CN111593077A - 一种生物催化制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法 - Google Patents

一种生物催化制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物催化制备(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法，属于生物技术领域，通过酮还原酶突变体能将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，酮还原酶突变体源于Meyerozyma guilliermondii的野生型酮还原酶，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.4。本发明整个体系使用单酶或双酶催化，使用葡萄糖或醇类用于辅酶循环，底物浓度高达120g/L‑200g/L，手性纯度大于99％，底物用量/NAD用量高达3017∶1，辅酶循环次数高，有效的扩大了下游应用范围。

Description

一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
技术领域
本发明涉及一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，属于生物技 术领域。
背景技术
酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。 (R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学 活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合 物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性， 另一个对映体却具有基因毒性作用。因此，在药用和农药用活性化合物的合成 中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。
手性纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的手性醇。(R)-CHBE(4-氯-3- 羟基丁酸乙酯)已经被用作(R)-肉碱，R-4-氨基-3-羟基丁酸，(R)-4-羟基-2-吡咯 烷酮和其他五烯化学品的主要前体。并且近年来有报道将(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙 酯用于超级他汀类药物的新合成路线，有望打破原合成工艺的专利垄断。一些 属于SDRs的氧化还原酶已被筛选并应用于生物还原4-氯乙酰乙酸乙酯为CHBE (4-氯-3-羟基丁酸乙酯)。大多数报道的微生物酶产生的都是(S)型CHBE，并同 时具有高对映选择性和高产率。但是，仅有极少有酶能产生(R)型CHBE，并伴 随立体选择性较低(如70％e.e.)或产率低等特性。许等人报道了一株产酮的 芽孢杆菌还原酶，其中一个羰基还原酶能转化COBE为(R)-CHBE(99.6％e.e.)，收率为91.7％，但是需要用到水-甲苯两相系统，底物需要分三次加入反应体系， 增加了生产成本并加重了生产负担；并且该催化体系活力偏低，需要依赖投入 大量的酶或细胞才能使反应结束(0.5g干细胞催化2.158g底物)，对于市场需用 量大价格低廉的中间体CHBE来说该工艺几乎不具有放大前景。
日本人Kataoka等使用Sporobolomyces salmonicolor来源的酮还原酶被用来 做(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，底物浓度高达300gL，但是只有92％的手性纯度， 无法应用于对手性纯度高要求的药物合成。
中国专利CN104988085A利用(R)4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的生物合 成方法，以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)及其衍生物为起始原料，利用重组E.coli CCZU-H15静息细胞为生物催化剂，以葡萄糖为辅底物，实现了(R)-CHBE及其 衍生物的合成。
中国专利CN103160547中利用Candida albicans来源的醇脱氢酶不对称还原 4-氯乙酰乙酸乙酯制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯，以醇脱氢酶为催化剂，以4-氯 乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁 酸乙酯。但是底物浓度仅为25g/L-50g/L，且投酶量过高(5g菌体/25ml体系)， 转化率低，不具备工业生产前景。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 的方法。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其源于Meyerozymaguilliermondii的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3- 羟基丁酸乙酯，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQ ID NO.8 具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：R13K，G77D，N89G， T92A，L97N，F131Y，T138P，L146I，G149N，L150V，M154V，V157A，L166Y， V169I，H170K，L176V，A180S，N200A，Y201F，C203A，C208V，C247V， G248S，L278F，S283L，R285L，G295W，W307L，T309S，Q327E，K330E，R331K，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.2。
一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该酮还原酶突变体的酶 活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-10倍。
一种多核苷酸，该多核苷酸的编码由序列为SEQ ID NO.2的酮还原酶重组 的多肽。
一种多核苷酸，该多核苷酸的序列为SEQ ID NO.1。
一种重组质粒，包括表达载体连接序列为SEQ ID NO.1的多核苷。
一种宿主细胞，其包含所述的重组质粒。
一种宿主细胞，该细胞是一种大肠杆菌。
一种宿主细胞，所述重组质粒的密码子已经为在宿主细胞中表达而进行优 化了的密码子。
一种生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，包括在与序列为SEQ ID NO.2 的酮还原酶突变体的存在下，将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸 乙酯。
本发明的有益技术效果：
