CN111647543A - 一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用 - Google Patents

一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用，该方法通过在大肠杆菌中表达假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了从葡萄糖醛酸到葡萄糖二酸的合成途径；并将重组大肠杆菌进行细胞通透化处理，在菌体浓度为20g/L时，葡萄糖二酸的含量达到975.5mg/L±0.15。本发明提供的重组菌及其转化工艺在葡萄糖二酸的制备上具有较大优势，具有工业化应用的潜力。

Description

一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用
技术领域
本发明涉及代谢工程技术领域，具体为一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用。
背景技术
葡萄糖二酸(Glucaric Acid,GA)是含有4个手性碳原子的一种葡萄糖衍生物，通常以手性化合物D-葡萄糖二酸的形式存在，在水溶液中会自发氧化，通常以内酯的形式存在。
葡萄糖二酸天然存在于苹果、柑橘等水果和西兰花、甘蓝等十字花科蔬菜中，在少量哺乳动物及人体内也有分泌(Chen N,Wang J,Zhao Y,et al.Microbial CellFactories(2018)17:67-80)。研究表明，葡萄糖醛酸及其衍生物，葡萄糖酸1，4-内酯(DSL)可以减少人体内胆固醇的含量和调节体内某些激素的含量，有助于改善自身免疫机制(HoK J.Biotechnology and Applied Biochemistry(2011)14:296-305)；在化学工业中，葡萄糖二酸也有非常普遍的利用价值，如合成多种生物新型缓释肥料、作为降解的各种聚合物、用来生产无毒的可生物降解的磷酸盐替代品的原材料，也可以用于防腐剂、混凝土和日常家用清洗剂的添加剂(Tae S M,sanghwal Y.Analytical Biochemistry(2009)59:183-185)，因此，葡萄糖二酸盐具有潜在的社会价值。
目前，国内外葡萄糖酸盐的制备方法以化学氧化法为主，主要包括硝酸氧化和TEMPO氧化(Qiu YY,Fang F,Du GC,et al.Chin J Biotech(2015)31:481-490)，该化学催化工艺成本高、无选择性、转化率低、产率低，且在硝酸氧化过程中可产生有毒副产物，TEMPO法虽然比较温和，但是催化剂价格昂贵且不易进行大规模生产，因此，开发一种环保、高效的葡萄糖酸盐生产方法受到研究者们的重视。
近年来，利用微生物发酵法生产葡萄糖二酸的报道越来越多，葡萄糖二酸的产量也越来越多。例如小西一诚(CA 104080918A),在大肠杆菌共同表达啤酒酵母中的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，小鼠肌醇加氧酶(MIOX)和丁香假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径。康振等(CN 104312935A)在毕赤酵母中共同表达了毕赤酵母的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，肌醇加氧酶(MIOX)和臭恶假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径，在其另一专利(CN 104312987A)中，在毕赤酵母中融合表达了毕赤酵母的肌醇加氧酶(MIOX)和臭恶假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，从而构建了从肌醇生产葡萄糖二酸的合成途径。上述都成功地获得了葡萄糖二酸，但在构建重组菌中均用到了肌醇加氧酶MIOX，该酶是生产葡萄糖二酸的限速酶，导致肌醇积累而使葡萄糖二酸产量不高，并且代谢途径太长，均需要二到三步的氧化还原反应，导致难以获得高产量的葡萄糖二酸，因此，如何简化葡萄糖二酸的合成过程、提高其产量成为葡萄糖二酸工业化生产过程中的重要研究方向。
本发明通过在大肠杆菌(E.coli BL21)中构建载体pETDuet-2×Udh，该目的基因的氨基酸序列是由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)氨基酸序列在数据库中进行tblast，得到与其相似度高的氨基酸序列，分别为假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonasfragi strain P121)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了以葡萄糖醛酸作为底物转化为葡萄糖二酸的途径。本发明构建重组大肠杆菌生产葡萄糖二酸的途径短，仅需要一步氧化还原反应，并通过对重组大肠杆菌进行细胞通透化处理，得到浓度高的葡萄糖二酸，在生物合成葡萄糖二酸方面提供了新的思路与方法。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用，该方法中工程菌株为重组大肠杆菌，其同时表达两个葡醛酸脱氢酶基因(Udh)；将该工程菌株用于制备葡萄糖二酸，具有合成过程简单、产量及转化率高的优点，该方法适合对葡萄糖二酸进行工业化生产。
本发明的技术方案如下：
一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株，该工程菌株同时表达两个葡醛酸脱氢酶基因(Udh)。
