CN109735553B - 一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法 - Google Patents

一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，属于医药生物技术领域，通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，设计引物长度，合成引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，将配制好的PCR反应体系进行扩增，将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，挑取单克隆进行测序，测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.1，命名为Sst‑1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，纯化方便，整个体系使用单酶催化，底物用量/NAD用量高达1540:1，辅酶循环次数高，且反应条件温和。

Description

一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种阿扎那韦中间体的制备方法，特别是涉及一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，属于医药生物技术领域。
背景技术
阿扎那韦，以商品名Reyataz出售，是一种用于治疗和预防艾滋病毒/艾滋病的抗逆转录病毒药物，是目前世界上主要的抗艾滋病药物之一，它在世界卫生组织的基本药物清单上，是基本卫生系统所需的最重要的药物，百时美施贵宝公司最早开发了阿扎那韦，在中国专利CN10282508C有公开介绍，美国FDA在2003年批准其上市，中国也于2007年批准其上市。
(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备阿扎那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物合成法两种，其中生物法可由相应的酮还原酶或微生物全细胞生物转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇获得。
在日本专利JP4746548B2中公开了JP4746548B2最早提出用生物法制备(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，该专利利用一种新型的羰基還元酵素，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。以及在中国专利CN1993464B中公开了其他类似的光学活性醇，该专利同时在中国申请保护并在2011年取得授权，但由于该专利使用了辅酶IINADP，市场价格昂贵，一定程度上限制了其应用，后续其他公司如美国codexis等在酶种类、反应条件、以及辅酶循环等条件进行优化提升，进一步提高生产效率，以期降低条件要求及成本，
在中国专利CN104911224中将主酶及NADP共固定化后进行生物催化，但是该工艺反应时间过长48h－60h，生产效率较低，进一步增加了生产成长；固定化酶的制备及使用后的保存程序繁琐，且该工艺并未给出固定化酶有效的重复使用次数。
在中国专利CN103468757的工艺中用到葡萄糖，在反应结束时生成的葡萄糖酸无回收利用价格，进而产生大量固废，且该工艺使用酶粉进行反应，放大生产前景有限。
在国际专利WO2011005527的工艺中由于所用酶的酶活不高，催化90克底物需要用到0.3gNAD，底物：NAD的比例仅为300，导致生产每公斤产品中的NAD成本占比过大，使得生产成本偏高，在中国专利CN102732579中使用了酿酒酵母进行全细胞催化，但所需酵母菌体过多(10g干细胞)，催化底物仅在不大于0.1mM时才能转化完全，该工艺的生产效率偏低。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，整个体系使用单酶催化，底物浓度高达160g/L，底物用量/NAD用量高达1540:1，辅酶循环次数高，且反应条件温和。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达；利用PrimerPremier和OPTIMIZER进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：
1TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATCG
2CCGGTAACAACAGCAACAACGTTGTTCAGAGCGATGGTCATATGTATATCTCCTT
3GTTGTTGCTGTTGTTACCGGTGCTGCTGGTGGTATCGGTCGTGAACTGGTTAAAG
4GCAGCGATAACGATAGCGTTAGCAGCTTTCATAGCTTTAACCAGTTCACGACCGA
5ACGCTATCGTTATCGCTGCTGAAATGGCTCCGTCTGCTGACAAAGAAGGTGCTGA
6CAGCTTCAGAGGTAACGTCGTGCTGCAGGTAGTGGTCAGCACCTTCTTTGTCAGC
7CGACGTTACCTCTGAAGCTGGTTGGAAAGCTGTTGCTGCTCTGGCTCAGGAAAAA
8 CCAGCGTTGTGAACCAGAGCGTCAACACGACCGTATTTTTCCTGAGCCAGAGCAG
9 CTCTGGTTCACAACGCTGGTATCTCTATCGTTACCAAATTCGAAGACACCCCGCT
10 AGTCAACGTTAACGGTGTTAACACGGTGGAAGTCAGACAGCGGGGTGTCTTCGAA
11 GTTAACACCGTTAACGTTGACTCTATCATCATCGGTACCCAGGTTCTGCTGCCGC
12 AAGCACCACCAGCACGAGCTTTACCACCTTCTTTCAGCAGCGGCAGCAGAACCTG
13 TCGTGCTGGTGGTGCTTCTGTTGTTAACTTCTCTTCTGTTGGTGGTCTGCGTGGT
14 GCAGCTTTAGAGGTGCAGTAAGCAGCGTTGAAAGCAGCACCACGCAGACCACCAA
15 TTACTGCACCTCTAAAGCTGCTGTTAAAATGCTGTCTAAATGCCTGGGTGCTGAA
16 GAGTTAACACGGATGTTGTAACCCAGAGCAGCGAATTCAGCACCCAGGCATTTAG
17 GGTTACAACATCCGTGTTAACTCTGTTCACCCGGGTGGTATCGACACCCCGATGC
18 GCACCCAGTTCAACGTATTTGTCCATGATAGAACCCAGCATCGGGGTGTCGATAC
19 CAAATACGTTGAACTGGGTGCTGCTCCGTCTCGTGAAGTTGCTCAGGCTGCTATG
20 GGACGACCCATACGACCGATCGGGTGACGCATTTCCATAGCAGCCTGAGCAACTT
