CN113151131A

CN113151131A - 一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用

Info

Publication number: CN113151131A
Application number: CN202110315377.6A
Authority: CN
Inventors: 徐毅; 陆馨怡; 马宝娣; 王倩; 吴小梅; 张磊; 刘胜利
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Sinopharm International Technology Ltd.
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN113151131B

Abstract

本发明涉及一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，该培养基包括以下组分：2～10g/L的葡萄糖，1～7g/L的乳糖，20～50g/L的酵母浸粉，6～7g/L的Na₂HPO₄，2～4g/L的KH₂PO₄，0.3～0.7g/L的NaCl，0.8～1.2g/L的NH₄Cl，0.1～0.3g/L的MgSO₄，0.0～0.1g/L的CaCl₂，pH为6～7。本发明采用改进后的自诱导培养基，并利用双温度控制的方式，能有效诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑IEM的表达；该自诱导培养基以乳糖作为底物诱导目的蛋白表达，具有产酶量高，成本低，对环境友好等优点；重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达3180.8U/L。

Description

一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用。

背景技术

单加氧酶(Monooxygenase)是一类催化氧化反应的酶，包括羟基化、环氧化、双羟基化以及芳烃的氧化开环反应。其可通过催化氧分子中的一个氧原子加成到底物分子中，而另一个氧原子则被还原性辅酶NADH或NADPH还原为水。因此单加氧酶总是需要氢供体才能起作用，也常常依赖于FAD或Fe²⁺。

异丁香酚单加氧酶(Isoeugenol Monooxygenase，简称IEM)由于自身含有Fe²⁺可作为亲电体直接参与催化过程，在没有任何辅酶和辅因子的存在下，通过氧化裂解底物异丁香酚上连接苯环的丙烯基而直接生成香兰素。

香兰素(Vanillin)又名香草醛、香茅醛和香兰醛，由于其香气和性质，可广泛用于食品、化工、制药等领域。其用途主要包括：①食品行业：增强食品的香气和饮料的风味、生物防腐剂；②制药行业：药物生产原料和反应过程中的药物中间体；③家居用品：除臭剂、空气清新剂、地板剖光剂；④农业应用：催熟剂、除草剂等。

香兰素的合成方法主要分为植物提取法、化学合成法以及生物合成法。目前市场上的香兰素多数都是化学合成，但是随着现代工业化生产的目标——“绿色化学”、“环境友好”、“可持续发展”，生物催化法由于反应条件温和、反应高效快速、专一性强等优点而成为天然香兰素生产的趋势。1993年，Markus提出用脂氧合酶为催化剂，以异丁香酚和丁香酚为底物制备香草醛，用摇瓶转化时香草醛的最高浓度达22.8g/L(Markus PaulHenry.Processfor the preparation of phenyladehydes[P].EP0542348A2.1993)。2013年，Ji-YoungRYu等人从硝基还原假单胞菌Jin1中提取出异丁香酚单加氧酶基因，将其重组至大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现表达，并简要阐述了该酶可催化底物异丁香酚生成香兰素的机制(Ryu J Y,Seo J,Park S,et al.Characterization of an Isoeugenol Monooxygenase(IEM)from Pseudomonas nitroreducens Jin1 that transforms Isoeugenol toVanillin[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry.2013,77(2):289-294.)。2018年，赵丽青等人从土壤宏基因组中发现新的异丁香酚单加氧酶基因IEM720，也在大肠杆菌中成功实现表达，通过半理性设计进行基因突变，突变体IEM720-F281Q显示出较高的k_cat值和转化率，在结合壳聚糖膜之后香兰素的终浓度可达4.5g/L(Liqing Zhao,YingmiaoXie,Liuyan Chen,et al.Efficient biotransformation of isoeugenol to vanillinin recombinant strains of Escherichia coli by using engineered isoeugenolmonooxygenase and sol-gel chitosan membrane[J].Process Biochemistry.2018,71:76-81.)。

