CN110791536B - 一种左旋多巴的生物合成方法 - Google Patents

一种左旋多巴的生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种左旋多巴的生物合成方法，属于生物工程技术领域。本发明构建了包含酪氨酸酚裂解酶基因dhtpl的重组表达载体pJJ‑dhtpl，并实现了酪氨酸酚裂解酶在大肠杆菌BL21中的高效表达。利用表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌静息细胞，在16℃，pH 7.5‑8.0，真空下可以将廉价的邻苯二酚和丙酮酸铵一步催化合成左旋多巴。左旋多巴难溶于水，在该反应体系中以晶体形式析出，反应进行彻底，主要反应物邻苯二酚的摩尔转化率达96％以上。表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌静息细胞具有良好的催化稳定性，可以通过多次、分批添加邻苯二酚和丙酮酸铵，不断累积左旋多巴。本发明生产过程简单，原材料易得，产物易分离纯化，对于大规模工业化生产具有良好的应用前景。

Description

一种左旋多巴的生物合成方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种左旋多巴的生物合成方法。
背景技术
左旋多巴(左多巴、L-DOPA、3-羟基-L-酪氨酸)，是用于治疗帕金森氏病的重要化合物。目前左旋多巴的来源有植物提取法、化学合成法、生物合成法。(1)植物提取法。左旋多巴存在于许多天然植物中。1913年，生物化学家Guggenheim首次从蚕豆的荚膜中分离提取到左旋多巴。在此之后，在很多植物中均发现左旋多巴的存在，如猫豆、藜豆等(中国药业，2008，17(24)：15-16)，其中猫豆是提取左旋多巴最主要的原料，左旋多巴质量分数高达6％～9％。BeheraAnindita等(Inventi Rapid PharmAnalysis&Quality Assurance，2011(2)：135-146)通过提取技术的改良，猫豆中左旋多巴的提取得率已从1.5％提高到3.4％，纯度达到99.9％。虽然从植物中直接分离提取左旋多巴是制备左旋多巴的传统方法，但是受到原料来源少、提取步骤复杂繁琐等因素的限制，导致其产量小、生产成本高，难以实现大规模生产，远不能满足市场需求。(2)化学合成法。目前，化学法主要通过不对称合成法合成左旋多巴，工业化生产左旋多巴多以乙内酰脲与香草醛为原料，需经过8步反应合成，合成过程中需要大量金属催化剂，反应条件苛刻，产物转化率及对映体选择性低，同时存在成本高、环境不友好等问题，在工业生产上受到限制。(3)生物合成法。生物合成法生产左旋多巴是最为吸引人的一个方法，目前主要通过酪氨酸酶、转氨酶、氨基酰化酶以及酪氨酸酚裂解酶在一定条件下通过转化底物生成左旋多巴。酪氨酸酶以酪氨酸作为底物，催化合成左旋多巴。酪氨酸酶是在许多细菌物种中发现的含铜双氧激活酶，通常与黑色素的产生有关。这些蛋白质对酚和二酚底物有强烈的偏好，并且它们的反应范围受到一定限制，总是产生活化的醌产物。因此，左旋多巴被儿茶酚酶活性依次氧化，并且不可避免地形成副产物DOPA醌，导致低转化率。为了减少副产物并提高转化率，需要额外添加还原剂，例如抗坏血酸，NH3OH和NADH。然而，由于还原剂在生物催化期间不断消耗，因此随着时间的流逝，还原剂在间歇式反应器中含量不足，转化率和生产率没有得到大幅提高。此外，浓缩的抗坏血酸通常会抑制甲酚酶的活性，并使酪氨酸酶不可逆地失活。目前大多数研究使用商业化的蘑菇酪氨酸酶，但其与细菌相比存在不稳定性。Krishnaveni等(Curr Microbiol，2009，58(2)：122-128)利用Acremonium rutilum具有较高的酪氨酸酶生产能力的特性,转化酪氨酸合成左旋多巴。该菌在经过优化的培养条件下连续培养120h，左旋多巴的最大产量仅为0.89g/L。转氨酶可利用L-天冬氨酸或L-谷氨酸为底物，将L-天冬氨酸或L-谷氨酸中的氨基转移到3，4二羟基苯丙酮酸上，进而生成左旋多巴。Nagasaki等(Agricultural andBiologicalChemistry，2014，39(2)：363-369)研究了Enterobacter cloacae NB320转氨基反应合成左旋多巴的能力，其终产量为4mg/mL，转化率为80％。由于转氨酶法合成左旋多巴存在前体物质具有毒性、生产过程复杂及操作要求高等许多问题，随后利用转氨酶合成左旋多巴的相关研究比较少见。用于生产左旋多巴的氨基酰化酶大部分是从米曲霉中直接提取而来，提取过程繁琐复杂，为了提高酶的稳定性和使用效率，工业上多使用固定化酶，1998年日本SANKYO公司建立了完整的氨基酰化酶催化合成左旋多巴的路线，并于2008年投产。我国新华制药也用该法生产左旋多巴量约为300t。然而该方法酶提取复杂，合成步骤多，并且HBr的取代步骤会产生大量的臭氧层破坏物MeBr，环境污染严重。也有许多研究者利用酪氨酸酚裂解酶催化L-酪氨酸生成左旋多巴，但L-酪氨酸作为多巴的类似底物，对于产物的分离纯化来说难度较大。