21 CGGTCGTATGGGTCGTCCGGCTGAAATGGGTGGTGGTGTTGTTTACCTGTGCTCT
22 CGAATTCGGTGCAGGTAACGAAAGAAGCAGCGTCAGAGCACAGGTAAACAACACC
23 GTTACCTGCACCGAATTCGTTATGGACGGTGGTTTCTCTCAGGTTTAATAACTCG
24 CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAACCTGAGAGAAACC
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM，将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中进行扩增，将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点，挑取单克隆进行测序，测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.1，命名为Sst-1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
反应体系为：
2mM dNTP mix(2mM each dNTP)，5μl；
10×Pfu buffer，5μl；
Pfu DNA polymerase(10U/μl)，0.5μl；
ddH2O使得反应体系总体积至50μl ddH2O；
反应体系中按下列程序进行扩增：98℃，30s；55℃，45s；72℃，120s；35x。
抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：参考蛋白Cod-CK基因序列的合成
根据AJM46704.1所示序列，对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pET30a中，得到对照蛋白表达质粒Cod-CK；
步骤2：摇瓶表达测试
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中，添加卡那霉素，过夜培养，次日取1L三角瓶，接入培养基中，添加卡那霉素；加IPTG培养，培养结束后，将培养液离心收集湿菌体，将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；
步骤3：分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，初级接种菌种制备培养物，OD2.0时接入，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联控制在30％自动控制，发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料；
步骤4：生物转化反应
在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-1，摇床反应；
步骤5：生物转化反应
在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-2，30C摇床反应；
步骤6：生物转化反应
在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-3，30C摇床反应；
步骤7：生物转化反应
在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Cod-CK，30C摇床反应；
步骤8：TLC检测产物
将上述反应中的3小时反应转化产物进行TLC检测；
步骤9：酶活检测
取6个离心管，分别标号1-6，分别加NADH溶液，然后每管补加磷酸盐缓冲液，检测并记录吸光度的值，得到NADH的标准曲线Y＝k*X，用纯水按一定的倍数稀释酶液，取离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。
步骤2中，挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中；
培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L；
添加卡那霉素至50mg/L，30℃，250rpm过夜培养；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
于30℃中培养至菌体OD5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；
加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；
将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
步骤3中，分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH7.0；
初级接种菌种制备200ml培养物，OD2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0；
发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料；
补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油，当OD600为35.0，湿重约为60g/L时，用0.2mMIPTG诱导。
步骤4中，在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mMMgCl2，0.1MPBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5；最后加入21mgNAD，6.4ml粗酶液Sst-1，30C摇床反应。200ml反应体系；分别在3小时，20小时取样保存；反应在20小时已完全转化底物。
步骤5中，在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mMMgCl2，0.1MPBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5，最后加入21mgNAD，6.4ml粗酶液Sst-2，30C摇床反应，200ml反应体系。
步骤6中，在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mMMgCl2，0.1MPBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5，最后加入21mgNAD，6.4ml粗酶液Sst-3，30C摇床反应，200ml反应体系。
步骤7中，在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mMMgCl2，0.1MPBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5，最后加入21mgNAD，6.4ml粗酶液Cod-CK，30C摇床反应，200ml反应体系。
