アンモニウム、アミノ酸等が用いられる。無機
塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等が適宜使用される。
その他の栄養物質としては大豆蛋白加水分解物、アミノ
酸類等が挙げられる。なお、β−チロシナーゼは適応酵
素と考えられ、上記微生物を培養する際には、チロシン
又はチロシン代替物質を培地に添加することにより、β
−チロシナーゼ活性の発現が大きくなり好ましい結果が
得られる。また、β−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効である。
炭素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質を含有す
る培地に培養すればよい。炭素源としては、グリセロー
ル、フマル酸、糖類等が用いられ、また窒素源として
は、硫酸アンモニウム、アミノ酸等が用いられる。無機
塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等が適宜使用される。
その他の栄養物質としては大豆蛋白加水分解物、アミノ
酸類等が挙げられる。なお、β−チロシナーゼは適応酵
素と考えられ、上記微生物を培養する際には、チロシン
又はチロシン代替物質を培地に添加することにより、β
−チロシナーゼ活性の発現が大きくなり好ましい結果が
得られる。また、β−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効である。
【００１２】培養条件としては、培養温度は１５℃〜４
５℃が適当である。培養ｐＨ及び培養時間については、
従来の方法では、特公昭４８−３４２３７号公報に記載
されているように、微酸性〜微アルカリ性に保ちつつ１
０ないし７２時間培養が行われていたが、本発明におい
ては、菌の生育が定常期に達した後、ｐＨを７．０ない
し８．３に制御しつつ６ないし２４時間培養を続け、培
養物を得る。本発明の方法によると、単位培養物当りの
β−チロシナーゼ活性が従来の方法の２倍以上となり、
Ｌ−ＤＯＰＡの製造に適した培養物を得ることができ
る。すなわち、反応工程において反応時間の著しい短縮
並びにＬ−ＤＯＰＡの反応収率の大幅な向上が達成され
る。従来の方法でβ−チロシナーゼ活性が低いレベルに
留まったのは、本発明に記載されたような、菌の生育が
定常期に達した後の培養液ｐＨの微妙なコントロール下
での培養の継続がβ−チロシナーゼ活性に重大な影響を
及ぼすことが知られていなかったためである。
５℃が適当である。培養ｐＨ及び培養時間については、
従来の方法では、特公昭４８−３４２３７号公報に記載
されているように、微酸性〜微アルカリ性に保ちつつ１
０ないし７２時間培養が行われていたが、本発明におい
ては、菌の生育が定常期に達した後、ｐＨを７．０ない
し８．３に制御しつつ６ないし２４時間培養を続け、培
養物を得る。本発明の方法によると、単位培養物当りの
β−チロシナーゼ活性が従来の方法の２倍以上となり、
Ｌ−ＤＯＰＡの製造に適した培養物を得ることができ
る。すなわち、反応工程において反応時間の著しい短縮
並びにＬ−ＤＯＰＡの反応収率の大幅な向上が達成され
る。従来の方法でβ−チロシナーゼ活性が低いレベルに
留まったのは、本発明に記載されたような、菌の生育が
定常期に達した後の培養液ｐＨの微妙なコントロール下
での培養の継続がβ−チロシナーゼ活性に重大な影響を
及ぼすことが知られていなかったためである。
【００１３】かくして得られる培養物をそのままβ−チ
ロシナーゼ源として反応に用いてもよく、培養物から分
離した微生物菌体を使用してもよく、また微生物菌体の
処理物として菌体摩砕物、アセトン処理菌体、固定化菌
体、菌体抽出物もしくはこれから精製して得られるβ−
チロシナーゼを使用してもよい。
ロシナーゼ源として反応に用いてもよく、培養物から分
離した微生物菌体を使用してもよく、また微生物菌体の
処理物として菌体摩砕物、アセトン処理菌体、固定化菌
体、菌体抽出物もしくはこれから精製して得られるβ−
チロシナーゼを使用してもよい。
【００１４】次に、基質としてカテコール、ピルビン酸
及びアンモニウムイオンを用い、これにエルビニア属に
属し、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、
該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体
の処理物を接触反応させてＬ−ＤＯＰＡを製造する反応
工程において、従来、アンモニウムイオン源としては、
酢酸アンモニウムをはじめ、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
有機酸アンモニウム塩等のいずれを用いてもよいとさ
れ、アンモニウムイオン源の種類は特に注目されていな
かった。ところが、驚くべきことに、塩化アンモニウム
を用いた場合、Ｌ−ＤＯＰＡ生成速度は他のアンモニウ
ム塩を使用した場合の２倍以上の値が得られる。すなわ
ち、反応のアンモニウムイオン源として塩化アンモニウ