生物法合成左旋多巴绿色安全，受到很多研究者的青睐，但到目前为止大多数仅限于实验室研究，催化效率低，产量有限。因此寻找一种具有工业应用前景的有效的左旋多巴的生物合成方法至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种左旋多巴的生物合成方法，该方法利用表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞作为反应的催化剂，真空下将廉价的邻苯二酚和丙酮酸铵一步催化合成左旋多巴，成本低、效率高、杂质少。
为解决以上问题，本发明提供了一种左旋多巴的生物合成方法，包括以下步骤：
(1)将表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞按照细胞湿重1～20g/L与含有丙酮酸铵1～5g/L，邻苯二酚1.6～8g/L的水溶液混合均匀，氨水调节pH 7.5～8.0，16℃温度条件下，抽真空搅拌催化反应3h，得到反应混合液；
(2)向步骤(1)得到的反应混合液中加入丙酮酸铵和邻苯二酚，使所述丙酮酸铵的终浓度为1～5g/L，所述邻苯二酚的终浓度为1.6～8g/L，继续抽真空搅拌催化反应3h，重复该步骤8～10次；
(3)反应结束后，收集底部结晶物，洗涤，重结晶，得左旋多巴。
优选的，所述表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞的制备方法按如下步骤：
(1)将基因序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶基因进行密码子优化后，插入到质粒pJJDuet30上的SacⅡ和BamHⅠ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组表达载体pJJ-dhtpl；
(2)用重组表达载体pJJ-dhtpl转化大肠杆菌，获得大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl；
(3)将大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl在发酵罐中进行发酵，诱导重组酪氨酸酚裂解酶的表达；
(4)离心，获得表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞。
与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明利用表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞作为反应的催化剂，真空下将廉价的邻苯二酚和丙酮酸铵一步催化合成左旋多巴。由于催化反应体系为水相体系，主要反应物之一邻苯二酚在水相中的溶解度远大于L-酪氨酸，而产物左旋多巴难溶于水易结晶析出，反应进行彻底，同时大大降低了产物的分离纯化成本。并且，基于酪氨酸酚裂解酶活性的微生物催化反应比基于酪氨酸酶活性的微生物催化反应具有更高的产率，对工业生产来说具有更大的应用价值。在催化反应过程中抽真空，可有效防止副产物多巴醌的生成，少用或不用添加化学还原剂，可有效降低原材料成本，提高产物的纯度，降低生成总成本。
附图说明
图1是本发明构建的重组表达载体pJJ-dhtpl质粒图谱；
图2是本发明中含有和不含酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌破壁后上清夜和沉淀的SDS-PAGE电泳图；图2中，泳道1是含有酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌破壁后的上清液；泳道2是对照不含酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌破壁后的上清液；泳道3是含有酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌破壁后的沉淀；泳道4是对照不含酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌破壁后的沉淀；
图3是表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl催化合成左旋多巴的液相图谱；
(a)未催化反应时反应液的液相图谱；(b)催化反应3h后反应液的液相图谱；
图4生物合成的左旋多巴(a)与左旋多巴标准品(b)的傅立叶红外图谱。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明所涉及的培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，营养琼脂粉5.0。
灭菌条件：121℃，20min，所用培养基均为卡那霉素抗性。
本发明所涉及的菌株、质粒及试剂
菌株Desulfitobacterium hafniense ATCC 700175，购自美国国家菌种保藏中心(ATCC)。
质粒pJJDuet30和菌株Escherichia coli BL21(DE3)，购自Addgene公司。