步骤9中，取6个5ml离心管，分别标号1-6，分别加入3mM的NADH溶液0ul，40ul，80ul，100ul，120ul，160ul，然后每管补加0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液补足3ml，混匀后在340nm下检测并记录吸光度的值；根据上述测得值，得到NADH的标准曲线Y＝k*X，其中Y为吸光度的值，X为NADH的浓度mM，曲线的R2>99.5％；用纯水按一定的倍数稀释酶液，稀释的倍数使每分钟吸光值变化0.02-0.04之间为合适；取5ml离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿；
检测试剂成分及用量：
异丙醇，500ul；
2％NAD，100uL；
100mMPBS(pH7.0)，2.35mL；
稀释后的酶液，50uL；
在340nm处检测吸光度的变化，每隔1min记录一个值，每分钟的变化率基本相同，其中0min的吸光度为S0，3min的吸光度为S3；
酶活计算公式：
酶活(U/ml)＝[(S0-S3)*3ml*N]/[k×时间(t/min)×加酶量(ml)]
其中，N为酶液的稀释倍数。
本发明的有益技术效果：
1、本发明提供的抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，利用该酶可生物催化将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产阿扎那韦的关键中间体(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇无副产物产生，纯化方便；此外反应溶剂主要为水，三废排放低，绿色环保，整个体系使用单酶催化，底物浓度高达160g/L，底物用量/NAD用量高达1540:1，辅酶循环次数高，且反应条件温和。
2、本发明提供的抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，提供的醇脱氢酶突变体，其醇脱氢酶活性比野生型醇脱氢酶的活性至少增强2-10倍，与野生型醇脱氢酶相比，使底物(例如3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇)向产物(例如(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇)转化速率大幅增加。
附图说明
图1为Sst-1的表达质粒图谱；
图2为Sst-1，Sst-2，Sst-3，Cod-CK生物转化反应3小时的TLC图谱，从左至右依次为Sst-1，Sst-2，Sst-3，Cod-CK，上方条带为底物，下方条带为产物；
图3为Sst-1反应20h的TLC图谱。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例提供的抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，包括如下步骤：
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。
利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：
1TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATCG
2CCGGTAACAACAGCAACAACGTTGTTCAGAGCGATGGTCATATGTATATCTCCTT
3GTTGTTGCTGTTGTTACCGGTGCTGCTGGTGGTATCGGTCGTGAACTGGTTAAAG
4GCAGCGATAACGATAGCGTTAGCAGCTTTCATAGCTTTAACCAGTTCACGACCGA
5ACGCTATCGTTATCGCTGCTGAAATGGCTCCGTCTGCTGACAAAGAAGGTGCTGA
6CAGCTTCAGAGGTAACGTCGTGCTGCAGGTAGTGGTCAGCACCTTCTTTGTCAGC
7CGACGTTACCTCTGAAGCTGGTTGGAAAGCTGTTGCTGCTCTGGCTCAGGAAAAA
8CCAGCGTTGTGAACCAGAGCGTCAACACGACCGTATTTTTCCTGAGCCAGAGCAG
9CTCTGGTTCACAACGCTGGTATCTCTATCGTTACCAAATTCGAAGACACCCCGCT
10AGTCAACGTTAACGGTGTTAACACGGTGGAAGTCAGACAGCGGGGTGTCTTCGAA
11GTTAACACCGTTAACGTTGACTCTATCATCATCGGTACCCAGGTTCTGCTGCCGC
12AAGCACCACCAGCACGAGCTTTACCACCTTCTTTCAGCAGCGGCAGCAGAACCTG
13TCGTGCTGGTGGTGCTTCTGTTGTTAACTTCTCTTCTGTTGGTGGTCTGCGTGGT
14GCAGCTTTAGAGGTGCAGTAAGCAGCGTTGAAAGCAGCACCACGCAGACCACCAA
15TTACTGCACCTCTAAAGCTGCTGTTAAAATGCTGTCTAAATGCCTGGGTGCTGAA
16GAGTTAACACGGATGTTGTAACCCAGAGCAGCGAATTCAGCACCCAGGCATTTAG
17GGTTACAACATCCGTGTTAACTCTGTTCACCCGGGTGGTATCGACACCCCGATGC
18GCACCCAGTTCAACGTATTTGTCCATGATAGAACCCAGCATCGGGGTGTCGATAC
19CAAATACGTTGAACTGGGTGCTGCTCCGTCTCGTGAAGTTGCTCAGGCTGCTATG
20GGACGACCCATACGACCGATCGGGTGACGCATTTCCATAGCAGCCTGAGCAACTT
21CGGTCGTATGGGTCGTCCGGCTGAAATGGGTGGTGGTGTTGTTTACCTGTGCTCT
22CGAATTCGGTGCAGGTAACGAAAGAAGCAGCGTCAGAGCACAGGTAAACAACACC
23GTTACCTGCACCGAATTCGTTATGGACGGTGGTTTCTCTCAGGTTTAATAACTCG
24CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAACCTGAGAGAAACC
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
2mM dNTP mix(2mM each dNTP) 5μl
10×Pfu buffer 5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl
ddH2O 使得反应体系总体积至50μl
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.1，命名为Sst-1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例2：