本专利提供一种医药中间体(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，整个体系 使用单酶或双酶催化，使用葡萄糖或醇类用于辅酶循环，底物浓度高达 120g/L-200g/L，手性纯度大于99％，底物用量/NAD用量高达3017∶1，辅酶循环 次数高，使得(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯生产成本接近(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯， 有效的扩大了下游应用范围。
本发明人发现，微生物Meyerozyma guilliermondii中天然存在的野生型酮还 原酶，具有将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的潜力。本公 开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与Meyerozyma guilliermondii产生的野生型酮还原酶(SEQ ID NO：8)相比表现出增加的催化活 性。″野生型酮还原酶″、″野生型KRED酶″及″野生型KRED酮还原酶″指 由源自Meyerozyma guilliermondii的具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的酮还原酶。 该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。″野生型″指与 自然中所发现的一样的材料或物质的形式。实施例如野生型的蛋白质或核酸序 列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序 列形式。″增加的催化活性″指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶 相比，表现出使底物(实施例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(实施例如(R)-4- 氯-3-羟基丁酸乙酯)转化速率增加的酮还原酶。
本发明提供一种酮还原酶突变体，其源于Meyerozyma guilliermondii的野生 型酮还原酶，表现出使底物(实施例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(实施例如 (R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化速率增加的酮还原酶。所述酮还原酶突变体，与 SEQ ID NO.8的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和 编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突 变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和 定向进化方法等获得。
上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变：
R13K，G77D，N89G，T92A，L97N，F131Y，T138P，L146I，G149N，L150V， M154V，V157A，L166Y，V169I，H170K，L176V，A180S，N200A，Y201F， C203A，C208V，C247V，G248S，L278F，S283L，R285L，G295W，W307L， T309S，Q327E，K330E，R331K。
上述酮还原酶突变体，优先自序列SEQ ID NO.4。全长突变的酮还原酶对于 保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类 似物和有催化活性的片段。实施例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个 氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评 估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影 响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。实施例如，额外氨基酸 序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开 内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段)诸如通过助溶标签(如SUMO蛋白)、纯化标签(如结合金属的His标签) 和细菌定位信号(如分泌信号)的实施例而非限制的方式被融合到其它蛋白 质。
本发明提供一种酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活 性至少增强2-10倍。
上述酮还原酶突变体编码序列，其优选自SEQ ID NO.3，其已经过序列优化 以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特 定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使 用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化 的密码子。本发明提供一种重组质粒，在一些实施方案中，控制序列包括启动 子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对 于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体 T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠杆菌tac操纵子等。
附图说明
图1为Mgu-3的表达质粒图谱。
图2为Mgu-CK，Mgu-1，Mgu-2，Mgu-3，生物转化反应21小时的TLC 图谱，从左至右依次为Mgu-CK，Mgu-1，Mgu-2，Mgu-3，上方黄色条带为底 物，下方白色条带为产物。
图3为Mgu-2在不同反应条件下生物转化20小时的TLC图谱，从左至右 依次为实施例12，实施例13，实施例14，实施例15的反应结果。
图4为Mgu-3在200g/L底物浓度下生物转化5.5小时的TLC图谱，从左至 右依次为实施例16，实施例17，实施例18的反应结果。
图5为手性检测图谱，自上而下依次为S型标准品，R型标准品，对照反 应实施例19产物，实施例10产物。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例 及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如图1-图5所示，本实施例提供的生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的 方法，通过以下是实施例实现。
实施例1：
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整， 以实现在大肠杆菌中的高表达。
利用Primer Premier(http：//primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER (http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内， 引物长度控制在60base以内，得到拼接引物。