ムを使用することにより効率よくＬ−ＤＯＰＡを製造す
ることができる。
及びアンモニウムイオンを用い、これにエルビニア属に
属し、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、
該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体
の処理物を接触反応させてＬ−ＤＯＰＡを製造する反応
工程において、従来、アンモニウムイオン源としては、
酢酸アンモニウムをはじめ、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
有機酸アンモニウム塩等のいずれを用いてもよいとさ
れ、アンモニウムイオン源の種類は特に注目されていな
かった。ところが、驚くべきことに、塩化アンモニウム
を用いた場合、Ｌ−ＤＯＰＡ生成速度は他のアンモニウ
ム塩を使用した場合の２倍以上の値が得られる。すなわ
ち、反応のアンモニウムイオン源として塩化アンモニウ
ムを使用することにより効率よくＬ−ＤＯＰＡを製造す
ることができる。
【００１５】また、基質としてカテコール、ピルビン酸
及びアンモニウムイオンを用い、これにエルビニア属に
属し、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、
該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体
の処理物を接触反応させてＬ−ＤＯＰＡを製造する反応
工程において、従来、反応の基質阻害を避けるためカテ
コール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンを分割添加
する方法が知られていた（特公昭４８−３４２３７号公
報参照）。ところが、カテコールを含む水溶液（必要に
応じ、ピルビン酸、アンモニウムイオン等を添加しても
よい）を反応系にカテコール濃度が１．０％以下となる
ように連続的もしくは断続的に添加しつつ反応させるこ
とにより、従来の分割添加法に比べてＬ−ＤＯＰＡの生
成速度及び蓄積量が著しく向上する。すなわち、従来知
られていた結晶の分割添加方法でも、添加したカテコー
ルの蛋白質変性作用による反応系中のβ−チロシナーゼ
の失活を防止することができず、その結果Ｌ−ＤＯＰＡ
の蓄積量は低いレベルに留まっていたものと考えられ
る。これに対して、本発明のカテコール添加方法によれ
ば、カテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンよ
りＬ−ＤＯＰＡを高蓄積で極めて効率よく製造すること
ができる。また、基質としてカテコール及びＬ−セリン
を用い、これにエルビニア属に属し、β−チロシナーゼ
活性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微
生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を接触反応させ
てＬ−ＤＯＰＡを製造する方法においても、カテコール
を含む水溶液（必要に応じＬ−セリン等を添加してもよ
い）を反応系にカテコール濃度が１．０％以下となるよ
うに連続的もしくは断続的に添加しつつ反応させること
がβ−チロシナーゼの失活防止に有効であることは同様
であり、この方法によってもＬ−ＤＯＰＡを効率よく製
造することができる。
及びアンモニウムイオンを用い、これにエルビニア属に
属し、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、
該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体
の処理物を接触反応させてＬ−ＤＯＰＡを製造する反応
工程において、従来、反応の基質阻害を避けるためカテ
コール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンを分割添加
する方法が知られていた（特公昭４８−３４２３７号公
報参照）。ところが、カテコールを含む水溶液（必要に
応じ、ピルビン酸、アンモニウムイオン等を添加しても
よい）を反応系にカテコール濃度が１．０％以下となる
ように連続的もしくは断続的に添加しつつ反応させるこ
とにより、従来の分割添加法に比べてＬ−ＤＯＰＡの生
成速度及び蓄積量が著しく向上する。すなわち、従来知
られていた結晶の分割添加方法でも、添加したカテコー
ルの蛋白質変性作用による反応系中のβ−チロシナーゼ
の失活を防止することができず、その結果Ｌ−ＤＯＰＡ
の蓄積量は低いレベルに留まっていたものと考えられ
る。これに対して、本発明のカテコール添加方法によれ
ば、カテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンよ
りＬ−ＤＯＰＡを高蓄積で極めて効率よく製造すること
ができる。また、基質としてカテコール及びＬ−セリン
を用い、これにエルビニア属に属し、β−チロシナーゼ
活性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微