大肠杆菌由于具有细胞结构简单、生长周期短、遗传背景清楚等优势，是基因表达技术中发展最早也是目前最常用的宿主表达菌，其中T7表达系统可使用强力的噬菌体T7启动子进行高水平表达，因此成为目前应用最多的大肠杆菌表达系统之一。但是T7 RNA聚合酶活性非常高，即使在没有诱导剂的情况下，目的蛋白也会有少量的本底表达，为了避免这一问题，可采用带有T7lac启动子的载体。该启动子就是在T7启动子的下游插入一段lac操纵子序列，lac阻遏蛋白既可抑制宿主聚合酶转录T7 RNA聚合酶，也可阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因的转录。对于这种系统，使用乳糖或者乳糖类似物都能进行诱导表达，人们往往选择添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，但是IPTG价格昂贵且对细胞有一定的毒害性，会直接影响目的蛋白的表达。

美国研究人员Studier F W在2005年提出外源基因表达自诱导的方法，即大肠杆菌先以葡萄糖为碳源生长至饱和状态，待消耗完葡萄糖，细胞达到一定活力后，重组菌开始利用培养基中另一碳源成分乳糖(Stuier F W.Protein production by auto-inductionin high-density shaking cultures[J].Protein Expression and Purification.2005,41(1):207-234.)，因此乳糖既可作为诱导剂开启T7表达系统，也可作为细菌生长碳源。与传统的IPTG诱导相比，自诱导培养减少了在培养过程中对细胞生长情况进行监测这一步骤，并且使用价格低廉的乳糖代替IPTG可大大降低生产成本，对于重组蛋白的工业化发酵生产有着重要的意义。此外，发酵时诱导温度会对各种酶的反应速率、微生物的生长代谢机制等有着重要影响。

中国专利申请CN 11549014 A公开了一种产酯酶自诱导培养基及其应用，首次对酯酶进行自诱导培养，采用双温度调控方式进一步提高了重组大肠杆菌产酯酶的能力和产量，然而，其产酶量还是较低，经优化后重组酯酶的细胞酶活仅为1684.0U/L，并且培养基成分较多，导致生产成本高。因此，本发明在此基础上，减少了自诱导培养基的组分以降低成本，同时从多方面对诱导条件进行了优化，并将该自诱导培养基首次应用至重组大肠杆菌产异丁香酚单加氧酶中，进一步提高了其产酶能力，目前尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的产酶量低、生产成本高等缺陷而提供一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用，该培养基用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠杆菌工程菌的培养。利用本发明自诱导培养基和双温度调控方式进一步提高重组大肠杆菌产异丁香酚单加氧酶的能力和产量，为其工业化大规模发酵生产奠定基础。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，配方为：葡萄糖2～10g/L，乳糖1～7g/L，酵母浸粉20～50g/L，6～7g/L Na₂HPO₄，2～4g/L KH₂PO₄，0.3～0.7g/L NaCl，0.8～1.2g/L NH₄Cl，0.1～0.3g/L MgSO₄，0.0～0.1g/L CaCl₂，pH 6.5。

优选地，配方为：葡萄糖2～10g/L，乳糖1～7g/L，酵母浸粉20～50g/L，6.78g/LNa₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5。

进一步优选地，配方为：葡萄糖2～5g/L，乳糖1～5g/L，酵母浸粉20～40g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/LCaCl₂，pH 6.5。

最优选，配方为：葡萄糖4g/L，乳糖3g/L，酵母浸粉30g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5。

本发明还提供了上述产异丁香酚单加氧酶自诱导培养基的应用，该产异丁香酚单加氧酶自诱导培养基用于对重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pET21a-IEM进行培养和发酵，产生的异丁香酚单加氧酶用于合成天然香兰素。

所述的生产异丁香酚单加氧酶的方法包括以下步骤：

(1)获取重组大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)/pET21a-IEM的单个菌落。

(2)将所述的单个菌落接种于LB液体培养基(内含100μg/mL氨苄青霉素)中，培养条件为：36.0～38.0℃，180～220rpm，培养时间为10～14h，即获得种子培养液。LB液体培养基组分如下所示：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

(3)以0.8～2％(v/v)的接种量将步骤(2)得到的种子培养液接种至产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基中，并放置在摇床上进行培养，培养条件为：设置振荡频率为200～250rpm，先在36.0～38.0℃条件下振荡培养1～3h；再在20.0～25.0℃条件下振荡培养32～40h。