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中， 使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
2mM dNTP mix(2mM each dNTP) 5μl
10×Pfu buffer 5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 使得反应体系总体积至50μl
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进 行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片 段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取 单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQID NO.1，命名为Mgu-1，其对 应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例2：
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整， 以实现在大肠杆菌中的高表达。
利用Primer Premier(http：//primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER (http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内， 引物长度控制在60base以内，得到拼接引物。
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中， 使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
2mM dNTPmix(2mM each dNTP) 5μl
10×Pfu buffer 5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 使得反应体系总体积至50μl
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进 行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片 段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取 单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQID NO.3，命名为Mgu-2，其对 应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
实施例3：
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整， 以实现在大肠杆菌中的高表达。
利用Primer Premier(http：//primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER (http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内， 引物长度控制在60base以内，得到拼接引物。
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中， 使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
2mM dNTP mix(2mM each dNTP) 5μl
10×Pfu buffer 5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 使得反应体系总体积至50μl
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进 行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片 段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取 单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQID NO.5，命名为Mgu-3，其对 应的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
实施例4：
参考蛋白Ssa-CK基因序列的合成：
根据U26463.1所示源自Sporidiobolus salmonicolor的基因序列，委托上海 捷瑞生物对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pET30a中，得到对照 蛋白表达质粒Ssa-CK，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。
实施例5：
参考蛋白Mgu-CK基因序列的合成：
根据EDK37381.2所示序列，委托上海捷瑞生物对该蛋白的编码序列进行全 基因合成，并克隆至pET30a中，得到对照蛋白表达质粒Mgu-CK，其对应的氨 基酸序列为SEQ IDNO.8。
实施例6：
摇瓶表达测试：
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中： 胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L， 氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L， 甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。 次日取1L三角瓶，按1∶100的接种比实施例接入到100ml高压灭菌后的培养 基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾 3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养 至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG 至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养 液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两 次，收集菌体，-70℃保存。同时取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行 SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存。
实施例7：
分批补料发酵：