生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を接触反応させ
てＬ−ＤＯＰＡを製造する方法においても、カテコール
を含む水溶液（必要に応じＬ−セリン等を添加してもよ
い）を反応系にカテコール濃度が１．０％以下となるよ
うに連続的もしくは断続的に添加しつつ反応させること
がβ−チロシナーゼの失活防止に有効であることは同様
であり、この方法によってもＬ−ＤＯＰＡを効率よく製
造することができる。
【００１６】反応系には必要に応じ亜硫酸ナトリウムや
システイン等の還元剤、ＥＤＴＡやクエン酸等のキレー
ト剤を添加してもよい。反応温度は１０ないし６０℃、
反応ｐＨは７．７ないし８．７の範囲が適当であり、反
応時間は用いるβ−チロシナーゼ源の力価、濃度及び基
質の濃度に応じ適宜決めればよい。
システイン等の還元剤、ＥＤＴＡやクエン酸等のキレー
ト剤を添加してもよい。反応温度は１０ないし６０℃、
反応ｐＨは７．７ないし８．７の範囲が適当であり、反
応時間は用いるβ−チロシナーゼ源の力価、濃度及び基
質の濃度に応じ適宜決めればよい。
【００１７】反応終了後、反応液中に生成したＬ−ＤＯ
ＰＡは濃縮、イオン交換樹脂処理等の通常の単離・精製
法により、取得することができる。
ＰＡは濃縮、イオン交換樹脂処理等の通常の単離・精製
法により、取得することができる。
【００１８】
【実施例】次に実施例によって本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００１９】
【実施例１】肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培
養して得たエルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４
３３の菌体の一白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラス
コ内の表１の組成のシード培養培地５０ｍｌに接種し、
３１℃で１２時間振とう培養した。この培養液３０ｍｌ
を、５００ｍｌ容ジャー・ファーメンター内の表２の組
成のメイン培養培地３００ｍｌに植菌し、２８℃で培養
を開始した。
養して得たエルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４
３３の菌体の一白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラス
コ内の表１の組成のシード培養培地５０ｍｌに接種し、
３１℃で１２時間振とう培養した。この培養液３０ｍｌ
を、５００ｍｌ容ジャー・ファーメンター内の表２の組
成のメイン培養培地３００ｍｌに植菌し、２８℃で培養
を開始した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】その後水酸化カリウム及びグルコースによ
りｐＨを７．５に制御しつつ培養したところ、約２４時
間後に菌の生育が定常期に達した。この時点から培養液
ｐＨは徐々に上昇する傾向にあったため、酢酸の添加に
よりｐＨを６．５、７．０、７．５、８．０、８．３、
８．５の各値に保持しつつさらに２４時間培養を行った
（培養時間計４８時間）。培養開始後２４、３０、４８
時間の培養物各１０ｍｌより遠心分離により菌体を分離
回収し、それぞれ表３に示す組成の反応液１０ｍｌに添
加し、室温にて１時間反応を行い、単位培養物から得ら
れる菌体に含まれるβ−チロシナーゼ活性を測定した。
りｐＨを７．５に制御しつつ培養したところ、約２４時
間後に菌の生育が定常期に達した。この時点から培養液
ｐＨは徐々に上昇する傾向にあったため、酢酸の添加に
よりｐＨを６．５、７．０、７．５、８．０、８．３、
８．５の各値に保持しつつさらに２４時間培養を行った
（培養時間計４８時間）。培養開始後２４、３０、４８
時間の培養物各１０ｍｌより遠心分離により菌体を分離
回収し、それぞれ表３に示す組成の反応液１０ｍｌに添
加し、室温にて１時間反応を行い、単位培養物から得ら
れる菌体に含まれるβ−チロシナーゼ活性を測定した。
【００２３】
【表３】
【００２４】その結果、表４に示すように、菌の生育が
定常期に達した後、ｐＨを７．０ないし８．３に制御し
つつ６ないし２４時間培養することにより得られる培養
物中のβ−チロシナーゼ活性は顕著に高かった。
定常期に達した後、ｐＨを７．０ないし８．３に制御し
つつ６ないし２４時間培養することにより得られる培養
物中のβ−チロシナーゼ活性は顕著に高かった。
【００２５】
【表４】
【００２６】
【実施例２】実施例１と同様の方法によりエルビニア・
ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の培養を行った。２
４時間培養後、菌の生育が定常期に達した時点から酢酸
の添加によりｐＨ７．５に保持しつつさらに１２時間
（培養時間計３６時間）培養を行った。次いで遠心分離
により培養物より菌体を分離し、これをアンモニウムイ
オン源として酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムもしくはリン酸アン