优选地，步骤(2)中，培养条件为：37℃，200rpm，培养12h。

优选地，步骤(3)中接种量为1％，培养条件为：设置振荡频率为220rpm，先在37℃条件下振荡培养2h；再在22℃条件下振荡培养36h。

所述的步骤(3)中，培养过程中，pH值为6.0～7.0，装液量为30～70mL毎250mL锥形瓶。

优选地，步骤(3)中初始pH为6.5，装液量为250mL锥形瓶中装50mL。

本发明通过实验分别考察了碳源、氮源浓度对工程菌E.Coli BL21(DE3)/pET21a-IEM的生长及产酶的影响，最终确定了一种自诱导培养基的组成。

本发明的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，是用乳糖作为底物诱导目的蛋白的表达，在细胞生长和产酶过程中，乳糖既可以作为诱导剂在细胞产酶过程中发挥重要作用，又可以作为碳源为细胞生长提供能量。不同的乳糖浓度对异丁香酚单加氧酶细胞的生长及产酶也会有不同的影响，乳糖浓度过低会使目标蛋白表达不充分，而乳糖浓度过高又会导致自诱导培养基中碳氮比失衡，从而抑制细胞的生长，因此本发明通过优化不同的乳糖浓度，进一步提升了异丁香酚单加氧酶的细胞生物量及产酶量。

本发明得到的这种异丁香酚单加氧酶大肠杆菌工程菌，在发酵过程中对氧气的需求量较高，通过改变摇床转速或改变装液量，来满足菌体生长的需求。此外，基因工程菌在表达外源蛋白时，对于诱导所需温度也是不同的，本发明采用双温度分阶段的调控方式，先在37℃条件下培养至菌体浓度达到一定值后，通过降低温度来减缓重组蛋白的合成速率，从而也减少了诱导过程中包涵体的形成。采用改进后的自诱导培养基和双温度调控的培养方式，对产异丁香酚单加氧酶的重组大肠杆菌进行培养，进一步提高了细胞的产酶量和细胞量。本发明通过考察初始pH、装液量、转速、诱导温度、诱导时间对产异丁香酚单加氧酶酶活的影响，最终确定最佳的培养条件。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明成功利用价格低廉的乳糖替代IPTG自动诱导目标蛋白的表达，减少了培养过程中对培养物的处理，同时也大大降低了生产成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要意义。

(2)通过本发明所述的技术方案，得到的菌体细胞量高，OD600值可达30左右，细胞干重能达12.1g/L。

(3)本发明从培养基组分和培养条件出发，找到一种既能高效表达外源蛋白，又能实现自动诱导的改进型产异丁香酚单加氧酶的培养基。采用优化后的自诱导培养基和双温度调控的发酵条件后，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达3180.8U/L。与中国申请专利CN 111549014 A相比，本发明采用的自诱导培养基不仅在配方上有所改良，并且用于产异丁香酚单加氧酶的能力也有大幅提升，对开发生产该酶的发酵工艺和香兰素的合成研究具有重要指导意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-IEM中的IEM基因是根据蛋白质NCBI库，从硝基还原假单胞菌Jin1中获取一段异丁香酚单加氧酶基因(其氨基酸序列如NCBI登录号ACP17973.1所示，核苷酸序列如NCBI登录号FJ851547所示)，并根据宿主大肠杆菌的偏好性对其进行密码子优化后交由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成，优化后的IEM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。然后利用常规的PCR技术进行目的基因的扩增，并通过酶切、连接技术将目的基因与载体pET21a连接，连接后转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中进行扩增，挑取阳性单克隆培养后，提取质粒即重组质粒pET21a-IEM，再将重组质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性单克隆培养后，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-IEM，并以甘油管形式长期保存。

酶活测定方法：

测活的细胞干重为0.5mg，取相应体积的发酵液离心(12000rpm，2min)，弃上清，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤细胞两次后，加入950μL 100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬细胞，置于恒温混匀仪上30℃预热3min后，加入50μL底物异丁香酚(0.2M，溶剂：无水乙醇)继续1000rpm，30℃反应10min，反应结束后，立即加入1mL液相甲醇淬灭反应，于涡旋仪混匀之后，12000rpm离心2min，用无菌注射器吸取上清进HPLC分析。

分析方法(HPLC法)：色谱柱为反相柱C18(Diamonsil plus，4.6mm*250mm*5μm)；流动相(梯度洗脱)：1-8min甲醇：水(pH 2.5)＝35:65，9-16min甲醇：水(pH 2.5)＝65:35；17-24min甲醇：水(pH 2.5)＝35:65；检测波长为280nm；柱温设定为25℃；进样量为20μL。