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。
利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：
1TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATCG
2CCGGTAACAACAGCAACAACGTTGTTCAGAGCGATGGTCATATGTATATCTCCTT
3GTTGTTGCTGTTGTTACCGGTGCTGCTGGTGGTATCGGTCGTGAACTGGTTAAAG
4GCAGCGATAACGATAGCGTTAGCAGCTTTCATAGCTTTAACCAGTTCACGACCGA
5ACGCTATCGTTATCGCTGCTGAAATGGCTAAATCTGCTGACAAAGAAGGTGCTGA
6CAGCTTCAGAGGTAACGTCGTGCTGCAGGTAGTGGTCAGCACCTTCTTTGTCAGC
7CGACGTTACCTCTGAAGCTGGTTGGAAAGCTGTTGCTGCTCTGGCTCAGGAAAAA
8CCAGCGTTGTGAACCAGAGCGTCAACACGACCGTATTTTTCCTGAGCCAGAGCAG
9CTCTGGTTCACAACGCTGGTATCTCTATCGTTACCAAATTCGAAGACACCCCGCT
10AGTCAACGTTAACGGTGTTAACACGGTGGAAGTCAGACAGCGGGGTGTCTTCGAA
11GTTAACACCGTTAACGTTGACTCTATCATCATCGGTACCCAGGTTCTGCTGCCGC
12AAGCACCACCAGCACGAGCTTTACCACCTTCTTTCAGCAGCGGCAGCAGAACCTG
13TCGTGCTGGTGGTGCTTCTGTTGTTAACTTCTCTTCTGTTGGTGGTCTGCGTGGT
14GCAGCTTTAGAGGTGCAGTAAGCAGCGTTGAAAGCAGCACCACGCAGACCACCAA
15TTACTGCACCTCTAAAGCTGCTGTTAAAATGCTGTCTAAATGCCTGGGTGCTGAA
16GAGTTAACACGGATGTTGTAACCCAGAGCAGCGAATTCAGCACCCAGGCATTTAG
17GGTTACAACATCCGTGTTAACTCTGTTCACCCGGGTGGTATCGACACCCCGATGC
18GCACCCAGTTCAACGTATTTGTCCATGATAGAACCCAGCATCGGGGTGTCGATAC
19CAAATACGTTGAACTGGGTGCTGCTCCGTCTCGTGAAGTTGCTCAGGCTGCTATG
20GGACGACCCATACGACCGATCGGGTGACGCATTTCCATAGCAGCCTGAGCAACTT
21CGGTCGTATGGGTCGTCCGGCTGAAATGGGTGGTGGTGTTGTTTACCTGTGCTCT
22CGAATTCGGTGCAGGTAACGAAAGAAGCAGCGTCAGAGCACAGGTAAACAACACC
23GTTACCTGCACCGAATTCGTTATGGACGGTGGTTTCTCTCAGGTTTAATAACTCG
24CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAACCTGAGAGAAACC
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
2mM dNTP mix(2mM each dNTP) 5μl
10×Pfu buffer 5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl
ddH2O 使得反应体系总体积至50μl
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.3，命名为Sst-2，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
实施例3：
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。
利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：
1TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATCGC
2ACCGGTAACAACAGCAACAACGTTGTTCAGAGCGATGGTCATATGTATATCTCCT
3TTGTTGCTGTTGTTACCGGTGCTGCTGGTGGTATCGGTCGTGAACTGGTTAAAGC
4CAGCAGCGATAACGATAGCGTTAGCAGCTTTCATAGCTTTAACCAGTTCACGACC
5CGCTATCGTTATCGCTGCTGAAATGGCTAAATCTGCTAACAAAGAAGGTGCTGAC
6CAGCTTCAGAGGTAACGTCGTGCTGCAGGTAGTGGTCAGCACCTTCTTTGTTAGC
7CGACGTTACCTCTGAAGCTGGTTGGAAAGCTGTTGCTGCTCTGGCTCAGGAAAAA
8CCAGCGTTGTGAACCAGAGCGTCAACACGACCGTATTTTTCCTGAGCCAGAGCAG
9CTCTGGTTCACAACGCTGGTATCTCTATCGTTACCAAATTCGAAGACACCCCGCT
10AGTCAACGTTAACGGTGTTAACACGGTGGAAGTCAGACAGCGGGGTGTCTTCGAA
11GTTAACACCGTTAACGTTGACTCTATCATCATCGGTACCCAGGTTCTGCTGCCGC
12AAGCACCACCAGCACGAGCTTTACCACCTTCTTTCAGCAGCGGCAGCAGAACCTG
13TCGTGCTGGTGGTGCTTCTGTTGTTAACTTCTCTTCTGTTGGTGGTCTGCGTGGT
14GCAGCTTTAGAGGTGCAGTAAGCAGCGTTGAAAGCAGCACCACGCAGACCACCAA
15TTACTGCACCTCTAAAGCTGCTGTTAAAATGCTGTCTAAATGCCTGGGTGCTGAA
16GAGTTAACACGGATGTTGTAACCCAGAGCAGCGAATTCAGCACCCAGGCATTTAG
17GGTTACAACATCCGTGTTAACTCTGTTCACCCGGGTGGTATCGACACCCCGATGC
18GCACCCAGTTCAACGTATTTGTCCATGATAGAACCCAGCATCGGGGTGTCGATAC
19CAAATACGTTGAACTGGGTGCTGCTCCGTCTCGTGAAGTTGCTCAGGCTGCTATG
20GGACGACCCATACGACCGATCGGGTGACGCATTTCCATAGCAGCCTGAGCAACTT
21CGGTCGTATGGGTCGTCCGGCTGAAATGGGTGGTGGTGTTGTTTACCTGTGCTCT
22CGAATTCGGTGCAGGTAACGAAAGAAGCAGCGTCAGAGCACAGGTAAACAACACC