モニウムを用いた表５の組成の反応液同量にそれぞれ添
加し、実施例１と同様にβ−チロシナーゼ活性を測定し
た。なお、反応液中のアンモニウムイオン濃度はいずれ
も０．４Ｍとした。
ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の培養を行った。２
４時間培養後、菌の生育が定常期に達した時点から酢酸
の添加によりｐＨ７．５に保持しつつさらに１２時間
（培養時間計３６時間）培養を行った。次いで遠心分離
により培養物より菌体を分離し、これをアンモニウムイ
オン源として酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムもしくはリン酸アン
モニウムを用いた表５の組成の反応液同量にそれぞれ添
加し、実施例１と同様にβ−チロシナーゼ活性を測定し
た。なお、反応液中のアンモニウムイオン濃度はいずれ
も０．４Ｍとした。
【００２７】
【表５】
【００２８】その結果、表６に示すように、アンモニウ
ムイオン源として塩化アンモニウムを用いた場合、他の
アンモニウムイオン源を用いた場合に比べてβ−チロシ
ナーゼ活性の値が２倍以上となっていた。
ムイオン源として塩化アンモニウムを用いた場合、他の
アンモニウムイオン源を用いた場合に比べてβ−チロシ
ナーゼ活性の値が２倍以上となっていた。
【００２９】
【表６】
【００３０】
【実施例３】実施例１と同様の方法によりエルビニア・
ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の培養を行った。２
４時間培養後、菌の生育が定常期に達した時点から酢酸
の添加によりｐＨ７．５に保持しつつさらに１２時間
（培養時間計３６時間）培養を行った。次いで培養物２
２５ｍｌより菌体を遠心分離し、これを表７の組成の反
応液２２５ｍｌに添加して１５℃にて反応を開始した。
反応中、経時的にサンプリングを行い、反応液に含まれ
るカテコールの残存量がそれぞれ０．５％以下、１．０
％以下、１．５％以下となるように、カテコールとピル
ビン酸ナトリウムを各２０％含有する水溶液を連続的に
添加した。反応１６時間で得られたＬ−ＤＯＰＡの生成
量はそれぞれ１０．０ｇ／ｄｌ、９．０ｇ／ｄｌ、５．
０ｇ／ｄｌであった。なお、比較のために反応液に含ま
れるカテコールの残存量が１．０％以下となるように、
カテコールとピルビン酸ナトリウムの結晶を分割添加し
つつ反応を行った結果、Ｌ−ＤＯＰＡの蓄積は３．０ｇ
／ｄｌであった。
ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の培養を行った。２
４時間培養後、菌の生育が定常期に達した時点から酢酸
の添加によりｐＨ７．５に保持しつつさらに１２時間
（培養時間計３６時間）培養を行った。次いで培養物２
２５ｍｌより菌体を遠心分離し、これを表７の組成の反
応液２２５ｍｌに添加して１５℃にて反応を開始した。
反応中、経時的にサンプリングを行い、反応液に含まれ
るカテコールの残存量がそれぞれ０．５％以下、１．０
％以下、１．５％以下となるように、カテコールとピル
ビン酸ナトリウムを各２０％含有する水溶液を連続的に
添加した。反応１６時間で得られたＬ−ＤＯＰＡの生成
量はそれぞれ１０．０ｇ／ｄｌ、９．０ｇ／ｄｌ、５．
０ｇ／ｄｌであった。なお、比較のために反応液に含ま
れるカテコールの残存量が１．０％以下となるように、
カテコールとピルビン酸ナトリウムの結晶を分割添加し
つつ反応を行った結果、Ｌ−ＤＯＰＡの蓄積は３．０ｇ
／ｄｌであった。
【００３１】
【表７】
【００３２】次に、Ｌ−ＤＯＰＡを１０．０ｇ／ｄｌ含
有する反応終了液１００ｍｌを酸性としてＬ−ＤＯＰＡ
結晶を溶解し、遠心分離により除菌した。上清液を４５
ｍｌまで濃縮し、活性炭カラムに通した後、亜硫酸ナト
リウム０．２％を含む希アンモニア水で吸着しているＬ
−ＤＯＰＡを溶出した。Ｌ−ＤＯＰＡ含有区分を濃縮
し、残査を塩酸に溶解後、中和、濃縮してＬ−ＤＯＰＡ
の粗結晶を得た。水より再結を３回繰り返して、Ｌ−Ｄ
ＯＰＡの精製結晶５．２ｇを得た。
有する反応終了液１００ｍｌを酸性としてＬ−ＤＯＰＡ
結晶を溶解し、遠心分離により除菌した。上清液を４５
ｍｌまで濃縮し、活性炭カラムに通した後、亜硫酸ナト
リウム０．２％を含む希アンモニア水で吸着しているＬ
−ＤＯＰＡを溶出した。Ｌ−ＤＯＰＡ含有区分を濃縮
し、残査を塩酸に溶解後、中和、濃縮してＬ−ＤＯＰＡ
の粗結晶を得た。水より再結を３回繰り返して、Ｌ−Ｄ
ＯＰＡの精製結晶５．２ｇを得た。
【００３３】
【実施例４】実施例３と同様の方法より調製したエルビ
ニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体を用い
て、表８の組成の反応液中でカテコール濃度が０．５％
以下となるようにカテコールとＬ−セリンを各２０％含
有する水溶液を連続的に添加しつつ１５℃で１８時間反
応を行った。その結果、反応終了液中にＬ−ＤＯＰＡ１
０．２ｇ／ｄｌの蓄積を認めた。反応液１００ｍｌから