本发明各实施例中所指的细胞酶活定义为：在30℃，pH 8.0的条件下，单位时间内生成1μmol产物香兰素所需要的酶量定义为一个单位U。

本发明各实施例中所用的试剂均为分析纯或HPLC规格。

产物香兰素的转化率计算如下：

转化率α＝(0.8823×(A－A₀)+0.0286)×B/C×100％

其中A代表外标法积分峰面积，A₀代表底物自发氧化峰面积，B代表总反应体系的稀释倍数，C代表底物异丁香酚的浓度。关系式y＝0.8823x+0.0286为香兰素的外标法标准曲线。

本发明各实施例中香兰素的得率根据实际生成产物香兰素的质量除以理论生成香兰素的质量来计算。

实施例1

重组异丁香酚单加氧酶的构建

根据蛋白质NCBI库，从硝基还原假单胞菌Jin1中获取一段异丁香酚单加氧酶基因(其氨基酸序列如NCBI登录号ACP17973.1所示，核苷酸序列如NCBI登录号FJ851547所示)，并以大肠杆菌为宿主进行密码子优化后交由上海捷瑞生物工程有限公司合成，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

通过上游引物5’-CGCCATATGATGGCACGTCTGAATCGTAAC-3’(下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)和下游引物5’-CCGCTCGAGCGGGCGCGGAACCCAACAGCC-3’(下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)扩增目的基因，PCR扩增使用宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)的PrimeSTAR Max高保真聚合酶，PCR反应体系如下：(引物浓度为10μmol/L)：

PCR扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到1.5kb的条带，符合预期目标蛋白长度。按照试剂盒操作，割胶回收、纯化该目的片段，使用限制性内切酶Nde I和XhoI对回收片段和pET21a空质粒进行双酶切，Ligation Mix用于连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄霉素(100μg/mL)的LB固体平板37℃过夜培养，提取阳性克隆质粒送至北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序，结果显示插入的IEM基因序列正确，命名重组质粒为pET21a-IEM，再将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄霉素(100μg/mL)的LB固体平板37℃过夜培养后，挑取阳性单克隆进行培养，以甘油管形式长期保存，并命名重组菌为E.Coli BL21(DE3)/pET21a-IEM。

实施例2

采用本发明的产异丁香酚单加氧酶自诱导培养基，但是采用单一温度控制的诱导方式；

(1)自诱导培养基：葡萄糖5g/L，乳糖5g/L，酵母浸粉20g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5，用蒸馏水配置；

(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(内含100μg/mL的氨苄青霉素)，于摇床中37℃，200rpm振荡培养12h；

(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL锥形瓶中，于22℃、220rpm培养36h；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达1612.8U/L。

实施例3

采用本发明的产异丁香酚单加氧酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式；

(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、220rpm先培养2h后22℃继续培养36h；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2418.2U/L。

实施例4

(1)自诱导培养基：葡萄糖2g/L，乳糖5g/L，酵母浸粉20g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5，用蒸馏水配置；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2335.6U/L。

实施例5

(1)自诱导培养基：葡萄糖4g/L，乳糖5g/L，酵母浸粉40g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5，用蒸馏水配置；

(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培

养基的250mL锥形瓶中，于37℃、220rpm先培养2h后22℃继续培养36h；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2541.1U/L。

实施例6

(1)自诱导培养基：葡萄糖4g/L，乳糖5g/L，酵母浸粉30g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5，用蒸馏水配置；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2651.6U/L。

实施例7

(1)自诱导培养基：葡萄糖4g/L，乳糖1g/L，酵母浸粉30g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5，用蒸馏水配置；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2852.2U/L。

实施例8

(1)自诱导培养基：葡萄糖4g/L，乳糖3g/L，酵母浸粉30g/L，6.78g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.24g/L MgSO₄，0.011g/L CaCl₂，pH 6.5，用蒸馏水配置；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达3180.8U/L。

实施例9

(1)自诱导培养基：葡萄糖10g/L，乳糖7g/L，酵母浸粉50g/L，7g/L Na₂HPO₄，4g/LKH₂PO₄，0.7g/L NaCl，1.2g/L NH₄Cl，0.3g/L MgSO₄，0.1g/L CaCl₂，pH 6.0，用蒸馏水配置；