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容 量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L， 葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。初级接种 菌种制备200ml培养物，OD2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃， 发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制， 而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中， 当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵 母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为35.0(湿重约为60g/L)时，用0.2mM IPTG诱导16小时。取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测， 并将粗酶液-20℃保存。
实施例8：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，120ml异丙醇，50ml Mgu-CK粗酶液，终浓度1mM的 NAD，混匀2分钟，再加入取120g4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反 应。并在21小时取样保存。
实施例9：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，120ml异丙醇，50ml Mgu-1酶，终浓度1mM的NAD， 混匀2分钟，再加入取120g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在21小时取样保存。
实施例10：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，120ml异丙醇，50ml Mgu-2酶，终浓度1mM的NAD， 混匀2分钟，再加入取120g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在21小时取样保存。
实施例11：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，120ml异丙醇，50ml Mgu-3酶，终浓度1mM的NAD， 混匀2分钟，再加入取120g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在21小时取样保存。将实施例8，实施例9，实施例10，实施例11样品进行薄 层色谱分析，反应结果见图2。
实施例12：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，120ml异丙醇，100g Mgu-2酶，终浓度0.3mM的NAD，， 混匀2分钟，再加入取160g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在20小时取样保存。
实施例13：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，90ml异丙醇，75g Mgu-2酶，终浓度0.3mM的NAD，， 混匀2分钟，再加入取120g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在20小时取样保存。
实施例14：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，120ml异丙醇，100g Mgu-2酶终浓度0.15mM的NAD，， 混匀2分钟，再加入取160g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在20小时取样保存。
实施例15：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入680ml缓冲液(含0.1M PB 7.0缓冲液，10％ 甘油，1mM氯化锌)，90ml异丙醇，75g Mgu-2酶，终浓度0.15mM的NAD，， 混匀2分钟，再加入取120g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应。并 在20小时取样保存。将实施例12，实施例13，实施例14，实施例15样品进行 薄层色谱分析，反应结果见图3。
实施例16：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入100ml 1M PB pH7.0缓冲液，300ml纯水，300g 一水葡萄糖，200mg NAD，1mM氯化锌，50ml Mgu-3酶液，10ml枯草芽胞 杆菌来源葡萄糖脱氢酶粗酶液，补水至总体系830ml，预混2分钟，加入200g 4- 氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应，并用5M NaOH控制pH约7.0。 并在5.5小时取样保存。
实施例17：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入100ml 1M PB pH7.0缓冲液，300ml纯水，300g 一水葡萄糖，66mg NAD，1mM氯化锌，100ml Mgu-3酶液，10ml枯草芽胞 杆菌来源葡萄糖脱氢酶粗酶液，补水至总体系830ml，预混2分钟，加入200g 4- 氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应，并用5M NaOH控制pH约7.0。 并在5.5小时取样保存。
实施例18：
生物转化反应：
在3L的三口烧瓶中依次加入100ml 1M PB pH7.0缓冲液，300ml纯水，300g 一水葡萄糖，100mg NAD，1mM氯化锌，66ml Mgu-3酶液，10ml枯草芽 胞杆菌来源葡萄糖脱氢酶粗酶液，补水至总体系830ml，预混2分钟，加入200g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应，并用5M NaOH控制pH约7.0。 并在5.5小时取样保存。将实施例16，实施例17，实施例18的样品进行薄层色 谱分析，反应结果见图4。
实施例19：
对照酶Ssa-CK转化反应：
由于Ssa-CK在单一水相中催化4-氯乙酰乙酸乙酯的反应中酶活很低，无法 有效催化150g/L或200g/L的底物浓度，故调整了反应体系使底物尽量反应完全。 在3L的三口烧瓶中依次加入100ml 1M PB pH7.0缓冲液，300ml纯水，150g一 水葡萄糖，终浓度1mM的NAD，1mM氯化锌，100ml Ssa-CK粗酶液，10ml 枯草芽胞杆菌来源葡萄糖脱氢酶粗酶液，补水至总体系830ml，预混2分钟，加 入100g 4-氯乙酰乙酸乙酯，混匀后调节水浴25℃反应，并用5MNaOH控制pH 约7.0。手性纯度结果显示只有90.27％。
实施例20：
薄层色谱分析：
取少量反应液用乙酸乙酯按照1∶3比实施例进行萃取，并取0.5ul在硅胶板 上点样，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯按3∶1混匀，吹干后高锰酸钾显色。
实施例21：
酶活检测：