実施例３と同様の方法により、Ｌ−ＤＯＰＡの精製結晶
４．２ｇを得た。
ニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体を用い
て、表８の組成の反応液中でカテコール濃度が０．５％
以下となるようにカテコールとＬ−セリンを各２０％含
有する水溶液を連続的に添加しつつ１５℃で１８時間反
応を行った。その結果、反応終了液中にＬ−ＤＯＰＡ１
０．２ｇ／ｄｌの蓄積を認めた。反応液１００ｍｌから
実施例３と同様の方法により、Ｌ−ＤＯＰＡの精製結晶
４．２ｇを得た。
【００３４】
【表８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特公 昭48−34237（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭47−22275（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/22 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】エルビニア属に属し、β−チロシナーゼ活
性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生
物菌体もしくは該微生物菌体の処理物をカテコール、ピ
ルビン酸及びアンモニウムイオンまたはカテコール及び
Ｌ−セリンに接触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシ
フェニルアラニンを製造する方法において、当該微生物
の生育が定常期に達した後、ｐHを７．０ないし８．３
に制御しつつ６ないし２４時間培養を続けることにより
得られる培養物、該培養物より分離した微生物菌体、ま
たは該微生物菌体の処理物を使用することを特徴とする
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方
法。 - 【請求項２】エルビニア属に属し、β−チロシナーゼ活
性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生
物菌体もしくは該微生物菌体の処理物をカテコール、ピ
ルビン酸及びアンモニウムイオンに接触反応させてＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法
において、反応のアンモニウムイオン源として塩化アン
モニウムを使用することを特徴とする請求項１記載のＬ
−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法。 - 【請求項３】エルビニア属に属し、β−チロシナーゼ活
性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生
物菌体もしくは該微生物菌体の処理物をカテコール、ピ
ルビン酸及びアンモニウムイオンまたはカテコール及び
Ｌ−セリンに接触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシ
フェニルアラニンを製造する方法において、カテコール
を含む水溶液を反応系にカテコール濃度が１．０％以下
となるように連続的もしくは断続的に添加しつつ反応さ
せることを特徴とする請求項１記載のＬ−３，４−ジヒ
ドロキシフェニルアラニンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03284569A JP3116102B2 (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
| US08/036,268 US5338672A (en) | 1991-10-30 | 1993-03-24 | Method for producing L-3, 4-dihydroxyphenyalanine by Erwinia having tyrosinase activity |
| EP93105445A EP0618299B1 (en) | 1991-10-30 | 1993-04-01 | Method for producing L-3,4-dihydroxyphenylalanine |
| US08/186,645 US5368981A (en) | 1991-10-30 | 1994-01-26 | Method for increasing beta-tyrosinase activity in Erwinia herbicola |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03284569A JP3116102B2 (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
| US08/036,268 US5338672A (en) | 1991-10-30 | 1993-03-24 | Method for producing L-3, 4-dihydroxyphenyalanine by Erwinia having tyrosinase activity |