多巴标准品为分析纯，购自美国Sigma公司。
其他所用试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
本发明所涉及的酪氨酸酚裂解酶基因
本发明选择的酪氨酸酚裂解酶基因来源于Desulfitobacterium hafniense ATCC700175中的酪氨酸酚裂解酶基因dhtpl(氨基酸序列是EHL08374.1)。
本发明所涉及的产物检测
左旋多巴的定量分析采用Agilent Technologies 1200Series高效液相色谱仪检测分析。色谱条件为：UV280 nm，流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40：60)、采用AgilentEclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm),流速1mL/min、柱温35℃、进样量20μL。
大肠杆菌基因工程菌的构建
1)采用PCR方法合成具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的dhtpl基因片段，长度为1378bp；
2)将合成的dhtpl基因片段通过SacⅡ和BamHⅠ两种限制性核酸内切酶与载体pJJDuet30连接成重组质粒pJJ-dhtpl(图1)；
3)将重组质粒pJJ-dhtpl通过热激法转化到大肠杆菌DH5α；
4)筛选阳性克隆，挑取单菌落进行培养，经过质粒抽提后，进行序列测定。
5)将测序结果正确的重组质粒pJJ-dhtpl通过热激法转化到BL21(DE3)，获得大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl，用于菌体培养和蛋白表达。
酪氨酸酚裂解酶的诱导表达及验证
酪氨酸酚裂解酶的诱导表达：将大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl单菌落接种于含Kan的LB液体培养基，200r/min、37℃条件下振荡培养12h～16h；然后以2％接种量转接于含Kan的LB液体培养基，200r/min、37℃条件下振荡培养至OD600达0.6-0.8；加入终浓度为0.1mM的IPTG作为诱导剂，18℃，150r/min诱导表达14h。
酪氨酸酚裂解酶的验证：离心收集经过诱导表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌细胞(8000r/min，4℃，10min)，用无菌水洗涤2次，获得的菌体用无菌水重新悬浮，取细胞悬浮液进行冰水浴超声破碎(功率：40％，工作2s，间歇2s，工作时间10min)，离心(12000r/min，4℃，2min)，将上清与沉淀分离，分别进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果如图2所示。由图2可知，在50kDa附近有一条很明显的条带，其相对分子量大小和酪氨酸酚裂解酶相一致。30kDa附近的条带为pJJ-dhtpl的Kan抗性蛋白。
左旋多巴的生物合成：
离心收集经过诱导表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl菌体细胞(8000r/min，4℃，10min)，用无菌水洗涤2次，所获得的菌体作为生物合成左旋多巴的催化剂。在一种实施方式中，所述的生物合成体系包括：细胞湿重1-20g/L，丙酮酸铵1-5g/L，邻苯二酚1.6-8g/L，氨水调节pH7.5-8.0，反应温度16℃，搅拌转速150r/min，抽真空反应3h。以后每隔1.5-2h补加丙酮酸铵1-5g/L，邻苯二酚1.6-8g/L，补加5次。反应结束后离心(8000r/min，4℃，2min)，取上清液测定左旋多巴的含量(图3b)。最终邻苯二酚摩尔转化率达96％(根据图3液相图谱中多巴的峰面积计算)，左旋多巴产量达59.4g/L，纯度达99％以上。以此生物法合成的左旋多巴与标准品结构一致。(见图4，左旋多巴样品与标准品的傅立叶红外图谱比较)。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种左旋多巴的生物合成及其制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl静息细胞催化左旋多巴的生物合成(不补加反应物)
以氨水调节pH为8.0的无菌水1L作为反应溶剂，加入5g丙酮酸铵和8g邻苯二酚，加入含酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌12g(以细胞湿重计)，混合均匀。反应温度16℃，搅拌转速150r/min，抽真空反应3h。反应结束后离心(8000r/min，4℃，2min)，取上清液测定左旋多巴的含量。最终邻苯二酚摩尔转化率达99％，左旋多巴产量为12.9g/L，收率为91％。
实施例2
大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl静息细胞催化左旋多巴的生物合成(补加5次反应物)