(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(内含100μg/mL的氨苄青霉素)，于摇床中36℃，220rpm振荡培养10h；

(3)将(2)中的种子培养液以0.8％接种量接种于装有30mL自诱导培养基的250mL锥形瓶中，于36℃、250rpm先培养3h后20℃继续培养40h；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2914.9U/L。

实施例10

(1)自诱导培养基：葡萄糖2g/L，乳糖1g/L，酵母浸粉20g/L，6g/L Na₂HPO₄，2g/LKH₂PO₄，0.3g/L NaCl，0.8g/L NH₄Cl，0.1g/L MgSO₄，pH 7.0，用蒸馏水配置；

(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(内含100μg/mL的氨苄青霉素)，于摇床中38℃，180rpm振荡培养14h；

(3)将(2)中的种子培养液以2％接种量接种于装有70mL自诱导培养基的250mL锥形瓶中，于38℃、200rpm先培养1h后25℃继续培养32h；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达2818.5U/L。

对比例1

以IPTG为诱导剂，采用优化后的发酵培养基和发酵条件进行诱导，并与本发明所述的自诱导培养基和双温度调控方式培养的重组异丁香酚单加氧酶的产酶能力进行比较。

(1)优化后的发酵培养基：葡萄糖14g/L，酵母浸粉10g/L，7g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，pH 7.0，用蒸馏水配置；

(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL优化后发酵培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200rpm先培养2h，待细胞OD600值达到0.6～0.8后，加入IPTG使其终浓度为0.1mM，继续25℃诱导12h；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，IPTG诱导的重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活可达1942.1U/L；而在本发明的自诱导培养基和发酵条件下，重组异丁香酚单加氧酶的细胞酶活最高可达3180.8U/L，比IPTG诱导的细胞酶活高1.6倍，说明该自诱导培养基和培养方式对异丁香酚单加氧酶的发酵生产有着重要参考价值。

对比例2

将实施例8中的自诱导培养基采用专利CN 111549014 A实施例13中公开的自诱导培养基，并比较重组异丁香酚单加氧酶的产酶能力。

(1)公开的自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO₄，17.9g/L Na₂HPO₄，6.8g/L KH₂PO₄，2.67g/L NH₄Cl，0.71g/LNa₂SO₄，200μg/L痕量元素混合液；

其中痕量元素溶液为：50mM的Fe³⁺，10mM的Mn²⁺、Zn²⁺，2mM的Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Mo₇O₂₄ ^6-、B₄O₇ ^3-，用蒸馏水配置；

采用具体实施方式中的方法获取发酵液并检测细胞酶活，用专利CN 111549014 A实施例13中的产酯酶自诱导培养基产异丁香酚单加氧酶的细胞酶活为1718.5U/L，显著低于本申请，说明采用本发明的培养基配方组分对异丁香酚单加氧酶的发酵生产有着重要影响。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Isoeugenol Monooxygenase)