进一步的，上述高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株，具体为重组大肠杆菌，该菌株共同表达了氨基酸序列SEQ ID NO.1所示序列的假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonassynxantha strain KENGFT3)来源的Udh(GenBank:CP014868.1)基因和氨基酸序列SEQ IDNO.2所示序列的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的Udh(GenBank:CP013861.1)基因。
进一步的，上述工程菌株的构建方法为：将假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonassynxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)基因组为模板，扩增葡醛酸脱氢酶(Udh)基因，选用pETDuet-1为表达载体，通过酶切位点进行连接，将葡醛酸脱氢酶Udh与表达载体相连，构建重组质粒pETDuet-2×Udh，将重组质粒转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，即工程菌株；其中，表达载体pETDuet-1是大肠杆菌蛋白双表达载体，具有两个多克隆位点。
使用上述工程菌株制备葡萄糖二酸的方法，过程为：采用工程菌株，在经过通透化处理之后，以葡萄糖醛酸为底物，获得葡萄糖二酸；其中，在经过通透化处理后，可提高工程菌株细胞膜通透性；该方法与在培养基中直接添加葡萄糖醛酸的传统发酵方法相比，具有葡萄糖二酸产量显著提高、葡萄糖醛酸的转化率明显提高的优点。
上述使用工程菌株制备葡萄糖二酸的方法，步骤如下：
(1)通透化处理：将重组大肠杆菌菌液于12000rpm条件下，离心5min，获得湿菌体，将湿菌体反复冻融三次或使用化学试剂处理后，即可，经处理后，可得到通透性良好的重组大肠杆菌细胞；
(2)向步骤(1)中加入反应液Ⅰ或反应液Ⅱ，使菌体悬浮，加入葡萄糖醛酸作为反应底物，使底物终浓度为2g/L；调pH约为8.5，37℃，220rpm，培养24h；
(3)将培养液在12000rpm条件下，离心5min，分离上清Ⅰ和沉淀；将沉淀洗涤重悬，于100℃沸水浴中加热5min，将菌体中的葡萄糖二酸溶出，然后快速冷却到室温，离心，得到上清Ⅱ；将上清Ⅰ和上清Ⅱ合并，混匀，进行葡萄糖二酸的检测。
优选的，在步骤(1)中，反复冻融的过程为：将得到的湿菌体在液氮中下冷冻10s或将湿菌体在-20℃条件下冷冻24h以上，然后，在37℃条件下解冻，反复冻融三次；所述的化学试剂为甲苯。
优选的，在步骤(2)中，所述反应液Ⅰ由葡萄糖25g/L、酵母粉2g/L、硫酸镁0.55g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸铵3.5g/L和硫酸亚铁0.08mg/L组成。
优选的，在步骤(2)中，所述反应液Ⅱ由3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)20.9g/L、葡萄糖醛酸2g/L、葡萄糖25g/L、硫酸镁0.55g/L组成。
优选的，在步骤(3)中，葡萄糖二酸的检测方法采用高效液相色谱法，过程为：取1mL的发酵液，于12000rpm离心5min，然后取0.9mL上清液，加入50mg Affi-Gel进行处理，处理后的液体经0.22μm滤膜过滤，进行液相定量分析。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
(1)本发明与化学催化生产葡萄糖二酸相比，生产过程温和，更环保，生产成本更低；
(2)本发明与其他生物合成葡萄糖二酸相比，转化途径短，将葡萄糖醛酸转化成葡萄糖二酸只需要一步氧化还原反应；
(3)本发明分别将假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strainKENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的Udh基因导入pETDuet-1载体，构建pETDuet-2×Udh载体，相对于其他重组菌生产葡萄糖二酸，少了肌醇氧化酶MIOX限速酶，使得葡萄糖二酸的浓度和葡萄糖醛酸的转化率有了明显的提高；
(4)本发明采用重组大肠杆菌，在经过通透化处理之后，以葡萄糖醛酸为底物，生产葡萄糖二酸，相比于在培养基中直接添加葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸相比，其产物的浓度和反应的转化率都有明显的提高，详见具体实施方式中的实施例。
附图说明
图1：MS检测葡萄糖二酸的标样；
图2：MS检测重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-2×Udh发酵液；
图3：HPLC检测葡萄糖二酸的标样；
图4：HPLC检测重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-2×Udh发酵液。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1：重组大肠杆菌的构建
分别以假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的Udh基因组为模板，扩增葡醛酸脱氢酶(Udh)引物F1,R1,F2,R2,引物如下：
F1：5'-ATGCGTCCGGCGTAGA-3'
R1:5'-GATTATGCGGCCGTGTACAA-3'
F2:5'-TTGTACACGGCCGCATAATC-3'
R2:5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3'