23GTTACCTGCACCGAATTCGTTATGGACGGTGGTTTCTCTCAGGTTTAATAACTCG
24CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAACCTGAGAGAAACC
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
2mM dNTP mix(2mM each dNTP) 5μl
10×Pfu buffer 5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl
ddH2O 使得反应体系总体积至50μl
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO.5，命名为Sst-3，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
参考蛋白Cod-CK基因序列的合成；
根据AJM46704.1所示序列，委托上海捷瑞生物对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pET30a中，得到对照蛋白表达质粒Cod-CK(SEQ ID NO.7)。
摇瓶表达测试
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。初级接种菌种制备200ml培养物，OD2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为35.0(湿重约为60g/L)时，用0.2mM IPTG诱导。
生物转化反应
在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mM MgCl2，0.1M PBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5。最后加入21mg NAD，6.4ml粗酶液Sst-1，30C摇床反应。200ml反应体系。分别在3小时，20小时取样保存。由图3可知，反应在20小时已完全转化底物。
生物转化反应
在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mM MgCl2，0.1M PBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5。最后加入21mg NAD，6.4ml粗酶液Sst-2，30C摇床反应。200ml反应体系。
生物转化反应
在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mM MgCl2，0.1M PBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5。最后加入21mg NAD，6.4ml粗酶液Sst-3，30C摇床反应。200ml反应体系。
生物转化反应
在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mM MgCl2，0.1M PBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5。最后加入21mg NAD，6.4ml粗酶液Cod-CK，30C摇床反应。200ml反应体系。
TLC检测产物
将上述实施例中的3小时反应转化产物进行TLC检测，结果如图2所示。可见Sst-1，Sst-2，Sst-3反应速度均大于对照组Cod-CK。
酶活检测
取6个5ml离心管，分别标号1-6，分别加入3mM的NADH溶液0ul，40ul，80ul，100ul，120ul，160ul，然后每管补加0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液补足3ml，混匀后在340nm下检测并记录吸光度的值；根据上述测得值，得到NADH的标准曲线Y＝k*X，其中Y为吸光度的值，X为NADH的浓度(mM)，曲线的R2>99.5％；用纯水按一定的倍数稀释酶液(参考稀释倍数：600-1000倍)，稀释的倍数使每分钟吸光值变化0.02-0.04之间为合适；取5ml离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。
检测试剂 用量
异丙醇 500ul
2％NAD 100uL
100mM PBS(pH7.0) 2.35mL
稀释后的酶液 50uL
在340nm处检测吸光度的变化，每隔1min记录一个值，每分钟的变化率基本相同，其中0min的吸光度为S0，3min的吸光度为S3；
酶活计算公式：
酶活(U/ml)＝[(S0-S3)*3ml*N]/[k×时间(t/min)×加酶量(ml)]
其中N为酶液的稀释倍数。
检测结果如下：
待测样 酶活U/ml
Sst-1 1266
Sst-2 277
Sst-3 272
Sst 95
可见，本发明提供的醇脱氢酶突变体，其醇脱氢酶活性比野生型醇脱氢酶Sst(SEQID NO.8)的活性至少增强2-10倍。与野生型醇脱氢酶相比，使底物(例如3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇)向产物(例如(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇)转化速率大幅增加。
综上所述，在本实施例中，本实施例提供的抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，利用该酶可生物催化将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产阿扎那韦的关键中间体(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇无副产物产生，纯化方便；此外反应溶剂主要为水，三废排放低，绿色环保，整个体系使用单酶催化，底物浓度高达160g/L，底物用量/NAD用量高达1540:1，辅酶循环次数高，且反应条件温和。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京诺云生物科技有限公司
<120> 一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法
<130> 2018
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgaccatcg ctctgaacaa cgttgttgct gttgttaccg gtgctgctgg tggtatcggt 60
cgtgaactgg ttaaagctat gaaagctgct aacgctatcg ttatcgctgc tgaaatggct 120
ccgtctgctg acaaagaagg tgctgaccac tacctgcagc acgacgttac ctctgaagct 180
ggttggaaag ctgttgctgc tctggctcag gaaaaatacg gtcgtgttga cgctctggtt 240