| EP93105445A EP0618299B1 (en) | 1991-10-30 | 1993-04-01 | Method for producing L-3,4-dihydroxyphenylalanine |
| US08/186,645 US5368981A (en) | 1991-10-30 | 1994-01-26 | Method for increasing beta-tyrosinase activity in Erwinia herbicola |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123177A JPH05123177A (ja) | 1993-05-21 |
| JP3116102B2 true JP3116102B2 (ja) | 2000-12-11 |
Family
ID=27442556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03284569A Expired - Lifetime JP3116102B2 (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5368981A (ja) |
| EP (1) | EP0618299B1 (ja) |
| JP (1) | JP3116102B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6383620B1 (en) | 1996-08-14 | 2002-05-07 | Daikin Industries, Ltd. | Antireflection article |
| KR102306077B1 (ko) * | 2019-12-05 | 2021-09-28 | 두선산업 주식회사 | 상품 노출형 슬라이딩 포장 상자 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3999825B2 (ja) * | 1996-01-18 | 2007-10-31 | 日清ファルマ株式会社 | 内臓脂肪蓄積抑制剤 |
| CN110791536B (zh) * | 2019-11-30 | 2023-01-17 | 南通大学 | 一种左旋多巴的生物合成方法 |
| WO2023090378A1 (ja) * | 2021-11-16 | 2023-05-25 | 花王株式会社 | ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3791924A (en) * | 1968-12-02 | 1974-02-12 | Ajinomoto Kk | Biological method of producing phenolic amino acids |
| JPS561890A (en) * | 1979-06-15 | 1981-01-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-phenylalanine by fermentation |
| JP2817157B2 (ja) * | 1989-01-13 | 1998-10-27 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ‐アミノ酸の製造法 |
-
1991
- 1991-10-30 JP JP03284569A patent/JP3116102B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-01 EP EP93105445A patent/EP0618299B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-26 US US08/186,645 patent/US5368981A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6383620B1 (en) | 1996-08-14 | 2002-05-07 | Daikin Industries, Ltd. | Antireflection article |
| KR102306077B1 (ko) * | 2019-12-05 | 2021-09-28 | 두선산업 주식회사 | 상품 노출형 슬라이딩 포장 상자 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0618299B1 (en) | 2000-09-20 |
| EP0618299A1 (en) | 1994-10-05 |
| US5368981A (en) | 1994-11-29 |
| JPH05123177A (ja) | 1993-05-21 |
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