将Udh基因导入pETDuet-1载体，通过酶切位点进行连接，构建重组质粒pETDuet-2×Udh，将表达载体转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中；涂布/划线在平板中，挑选阳性克隆子提取质粒，酶切电泳进行验证，验证正确，送去上海闪晶分子生物科技有限公司进行测序，选取成功构建的重组大肠杆菌，命名为E.coli BL21(DE3)/pETDuet-2×Udh。
实施例2：重组大肠杆菌生产葡萄糖二酸
从含有氨苄抗生素抗性LB平板中挑取单菌落，接种至含有5mL培养基的25mL试管中，于37℃、220rpm，培养12h；将培养后的种子液以1％的接种量，转接到装有50mL LB培养基250mL三角瓶中，于37℃、220rpm培养，当OD600值为1.0时，加入0.1mM TPTG进行诱导，于32℃、220rpm培养18h；培养结束后，取1mL的发酵液，于12000rpm离心5min。取0.9mL上清液，加入50mg Affi-Gel进行处理，处理完液体的经0.22μm滤膜过滤，进行质谱和液相分析。
如图1-4所示，图1，图3分别为葡萄糖二酸标准品质谱图及葡萄糖二酸标准品的液相色谱图，由标样可以看出葡萄糖二酸标准品的[M-1]+为208.900，葡萄糖二酸的出峰时间在9.077min；从图2，图4可以看出，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-2×Udh发酵液中检测出具有相同分子量(m/z)及具有相同出峰时间的葡萄糖二酸，证明重组菌构建成功。
实施例3：重组大肠杆菌制备葡萄糖二酸的方法
将重组大肠杆菌接种于LB固体培养基上，培养基成分为(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10、琼脂15、pH 7.0，氨苄青霉素的浓度最终达到100μg/mL，于37℃下培养16h；挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，于37℃下培养24h；取一环接种于装有5mL LB液体培养基的25mL试管中，于36.5℃、220rpm，摇床培养12h；
按1％的接种量将试管中的菌液接种于装有50mL LB培养基的250mL摇瓶中，氨苄青霉素的浓度最终达到100μg/mL，pH为6.9，于36℃、220rpm的摇床震荡培养2-3h，至OD600值达到0.6，加入IPTG使最终浓度达到0.4mM，于32℃、220rpm的摇床震荡培养24h；
将培养的重组大肠杆菌发酵液进行离心洗涤，取5g湿菌体加入10mL反应液I中，反应液I成分为葡萄糖25g/L、酵母粉2g/L、硫酸镁0.55g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸铵3.5g/L和硫酸亚铁0.08mg/L；37℃，220rpm，培养24h，得到的葡萄糖二酸浓度为(582.3±0.15)mg/L。
实施例4：重组大肠杆菌进行通透化处理制备葡萄糖二酸
使用与实施例3同样的大肠杆菌，培养方法与实施案例1相同，但在反应前将得到的湿大肠杆菌菌体在液氮中冷冻10s，立刻在37℃条件下解冻，以提高细胞的通透性；
反应步骤与实施案例3相同，得到的葡萄糖二酸含量为(724.9±0.18)mg/L。
实施例5：不同反应液，重组大肠杆菌制备葡萄糖二酸
大肠杆菌及其通透化处理同实施案例4；
经通透化处理的细胞加入反应液Ⅱ中，32℃，220rpm，培养24h，得到的葡萄糖二酸浓度为(975.5±0.15)mg/L，反应液Ⅱ由3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)20.9g/L、葡萄糖醛酸2g/L、葡萄糖25g/L、硫酸镁0.55g/L组成。
在本申请中，涉及到的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1
1 Met Leu Met Thr Thr Thr Thr Pro Ala Pro Phe Asn Arg LeuLeu
16 Leu Thr Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Lys Val Leu Arg GluArg
31 Met Arg Pro Tyr Ala Lys Val Leu Arg Leu Ser Asp Ile AlaAsp
46 Met Ala Pro Ala Val Gly Ala His Glu Glu Val Gln Pro CysAsp
61 Leu Ala Asp Lys Gln Ala Val His Gln Leu Val Glu Gly ValAsp
76 Ala Ile Leu His Phe Gly Gly Val Ser Val Glu Arg Ser PheGlu
91 Glu Val Leu Gly Ala Asn Ile Ser Gly Ile Phe His Ile TyrGlu
106 Ala Ala Arg Arg His Gly Val Lys Arg Val Ile Phe Ala SerSer
121 Asn His Val Ile Gly Phe Tyr Lys Gln Gly Glu Gln Leu AspAla
136 His Ser Pro Arg Arg Pro Asp Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser LysSer
151 Tyr Gly Glu Asp Met Ala Ser Phe Tyr Phe Asp Arg Tyr GlyIle
166 Gln Thr Val Ser Ile Arg Ile Gly Ser Ser Phe Pro Gln ProGln
181 Asn Arg Arg MET Met His Thr Trp Leu Ser Phe Asp Asp LeuThr