cacaacgctg gtatctctat cgttaccaaa ttcgaagaca ccccgctgtc tgacttccac 300
cgtgttaaca ccgttaacgt tgactctatc atcatcggta cccaggttct gctgccgctg 360
ctgaaagaag gtggtaaagc tcgtgctggt ggtgcttctg ttgttaactt ctcttctgtt 420
ggtggtctgc gtggtgctgc tttcaacgct gcttactgca cctctaaagc tgctgttaaa 480
atgctgtcta aatgcctggg tgctgaattc gctgctctgg gttacaacat ccgtgttaac 540
tctgttcacc cgggtggtat cgacaccccg atgctgggtt ctatcatgga caaatacgtt 600
gaactgggtg ctgctccgtc tcgtgaagtt gctcaggctg ctatggaaat gcgtcacccg 660
atcggtcgta tgggtcgtcc ggctgaaatg ggtggtggtg ttgtttacct gtgctctgac 720
gctgcttctt tcgttacctg caccgaattc gttatggacg gtggtttctc tcaggtttaa 780
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Ala Glu Met Ala Pro Ser Ala Asp Lys Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe
245 250 255
Ser Gln Val
<210> 3
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgaccatcg ctctgaacaa cgttgttgct gttgttaccg gtgctgctgg tggtatcggt 60
cgtgaactgg ttaaagctat gaaagctgct aacgctatcg ttatcgctgc tgaaatggct 120
aaatctgctg acaaagaagg tgctgaccac tacctgcagc acgacgttac ctctgaagct 180
ggttggaaag ctgttgctgc tctggctcag gaaaaatacg gtcgtgttga cgctctggtt 240
cacaacgctg gtatctctat cgttaccaaa ttcgaagaca ccccgctgtc tgacttccac 300
cgtgttaaca ccgttaacgt tgactctatc atcatcggta cccaggttct gctgccgctg 360
ctgaaagaag gtggtaaagc tcgtgctggt ggtgcttctg ttgttaactt ctcttctgtt 420
ggtggtctgc gtggtgctgc tttcaacgct gcttactgca cctctaaagc tgctgttaaa 480
atgctgtcta aatgcctggg tgctgaattc gctgctctgg gttacaacat ccgtgttaac 540
tctgttcacc cgggtggtat cgacaccccg atgctgggtt ctatcatgga caaatacgtt 600
gaactgggtg ctgctccgtc tcgtgaagtt gctcaggctg ctatggaaat gcgtcacccg 660
atcggtcgta tgggtcgtcc ggctgaaatg ggtggtggtg ttgtttacct gtgctctgac 720
gctgcttctt tcgttacctg caccgaattc gttatggacg gtggtttctc tcaggtttaa 780
<210> 4
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Ala Glu Met Ala Lys Ser Ala Asp Lys Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe
245 250 255
Ser Gln Val
<210> 5
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgaccatcg ctctgaacaa cgttgttgct gttgttaccg gtgctgctgg tggtatcggt 60
cgtgaactgg ttaaagctat gaaagctgct aacgctatcg ttatcgctgc tgaaatggct 120
aaatctgcta acaaagaagg tgctgaccac tacctgcagc acgacgttac ctctgaagct 180
ggttggaaag ctgttgctgc tctggctcag gaaaaatacg gtcgtgttga cgctctggtt 240
cacaacgctg gtatctctat cgttaccaaa ttcgaagaca ccccgctgtc tgacttccac 300
cgtgttaaca ccgttaacgt tgactctatc atcatcggta cccaggttct gctgccgctg 360
ctgaaagaag gtggtaaagc tcgtgctggt ggtgcttctg ttgttaactt ctcttctgtt 420
ggtggtctgc gtggtgctgc tttcaacgct gcttactgca cctctaaagc tgctgttaaa 480
atgctgtcta aatgcctggg tgctgaattc gctgctctgg gttacaacat ccgtgttaac 540
tctgttcacc cgggtggtat cgacaccccg atgctgggtt ctatcatgga caaatacgtt 600
gaactgggtg ctgctccgtc tcgtgaagtt gctcaggctg ctatggaaat gcgtcacccg 660
atcggtcgta tgggtcgtcc ggctgaaatg ggtggtggtg ttgtttacct gtgctctgac 720
gctgcttctt tcgttacctg caccgaattc gttatggacg gtggtttctc tcaggtttaa 780
<210> 6
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Ala Glu Met Ala Lys Ser Ala Asn Lys Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe
245 250 255
Ser Gln Val
<210> 7
<211> 263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys
20 25 30