以氨水调节pH为8.0的无菌水1L作为反应溶剂，加入5g丙酮酸铵和8g邻苯二酚，加入含酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌12g(以细胞湿重计)，混合均匀。反应温度16℃，搅拌转速150r/min，抽真空反应3h。以后每隔3h补加丙酮酸铵4g，邻苯二酚6.5g，补加3次；再每隔3h补加丙酮酸铵2g，邻苯二酚3.5g，补加2次。反应结束后离心(8000r/min，4℃，2min)，取上清液测定左旋多巴的含量。最终邻苯二酚摩尔转化率达96％，左旋多巴产量为55g/L，收率为90％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种左旋多巴的生物合成方法
<130> 2019.11.30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1378
<212> DNA
<213> Desulfitobacterium hafniense
<400> 1
catgattatg aagacttacc cggctgagcc gttccgcatt aaggtcgtgg aacctgttcg 60
ctccatgaag cgtgcggagc gcgaggaagc aatggaggag gcgggctata ataccttctt 120
attaaaatcg gaggatgtct acatcgattt actgacggat agtgggacca ctgctatgtc 180
cgacaagcaa tgggcgggga tgatgatggg tgatgaagca tatgctgggt cacgcaactt 240
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taaagatatt ctgctggaaa tgatgtcgta tgcagatggt gcaaccatgt ctggcaagaa 780
ggactgtatg gtaaatattg gggggtttct tgcaatgaat gatgacgagc tgtttttacg 840
cgcaaaagag ttagtggtgg tgtatgaagg tatgccctct tatgggggaa tggcaggccg 900
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agaaccagtt ggtggacacg ctgtgttctt ggatgcacgt cgctttcttc cgcacttgga 1080
ccaagatcat tttcctgcgc aagcactggc agcacagctg tacatcgaat caggtgtgcg 1140
cagcatggag cgtgggatca tctcagcggg acgtgactta aagacgggag aaaaccgcta 1200
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ggatattgtt gcccgcgctg tcattgaact gtatcagcag cgtgaaacta tcaagggttt 1320
gaaattcgtg tacgaacccg agatgcttcg ctttttcaca gcgcgcttcg agcatatt 1378

Claims (1)

1.一种左旋多巴的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞按照细胞湿重1~20 g/L与含有丙酮酸铵1~5 g/L，邻苯二酚1.6-8 g/L的水溶液混合均匀，氨水调节pH 7.5~8.0，16℃温度条件下，抽真空搅拌催化反应3 h，得到反应混合液；
所述表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞的制备方法按如下步骤：
1）将基因序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶基因进行密码子优化后，插入到质粒pJJDuet30上的SacⅡ和BamHⅠ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组表达载体pJJ-dhtpl；
2）用重组表达载体pJJ-dhtpl转化大肠杆菌，获得大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl；
3）将大肠杆菌基因工程菌BL21/pJJ-dhtpl在发酵罐中进行发酵，诱导重组酪氨酸酚裂解酶的表达；
4）离心，获得表达有酪氨酸酚裂解酶的重组大肠杆菌细胞；
（2）向步骤（1）得到的反应混合液中加入丙酮酸铵和邻苯二酚，使所述丙酮酸铵的终浓度为1~5 g/L，所述邻苯二酚的终浓度为1.6~8 g/L，继续抽真空搅拌催化反应3 h，重复该步骤8~10次；
（3）反应结束后，收集底部结晶物，洗涤，重结晶，得左旋多巴。
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