<400> 1

atggcacgtc tgaatcgtaa cgatcctcag ctggttggta cgctgctgcc gactcgtatt 60

gaagcagacc tgtttgacct ggaagttgac ggtgagatcc cgaagtccat caacggtacc 120

ttttaccgca acaccccgga accgcaggta accccgcaga aattccatac cttcatcgat 180

ggcgacggta tggcttctgc attccacttc gaagatggcc atgttgactt cattagccgt 240

tgggttaaaa ccgcgcgctt cactgctgaa cgtctggcgc gtaaaagcct gtttggtatg 300

taccgcaacc cgtacactga cgatactagc gtgaaaggcc tggaccgtac tgtagcgaac 360

acctctatta tcagccacca cggtaaggtt ctggcagtaa aagaggatgg tctgccgtac 420

gaactggatc cgcgtactct ggaaactcgt ggccgtttcg actatgacgg tcaagtaacc 480

tctcagaccc acaccgcgca cccgaaatat gacccagaga ccggtgatct gctgttcttc 540

ggctccgcgg ctaaaggtga agcaactcct gacatggctt attacatcgt tgacaagcac 600

ggcaaagtaa cccacgaaac ctggtttgag cagccgtacg gcgcgttcat gcacgacttc 660

gccattacgc gtaactggag catcttcccg attatgccgg cgactaactc cctgtcccgt 720

ctgaaagcca aacagccgat ctacatgtgg gaaccggaac tgggctccta catcggcgtc 780

ctgccgcgcc gcggtcaggg ttcccagatc cgttggctga aagcgccggc cctgtgggta 840

ttccacgttg taaacgcctg ggaagtaggt accaaaattt acattgatct gatggaaagc 900

gaaattctgc catttccgtt tccgaactct cagaaccagc cgttcgcacc ggaaaaggcc 960

gttccgcgtc tgactcgttg ggagattgac ctggactcca gctctgacga aatcaaacgt 1020

acgcgtctgc acgacttctt cgcggaaatg ccaatcatgg atttccgctt cgcgctgcag 1080

tgtaaccgtt acggcttcat gggtgtggat gatccgcgca aacctctggc gcatcagcag 1140

gcggaaaaaa tttttgcata caacagcctg ggcatttggg acaaccaccg tggtgactac 1200

gacctgtggt actccggcga agctagcgcc gcgcaggaac ctgcgttcgt tccgcgctct 1260

ccgactgcgg ctgaaggtga cggttacctg ctgactgtag ttggtcgcct ggacgaaaac 1320

cgctccgatc tggttatcct ggatacccag gatatccagt ctggcccggt ggcgactatt 1380

aagctgccgt tccgtctgcg cgcggcactg cacggctgtt gggttccgcg cccg 1434

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列(Isoeugenol Monooxygenase)

<400> 2

Met Ala Arg Leu Asn Arg Asn Asp Pro Gln Leu Val Gly Thr Leu Leu

1 5 10 15

Pro Thr Arg Ile Glu Ala Asp Leu Phe Asp Leu Glu Val Asp Gly Glu

20 25 30

Ile Pro Lys Ser Ile Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Asn Thr Pro Glu Pro

35 40 45

Gln Val Thr Pro Gln Lys Phe His Thr Phe Ile Asp Gly Asp Gly Met

50 55 60

Ala Ser Ala Phe His Phe Glu Asp Gly His Val Asp Phe Ile Ser Arg

65 70 75 80

Trp Val Lys Thr Ala Arg Phe Thr Ala Glu Arg Leu Ala Arg Lys Ser

85 90 95

Leu Phe Gly Met Tyr Arg Asn Pro Tyr Thr Asp Asp Thr Ser Val Lys

100 105 110

Gly Leu Asp Arg Thr Val Ala Asn Thr Ser Ile Ile Ser His His Gly

115 120 125

Lys Val Leu Ala Val Lys Glu Asp Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Asp Pro

130 135 140

Arg Thr Leu Glu Thr Arg Gly Arg Phe Asp Tyr Asp Gly Gln Val Thr

145 150 155 160

Ser Gln Thr His Thr Ala His Pro Lys Tyr Asp Pro Glu Thr Gly Asp

165 170 175

Leu Leu Phe Phe Gly Ser Ala Ala Lys Gly Glu Ala Thr Pro Asp Met

180 185 190

Ala Tyr Tyr Ile Val Asp Lys His Gly Lys Val Thr His Glu Thr Trp

195 200 205

Phe Glu Gln Pro Tyr Gly Ala Phe Met His Asp Phe Ala Ile Thr Arg

210 215 220

Asn Trp Ser Ile Phe Pro Ile Met Pro Ala Thr Asn Ser Leu Ser Arg

225 230 235 240

Leu Lys Ala Lys Gln Pro Ile Tyr Met Trp Glu Pro Glu Leu Gly Ser

245 250 255

Tyr Ile Gly Val Leu Pro Arg Arg Gly Gln Gly Ser Gln Ile Arg Trp

260 265 270

Leu Lys Ala Pro Ala Leu Trp Val Phe His Val Val Asn Ala Trp Glu

275 280 285

Val Gly Thr Lys Ile Tyr Ile Asp Leu Met Glu Ser Glu Ile Leu Pro

290 295 300

Phe Pro Phe Pro Asn Ser Gln Asn Gln Pro Phe Ala Pro Glu Lys Ala

305 310 315 320

Val Pro Arg Leu Thr Arg Trp Glu Ile Asp Leu Asp Ser Ser Ser Asp

325 330 335

Glu Ile Lys Arg Thr Arg Leu His Asp Phe Phe Ala Glu Met Pro Ile

340 345 350

Met Asp Phe Arg Phe Ala Leu Gln Cys Asn Arg Tyr Gly Phe Met Gly

355 360 365

Val Asp Asp Pro Arg Lys Pro Leu Ala His Gln Gln Ala Glu Lys Ile

370 375 380

Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Ile Trp Asp Asn His Arg Gly Asp Tyr