196 Gln Leu Leu Glu Arg Ala Leu Tyr Thr Pro Asn Val Gly HisThr
211 Val Val Tyr Gly Met Ser Ala Asn Leu Asp Thr Trp Trp AspAsn
226 Arg Tyr Ala Ala His Leu Gly Phe Ala Pro Lys Asp Ser SerGlu
241 Val Phe Arg Ala Gln Val Glu Ala Gln Pro Pro Val Ala AlaAsp
256 Asp Pro Ala Ala Val Tyr Gln Gly Gly Ala Phe Cys Ala AlaGly
271 Pro Phe Gly Asp
SEQ ID NO.2
1 Val Ala Glu Gly Ala Gly Cys Asp Glu Gly Ser Ala Leu ValAsn
16 His Ala Arg Val Ile Gly Arg Arg His Trp Leu Gly Phe AsnLeu
31 Gly Ala Lys His Leu His Thr Val Leu Gly Gly Lys Ala GlnMET
46 Gly Arg Val Ala Val Val Pro Pro Gln Val Trp Ile Val AlaArg
61 Ala Val Asp His Arg Val Pro Asp Val Arg Cys Val Gln CysAla
76 Phe Glu Gln Leu Gly Gln Ile Gly Lys Thr Gln Pro Gly AlaGlu
91 His Pro Ala Val Leu Arg Phe Gly Glu Gly Arg Ala Asp AlaAsp
106 Ala Asp Gly Phe Asp Ala Ile Ala Ile Glu Val Glu Gly GlyHis
121 Val Phe Ala Ile Gly Leu Gly Gln Thr Val Ile Thr Ile GlyAla
136 Ala Arg Gly Ala Gly Ile Glu Gly Leu Val Leu Phe Val LysThr
151 Asp His Met Val Gly Ala Gly Glu Asn His Pro Phe Asp AlaMET
166 Ala Ser Ser Arg Phe Ile Asp MET Glu His Pro Gly Asp ValArg
181 Pro Glu Asp Phe Phe Glu Trp Thr Leu Asn Arg Asp Ser ThrGlu
196 MET Gln Asp Gly Ile Tyr Ala Phe Asn Gln Leu Leu Asn GlyVal
211 Phe Val Gly Glu Val Ala Gly Val Tyr Phe Leu Ala Ala ValAsp
226 Ser Gly Ser His Lys Arg Asn Ile Arg Glu Ser Met Asn ProGly
241 Val Gly Leu Tyr Ala Phe Thr Gln Tyr Leu Pro Gln Ala AlaGly
256 Arg Ala Gly Glu Lys Lys Ala Ile Glu Gly Ile Leu Asp SerVal
271 Arg Gly Cys His
尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明涵盖的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株，其特征在于，该工程菌株同时表达两个葡醛酸脱氢酶基因(Udh)。
2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，该工程菌株为重组大肠杆菌，该菌株共同表达了氨基酸序列SEQ ID NO.1所示序列的假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonassynxantha strain KENGFT3)来源的Udh(GenBank:CP014868.1)基因和氨基酸序列SEQ IDNO.2所示序列的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的Udh(GenBank:CP013861.1)基因。
3.如权利要求2所述的工程菌株，其特征在于，上述工程菌株的构建方法为：将假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)基因组为模板，扩增葡醛酸脱氢酶(Udh)基因，选用pETDuet-1为表达载体，通过酶切位点进行连接，将葡醛酸脱氢酶Udh与表达载体相连，构建重组质粒pETDuet-2×Udh，将重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，即工程菌株。
4.使用权利要求1-3任一项所述的工程菌株制备葡萄糖二酸的方法，其特征在于，过程为：采用工程菌株，在经过通透化处理之后，以葡萄糖醛酸为底物，获得葡萄糖二酸。
5.如权利要求4所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)通透化处理：将重组大肠杆菌菌液于12000rpm条件下，离心5min，获得湿菌体，将湿菌体反复冻融三次或使用化学试剂处理后，即可，经处理后，可得到通透性良好的重组大肠杆菌细胞；
(2)向步骤(1)中加入反应液Ⅰ或者反应液Ⅱ，使菌体悬浮，加入葡萄糖醛酸作为反应底物，使底物终浓度为2g/L；调pH约为8.5，37℃,220rpm，培养24h；