取6个5ml离心管，分别标号1-6，分别加入3mM的NADH溶液0ul，40ul， 80ul，100ul，120ul，160ul，然后每管补加0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液补足 3ml，混匀后在340nm下检测并记录吸光度的值；根据上述测得值，得到NADH 的标准曲线Y＝k*X，其中Y为吸光度的值，X为NADH的浓度(mM)，曲线 的R2＞99.5％；用纯水按一定的倍数稀释酶液(参考稀释倍数：600-1000倍)， 稀释的倍数使每分钟吸光值变化0.02-0.04之间为合适；取5ml离心管，按以下 比实施例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。
检测试剂 用量
异丙醇 500ul
2％NAD 100uL
100mM PBS(pH 7.0) 2.35mL
稀释后的酶液 50uL
在340nm处检测吸光度的变化，每隔1min记录一个值，每分钟的变化率基 本相同，其中0min的吸光度为S0，3min的吸光度为S3；
酶活计算公式：
酶活(U/ml)＝[(S0-S3)*3ml*N]/[k×时间(t/min)×加酶量(ml)]
其中，N为酶液的稀释倍数。
检测结果如下：
Figure BDA0002345544960000121
Figure BDA0002345544960000131
实施例22：
手性纯度测定：
以S型产物及R型产物的标准品做为参照，对上述反应产物进行提纯后检 测手性纯度，测定条件如下：
ChiralpakAD-3，4.6x100mm，3um；
Hold 5％for 0.5min；
5-50％in 2.5min；
MeCN；3mL/min；
160bar；
25℃；
APCI(+)；
0.05uL injection；
SIM＝167
检测结果见下表，原始图谱见图5。
反应 手性纯度
实施例10 99.98％
实施例19Ssa-CK对照 90.27％
可见，本发明提供的酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶 的活性至少增强2-10倍。与野生型酮还原酶相比，使底物4-氯乙酰乙酸乙酯向 产物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯转化速率增加，且进一步的增加了单位体积的底 物浓度，利于工业放大时提高生产效率。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的 技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京朗恩生物科技有限公司
<120> 一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
<130> 2019
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgctgccgt ctatccagac cgcttacacc ttcaaacgtg gttctcgtga aatcgttcgt 60
cgtgacgact ggccggttcc gcacccggaa gacaaccagg ttctgctgaa agttgaagct 120
gttggtctgt gcatgtctga cctgcacatc ctgatggctc aggaaaccca cgttccggaa 180
accttcgtta tgggtcacga aatcgctggt tctatcgctg ctgttggtgg taaactggaa 240
tctgacccgc gttacaaagt tggtggtcgt ttcaccgttt gcatcggtct gacctgcggt 300
cgttgcgcta actgccgtaa cggtcacgac aactgctgca ccggtaacgg taaattcccg 360
ggtgcttacg gtctgaaccg tgacggtggt ttccagcagt acctgctggt tccggacctg 420
aacaccctgc tgccgctgcc ggacggtctg tcttacgaaa tggctgctgt ttcttctgac 480
gctgttctga ccccgctgca cgctgttcac aaagttaaac cggacctggt tccgaccgct 540
aaaatcctgg ttatgggtct gggtggtctg ggttctaacg ctgttcagat catcaaaaac 600
tacggttgcc acgttgttgc tgttgacgtt aaaccggaac tggaagaatt cgctcgtcag 660
tgcggtgctg acgaattcta caccgacatc aactcttctc cgcacaaacc ggaatctttc 720
gacgtttgct tcgacttctg cggtttccag gaaaccttcg acgtttgcca gaaatacgct 780
cagtctggtg gtaaaatcgt tgttgttggt ctgggtcgtt ctaaactgat gctgcgtaac 840
tacgactctg ctctgcgttc tctgcaggtt atcttctctt tctggggtac cgcttcttct 900
caggaacagt ctctgcagtg ggttaccaaa ggtctggtta aaccgatggt taccaacggt 960
gacttcgctg aactgccgca gtacctgaaa cgtctggcta aaggtgaagt taaaggtcgt 1020
gttgttttcc gtccgtctaa actgtaa 1047
<210> 2
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Met Leu Pro Ser Ile Gln Thr Ala Tyr Thr Phe Lys Arg Gly Ser Arg
1 5 10 15
Glu Ile Val Arg Arg Asp Asp Trp Pro Val Pro His Pro Glu Asp Asn
20 25 30
Gln Val Leu Leu Lys Val Glu Ala Val Gly Leu Cys Met Ser Asp Leu
35 40 45
His Ile Leu Met Ala Gln Glu Thr His Val Pro Glu Thr Phe Val Met
50 55 60
Gly His Glu Ile Ala Gly Ser Ile Ala Ala Val Gly Gly Lys Leu Glu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Arg Tyr Lys Val Gly Gly Arg Phe Thr Val Cys Ile Gly
85 90 95
Leu Thr Cys Gly Arg Cys Ala Asn Cys Arg Asn Gly His Asp Asn Cys
100 105 110
Cys Thr Gly Asn Gly Lys Phe Pro Gly Ala Tyr Gly Leu Asn Arg Asp
115 120 125
Gly Gly Phe Gln Gln Tyr Leu Leu Val Pro Asp Leu Asn Thr Leu Leu
130 135 140
Pro Leu Pro Asp Gly Leu Ser Tyr Glu Met Ala Ala Val Ser Ser Asp
145 150 155 160