Ala Ala Asn Ala Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp
35 40 45
Val Glu Gly Ala Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala
50 55 60
Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val
65 70 75 80
Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu
85 90 95
Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp
100 105 110
Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly
115 120 125
Gly Lys Ala Arg Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val
130 135 140
Ala Gly Leu Arg Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys
145 150 155 160
Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp
180 185 190
Thr Pro Met Leu Gly Ser Leu Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala
195 200 205
Ala Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro
210 215 220
Ile Gly Arg Met Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr
225 230 235 240
Leu Cys Ser Asp Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met
245 250 255
Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val
260
<210> 8
<211> 259
<212> PRT
<213> Sphingomonas stygia
<400> 8
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe
245 250 255
Ser Gln Val

Claims (8)

1.一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达；利用Primer
Premier和OPTIMIZER进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：
1 TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATCG
2 CCGGTAACAACAGCAACAACGTTGTTCAGAGCGATGGTCATATGTATATCTCCTT
3 GTTGTTGCTGTTGTTACCGGTGCTGCTGGTGGTATCGGTCGTGAACTGGTTAAAG
4 GCAGCGATAACGATAGCGTTAGCAGCTTTCATAGCTTTAACCAGTTCACGACCGA
5 ACGCTATCGTTATCGCTGCTGAAATGGCTCCGTCTGCTGACAAAGAAGGTGCTGA
6 CAGCTTCAGAGGTAACGTCGTGCTGCAGGTAGTGGTCAGCACCTTCTTTGTCAGC
7 CGACGTTACCTCTGAAGCTGGTTGGAAAGCTGTTGCTGCTCTGGCTCAGGAAAAA
8 CCAGCGTTGTGAACCAGAGCGTCAACACGACCGTATTTTTCCTGAGCCAGAGCAG
9 CTCTGGTTCACAACGCTGGTATCTCTATCGTTACCAAATTCGAAGACACCCCGCT
10 AGTCAACGTTAACGGTGTTAACACGGTGGAAGTCAGACAGCGGGGTGTCTTCGAA
11 GTTAACACCGTTAACGTTGACTCTATCATCATCGGTACCCAGGTTCTGCTGCCGC
12 AAGCACCACCAGCACGAGCTTTACCACCTTCTTTCAGCAGCGGCAGCAGAACCTG
13 TCGTGCTGGTGGTGCTTCTGTTGTTAACTTCTCTTCTGTTGGTGGTCTGCGTGGT
14 GCAGCTTTAGAGGTGCAGTAAGCAGCGTTGAAAGCAGCACCACGCAGACCACCAA
15 TTACTGCACCTCTAAAGCTGCTGTTAAAATGCTGTCTAAATGCCTGGGTGCTGAA
16 GAGTTAACACGGATGTTGTAACCCAGAGCAGCGAATTCAGCACCCAGGCATTTAG
17 GGTTACAACATCCGTGTTAACTCTGTTCACCCGGGTGGTATCGACACCCCGATGC
18 GCACCCAGTTCAACGTATTTGTCCATGATAGAACCCAGCATCGGGGTGTCGATAC
19 CAAATACGTTGAACTGGGTGCTGCTCCGTCTCGTGAAGTTGCTCAGGCTGCTATG
20 GGACGACCCATACGACCGATCGGGTGACGCATTTCCATAGCAGCCTGAGCAACTT
21 CGGTCGTATGGGTCGTCCGGCTGAAATGGGTGGTGGTGTTGTTTACCTGTGCTCT
22 CGAATTCGGTGCAGGTAACGAAAGAAGCAGCGTCAGAGCACAGGTAAACAACACC
23 GTTACCTGCACCGAATTCGTTATGGACGGTGGTTTCTCTCAGGTTTAATAACTCG
24 CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAAACCTGAGAGAAACC
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM，将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中进行扩增，将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点，挑取单克隆进行测序，测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.1，命名为Sst-1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.如权利要求1所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，反应体系为：
2mM dNTP mix(2mM each dNTP)，5μl；