385 390 395 400

Asp Leu Trp Tyr Ser Gly Glu Ala Ser Ala Ala Gln Glu Pro Ala Phe

405 410 415

Val Pro Arg Ser Pro Thr Ala Ala Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Leu Thr

420 425 430

Val Val Gly Arg Leu Asp Glu Asn Arg Ser Asp Leu Val Ile Leu Asp

435 440 445

Thr Gln Asp Ile Gln Ser Gly Pro Val Ala Thr Ile Lys Leu Pro Phe

450 455 460

Arg Leu Arg Ala Ala Leu His Gly Cys Trp Val Pro Arg Pro

465 470 475

Claims

1.一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，其特征在于，该培养基包括以下组分：2～10g/L的葡萄糖，1～7g/L的乳糖，20～50g/L的酵母浸粉，6～7g/L的Na₂HPO₄，2～4g/L的KH₂PO₄，0.3～0.7g/L的NaCl，0.8～1.2g/L的NH₄Cl，0.1～0.3g/L的MgSO₄，0.0～0.1g/L的CaCl₂，pH为6～7。

2.根据权利要求1所述的一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，其特征在于，该培养基包括以下组分：2～10g/L的葡萄糖，1～7g/L的乳糖，20～50g/L的酵母浸粉，6.78g/L的Na₂HPO₄，3g/L的KH₂PO₄，0.5g/L的NaCl，1g/L的NH₄Cl，0.24g/L的MgSO₄，0.011g/L的CaCl₂，pH为6.5。

3.根据权利要求2所述的一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，其特征在于，该培养基包括以下组分：2～5g/L的葡萄糖，1～5g/L的乳糖，20～40g/L的酵母浸粉，6.78g/L的Na₂HPO₄，3g/L的KH₂PO₄，0.5g/L的NaCl，1g/L的NH₄Cl，0.24g/L的MgSO₄，0.011g/L的CaCl₂，pH为6.5。

4.根据权利要求2所述的一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基，其特征在于，该培养基包括以下组分：4g/L的葡萄糖，3g/L的乳糖，30g/L的酵母浸粉，6.78g/L的Na₂HPO₄，3g/L的KH₂PO₄，0.5g/L的NaCl，1g/L的NH₄Cl，0.24g/L的MgSO₄，0.011g/L的CaCl₂，pH为6.5。

5.如权利要求1～4任意一项所述的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基的应用，其特征在于，该产异丁香酚单加氧酶自诱导培养基用于对重组大肠杆菌E.ColiBL21(DE3)/pET21a-IEM进行培养和发酵，产生的异丁香酚单加氧酶用于合成天然香兰素。

6.根据权利要求5所述的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基的应用，其特征在于，产生异丁香酚单加氧酶的方法包括以下步骤：

(1)获取重组大肠杆菌E.ColiBL21(DE3)/pET21a-IEM的单个菌落；

(2)将单个菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，获得种子培养液；

(3)以0.8～2％(v/v)的接种量将步骤(2)得到的种子培养液接种至产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基中，并放置在摇床上进行培养，得到异丁香酚单加氧酶。

7.根据权利要求6所述的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基的应用，其特征在于，所述LB液体培养基组分为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。

8.根据权利要求7所述的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基的应用，其特征在于，所述LB液体培养基培养条件为：36.0～38.0℃，180～220rpm，培养时间为10～14h。

9.根据权利要求6所述的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基的应用，其特征在于，产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基培养条件为：设置振荡频率为200～250rpm，先在36.0～38.0℃条件下振荡培养1～3h；再在20.0～25.0℃条件下振荡培养32～40h。

10.根据权利要求9所述的产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基的应用，其特征在于，培养过程中，pH值为6.0～7.0，装液量为30～70mL每250mL锥形瓶。