Ala Val Leu Thr Pro Leu His Ala Val His Lys Val Lys Pro Asp Leu
165 170 175
Val Pro Thr Ala Lys Ile Leu Val Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser
180 185 190
Asn Ala Val Gln Ile Ile Lys Asn Tyr Gly Cys His Val Val Ala Val
195 200 205
Asp Val Lys Pro Glu Leu Glu Glu Phe Ala Arg Gln Cys Gly Ala Asp
210 215 220
Glu Phe Tyr Thr Asp Ile Asn Ser Ser Pro His Lys Pro Glu Ser Phe
225 230 235 240
Asp Val Cys Phe Asp Phe Cys Gly Phe Gln Glu Thr Phe Asp Val Cys
245 250 255
Gln Lys Tyr Ala Gln Ser Gly Gly Lys Ile Val Val Val Gly Leu Gly
260 265 270
Arg Ser Lys Leu Met Leu Arg Asn Tyr Asp Ser Ala Leu Arg Ser Leu
275 280 285
Gln Val Ile Phe Ser Phe Trp Gly Thr Ala Ser Ser Gln Glu Gln Ser
290 295 300
Leu Gln Trp Val Thr Lys Gly Leu Val Lys Pro Met Val Thr Asn Gly
305 310 315 320
Asp Phe Ala Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Lys Arg Leu Ala Lys Gly Glu
325 330 335
Val Lys Gly Arg Val Val Phe Arg Pro Ser Lys Leu
340 345
<210> 3
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgctgccgt ctatccagac cgcttacacc ttcaaaaaag gttctcgtga aatcgttcgt 60
cgtgacgact ggccggttcc gcacccggaa gacaaccagg ttctgctgaa agttgaagct 120
gttggtctgt gcatgtctga cctgcacatc ctgatggctc aggaaaccca cgttccggaa 180
accttcgtta tgggtcacga aatcgctggt tctatcgctg ctgttggtgg taaactggaa 240
tctgacccgc gttacaaagt tggtaaccgt ttcaccgttt gcatcggtct gacctgcggt 300
cgttgcgcta actgccgtaa cggtcacgac aactgctgca ccggtaacgg taaattcccg 360
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aacaccctgc tgccgatccc ggacggtctg tcttacgaag ttgctgctgt ttcttctgac 480
gctgttctga ccccgtacca cgctgttcac aaagttaaac cggacctggt tccgaccgct 540
aaaatcctgg ttatgggtct gggtggtctg ggttctaacg ctgttcagat catcaaaaac 600
tacggttgcc acgttgttgc ttgcgacgtt aaaccggaac tggaagaatt cgctcgtcag 660
tgcggtgctg acgaattcta caccgacatc aactcttctc cgcacaaacc ggaatctttc 720
gacgtttgct tcgacttcgt ttctttccag gaaaccttcg acgtttgcca gaaatacgct 780
cagtctggtg gtaaaatcgt tgttgttggt ctgggtcgtt ctaaactgat gttccgtaac 840
tacgacctgg ctcgtcgttc tctgcaggtt atcttctctt tcggtggtac cgcttcttct 900
caggaacagt ctctgcagct ggtttctaaa ggtctggtta aaccgatggt taccaacggt 960
gacttcgctg aactgccgca gtacctgaaa cgtctggcta aaggtgaagt taaaggtcgt 1020
gttgttttcc gtccgtctaa actgtaa 1047
<210> 4
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Met Leu Pro Ser Ile Gln Thr Ala Tyr Thr Phe Lys Lys Gly Ser Arg
1 5 10 15
Glu Ile Val Arg Arg Asp Asp Trp Pro Val Pro His Pro Glu Asp Asn
20 25 30
Gln Val Leu Leu Lys Val Glu Ala Val Gly Leu Cys Met Ser Asp Leu
35 40 45
His Ile Leu Met Ala Gln Glu Thr His Val Pro Glu Thr Phe Val Met
50 55 60
Gly His Glu Ile Ala Gly Ser Ile Ala Ala Val Gly Gly Lys Leu Glu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Arg Tyr Lys Val Gly Asn Arg Phe Thr Val Cys Ile Gly
85 90 95
Leu Thr Cys Gly Arg Cys Ala Asn Cys Arg Asn Gly His Asp Asn Cys
100 105 110
Cys Thr Gly Asn Gly Lys Phe Pro Gly Ala Tyr Gly Leu Asn Arg Asp
115 120 125
Gly Gly Phe Gln Gln Tyr Leu Leu Val Thr Asp Leu Asn Thr Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Pro Asp Gly Leu Ser Tyr Glu Val Ala Ala Val Ser Ser Asp
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Ala Val Leu Thr Pro Tyr His Ala Val His Lys Val Lys Pro Asp Leu
165 170 175
Val Pro Thr Ala Lys Ile Leu Val Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser
180 185 190