(3)将反应液在12000rpm条件下，离心5min，分离上清Ⅰ和沉淀；将沉淀洗涤重悬，于100℃沸水浴中加热5min，将菌体中的葡萄糖二酸溶出，然后快速冷却到室温，离心，得到上清Ⅱ；将上清Ⅰ和上清Ⅱ合并，混匀，进行葡萄糖二酸的检测。
6.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，反复冻融的过程为：将得到的湿菌体在液氮中下冷冻10s或将湿菌体在-20℃条件下冷冻24h以上，然后，在37℃条件下解冻，反复冻融三次；所述的化学试剂为甲苯。
7.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应液Ⅰ由葡萄糖25g/L、酵母粉2g/L、硫酸镁0.55g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸铵3.5g/L和硫酸亚铁0.08mg/L组成。
8.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应液Ⅱ由3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)20.9g/L、葡萄糖醛酸2g/L、葡萄糖25g/L、硫酸镁0.55g/L组成。
9.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，葡萄糖二酸的检测方法采用高效液相色谱法，过程为：取1mL的发酵液，于12000rpm离心5min，然后取0.9mL上清液，加入50mg Affi-Gel进行处理，处理后的液体经0.22μm滤膜过滤，进行液相定量分析。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951794A (zh) * 2019-12-31 2020-04-03 江南大学 一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101805770A (zh) * 2010-03-12 2010-08-18 南京工业大学 一种利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方法
CN104312987A (zh) * 2014-10-21 2015-01-28 江南大学 一种生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法
US20170226544A1 (en) * 2014-06-27 2017-08-10 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences E. coli engineering bacteria producing 1,5-pentanediamine through whole cell catalysis and application thereof
CN109929790A (zh) * 2019-03-29 2019-06-25 江南大学 一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用
CN110964757A (zh) * 2018-09-30 2020-04-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种葡萄糖二酸的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101805770A (zh) * 2010-03-12 2010-08-18 南京工业大学 一种利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方法
US20170226544A1 (en) * 2014-06-27 2017-08-10 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences E. coli engineering bacteria producing 1,5-pentanediamine through whole cell catalysis and application thereof
CN104312987A (zh) * 2014-10-21 2015-01-28 江南大学 一种生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法
CN110964757A (zh) * 2018-09-30 2020-04-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种葡萄糖二酸的制备方法
CN109929790A (zh) * 2019-03-29 2019-06-25 江南大学 一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEI，Y. AND YANG,L.: "CP013861.1", 《GENBANK》 *
TOWN, J.ET AL.: "CP014868.1", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951794A (zh) * 2019-12-31 2020-04-03 江南大学 一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法
CN110951794B (zh) * 2019-12-31 2022-03-25 江南大学 一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法

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