10×Pfu buffer，5μl；
Pfu DNA polymerase(10U/μl)，0.5μl；
ddH2O使得反应体系总体积至50μl ddH2O；
反应体系中按下列程序进行扩增：98℃，30s；55℃，45s；72℃，120s；35x。
3.如权利要求2所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：参考蛋白Cod-CK基因序列的合成
根据AJM46704.1所示序列，对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pET30a中，得到对照蛋白表达质粒Cod-CK；
步骤2：摇瓶表达测试
挑取含有所述表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中，添加卡那霉素，过夜培养，次日取1L三角瓶，接入培养基中，添加卡那霉素；加IPTG培养，培养结束后，将培养液离心收集湿菌体，将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；
步骤3：分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，初级接种菌种制备培养物，OD2.0时接入，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联控制在30％，自动控制，发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料；
步骤4：生物转化反应
在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-1，摇床反应；
步骤5：生物转化反应
在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Cod-CK，30℃摇床反应；
步骤6：TLC检测产物
将上述反应中的3小时反应转化产物进行TLC检测；
步骤7：酶活检测
取6个离心管，分别标号1-6，分别加NADH溶液，然后每管补加磷酸盐缓冲液，检测并记录吸光度的值，得到NADH的标准曲线Y＝k*X，用纯水按一定的倍数稀释酶液，取离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。
4.如权利要求3所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，步骤2中，挑取含有所述表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中；
培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L；
添加卡那霉素至50mg/L，30℃，250rpm过夜培养；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
于30℃中培养至菌体OD5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；
加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；
将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存，同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
5.如权利要求3所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，步骤3中，分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH7.0；
初级接种菌种制备200ml培养物，OD2.0时接入，在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；
发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料；
补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油，当OD600为35.0，湿重约为60g/L时，用0.2mM IPTG诱导。
6.如权利要求3所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，步骤4中，在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g 3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预溶解底物，再加入1mM MgCl2，0.1mM PBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5；最后加入21mg NAD，6.4ml粗酶液Sst-1，30℃摇床反应，200ml反应体系。
7.如权利要求3所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，步骤7中，在500ml三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入2.7ml甲苯，32ml异丙醇，32g 3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入1mM MgCl2，0.1mM PBpH7.5使总体系约190ml，混匀后调节pH至7.5，最后加入21mg NAD，6.4ml粗酶液Cod-CK，30℃摇床反应，200ml反应体系。
8.如权利要求3所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，步骤9中，取6个5ml离心管，分别标号1-6，分别加入3mM的NADH溶液0ul，40ul，80ul，100ul，120ul，160ul，然后每管补加0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液补足3ml，混匀后在340nm下检测并记录吸光度的值；根据上述测得值，得到NADH的标准曲线Y＝k*X，其中Y为吸光度的值，X为NADH的浓度mM，曲线的R2>99.5％；用纯水按一定的倍数稀释酶液，稀释的倍数使每分钟吸光值变化0.02-0.04之间为合适；取5ml离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿；
检测试剂成分及用量：
异丙醇，500ul；
2％NAD，100uL；
100mM PBS(pH7.0)，2.35mL；
稀释后的酶液，50uL；
在340nm处检测吸光度的变化，每隔1min记录一个值，每分钟的变化率基本相同，其中0min的吸光度为S0，3min的吸光度为S3；
酶活计算公式：
酶活(U/ml)＝[(S0-S3)*3ml*N]/[k×时间(t/min)×加酶量(ml)]
其中，N为酶液的稀释倍数。
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