Asn Ala Val Gln Ile Ile Lys Asn Tyr Gly Cys His Val Val Ala Cys
195 200 205
Asp Val Lys Pro Glu Leu Glu Glu Phe Ala Arg Gln Cys Gly Ala Asp
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Glu Phe Tyr Thr Asp Ile Asn Ser Ser Pro His Lys Pro Glu Ser Phe
225 230 235 240
Asp Val Cys Phe Asp Phe Val Ser Phe Gln Glu Thr Phe Asp Val Cys
245 250 255
Gln Lys Tyr Ala Gln Ser Gly Gly Lys Ile Val Val Val Gly Leu Gly
260 265 270
Arg Ser Lys Leu Met Phe Arg Asn Tyr Asp Leu Ala Arg Arg Ser Leu
275 280 285
Gln Val Ile Phe Ser Phe Gly Gly Thr Ala Ser Ser Gln Glu Gln Ser
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Leu Gln Leu Val Ser Lys Gly Leu Val Lys Pro Met Val Thr Asn Gly
305 310 315 320
Asp Phe Ala Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Lys Arg Leu Ala Lys Gly Glu
325 330 335
Val Lys Gly Arg Val Val Phe Arg Pro Ser Lys Leu
340 345
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
atgctgccgt ctatccagac cgcttacacc ttcaaacgtg gttctcgtga aatcgttcgt 60
cgtgacgact ggccggttcc gcacccggaa gacaaccagg ttctgctgaa agttgaagct 120
gttggtctgt gcatgtctga cctgcacatc ctgatggctc aggaaaccca cgttccggaa 180
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tctgacccgc gttacaaagt tggtaaccgt ttcgctgttt gcatcggtaa cacctgcggt 300
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ggtgcttacg gtctgaaccg tgacggtggt taccagcagt acctgctggt taccgacctg 420
aacaccctgc tgccgatccc ggacaacgtt tcttacgaag ttgctgctgc ttcttctgac 480
gctgttctga ccccgtacca cgctatcaaa aaagttaaac cggacgttgt tccgacctct 540
aaaatcctgg ttatgggtct gggtggtctg ggttctaacg ctgttcagat catcaaagct 600
ttcggtgctc acgttgttgc ttgcgacgtt aaaccggaac tggaagaatt cgctcgtcag 660
tgcggtgctg acgaattcta caccgacatc aactcttctc cgcacaaacc ggaatctttc 720
gacgtttgct tcgacttctg cggtttccag gaaaccttcg acgtttgcca gaaatacgct 780
cagtctggtg gtaaaatcgt tgttgttggt ctgggtcgtt ctaaactgat gctgcgtaac 840
tacgactctg ctcgtcgttc tctgcaggtt atcttctctt tctggggtac cgcttcttct 900
caggaacagt ctctgcagtg ggttaccaaa ggtctggtta aaccgatggt taccaacggt 960
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gttgttttcc gtccgtctaa actgtaa 1047
<210> 6
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Met Leu Pro Ser Ile Gln Thr Ala Tyr Thr Phe Lys Arg Gly Ser Arg
1 5 10 15
Glu Ile Val Arg Arg Asp Asp Trp Pro Val Pro His Pro Glu Asp Asn
20 25 30
Gln Val Leu Leu Lys Val Glu Ala Val Gly Leu Cys Met Ser Asp Leu
35 40 45
His Ile Leu Met Ala Gln Glu Thr His Val Pro Glu Thr Phe Val Met
50 55 60
Gly His Glu Ile Ala Gly Ser Ile Ala Ala Val Gly Asp Lys Leu Glu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Arg Tyr Lys Val Gly Asn Arg Phe Ala Val Cys Ile Gly
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Asn Thr Cys Gly Arg Cys Ala Asn Cys Arg Asn Gly His Asp Asn Cys
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Cys Thr Gly Asn Gly Lys Phe Pro Gly Ala Tyr Gly Leu Asn Arg Asp
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Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Leu Leu Val Thr Asp Leu Asn Thr Leu Leu
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Pro Ile Pro Asp Asn Val Ser Tyr Glu Val Ala Ala Ala Ser Ser Asp
145 150 155 160
Ala Val Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Lys Val Lys Pro Asp Val
165 170 175
Val Pro Thr Ser Lys Ile Leu Val Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser
180 185 190
Asn Ala Val Gln Ile Ile Lys Ala Phe Gly Ala His Val Val Ala Cys
195 200 205
Asp Val Lys Pro Glu Leu Glu Glu Phe Ala Arg Gln Cys Gly Ala Asp
210 215 220
Glu Phe Tyr Thr Asp Ile Asn Ser Ser Pro His Lys Pro Glu Ser Phe
225 230 235 240
Asp Val Cys Phe Asp Phe Cys Gly Phe Gln Glu Thr Phe Asp Val Cys
245 250 255
Gln Lys Tyr Ala Gln Ser Gly Gly Lys Ile Val Val Val Gly Leu Gly
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Arg Ser Lys Leu Met Leu Arg Asn Tyr Asp Ser Ala Arg Arg Ser Leu
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Gln Val Ile Phe Ser Phe Trp Gly Thr Ala Ser Ser Gln Glu Gln Ser
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Leu Gln Trp Val Thr Lys Gly Leu Val Lys Pro Met Val Thr Asn Gly
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Asp Phe Ala Glu Leu Pro Glu Tyr Leu Glu Lys Leu Ala Lys Gly Glu
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<210> 7
<211> 323
<212> PRT
<213> Sporidiobolus salmonicolor
<400> 7
Met Val Gly Thr Thr Thr Leu Asn Thr Gly Ala Ser Leu Glu Leu Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Ala Pro Gly Glu Val Gly Gln Gly Val
20 25 30
Lys Val Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala Lys Val
35 40 45
Tyr Ser Asn Gln Pro Glu Val Gly Ala Ala Ile Lys Glu Ala Gly Val
50 55 60
Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Asn Asn Ser His
65 70 75 80
Arg Pro Glu Gln Val Glu Pro Ala Leu Asp Asp Thr Leu Lys Glu Leu
85 90 95
Gly Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Val Ala Phe
100 105 110
Pro Pro Glu Gly Asp Ile Thr Gln Asn Leu Phe Pro Lys Ala Asn Asp
115 120 125
Lys Glu Val Lys Leu Asp Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Thr Trp Lys
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Ala Met Val Lys Leu Leu Asp Thr Gly Lys Val Lys Ala Ile Gly Val
145 150 155 160
Ser Asn Phe Asp Ala Lys Met Val Asp Ala Ile Ile Glu Ala Thr Gly
165 170 175
Val Thr Pro Ser Val Asn Gln Ile Glu Arg His Pro Leu Leu Leu Gln
180 185 190
Pro Glu Leu Ile Ala His His Lys Ala Lys Asn Ile His Ile Thr Ala
195 200 205
Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Thr Val Gly Ala Pro Leu Leu Val Gln
210 215 220
His Pro Glu Ile Lys Arg Ile Ala Glu Lys Asn Gly Cys Thr Pro Ala
225 230 235 240
Gln Val Leu Ile Ala Trp Ala Ile Val Gly Gly His Ser Val Ile Pro
245 250 255
Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Gly Glu Asn Phe Lys Gln Val Ser
260 265 270
Leu Ser Gln Glu Asp Val Asp Ala Val Ser Lys Leu Gly Glu Gly Ser
275 280 285
Gly Arg Arg Arg Tyr Asn Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Pro Lys Trp Asp
290 295 300
Ile Asn Val Phe Gly Glu Glu Asp Glu Lys Ser Cys Lys Asn Ala Val
305 310 315 320
Lys Ile Lys
<210> 8
<211> 348
<212> PRT
<213> Meyerozyma guilliermondii
<400> 8
Met Leu Pro Ser Ile Gln Thr Ala Tyr Thr Phe Lys Arg Gly Ser Arg
1 5 10 15
Glu Ile Val Arg Arg Asp Asp Trp Pro Val Pro His Pro Glu Asp Asn
20 25 30
Gln Val Leu Leu Lys Val Glu Ala Val Gly Leu Cys Met Ser Asp Val
35 40 45
His Ile Leu Met Ala Gln Glu Thr His Val Pro Glu Thr Phe Val Met
50 55 60
Gly His Glu Ile Ala Gly Ser Ile Ala Ala Val Gly Gly Lys Leu Glu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Arg Tyr Lys Val Gly Asn Arg Phe Thr Val Cys Ile Gly
85 90 95
Leu Thr Cys Gly Arg Cys Ala Asn Cys Arg Asn Gly His Asp Asn Cys
100 105 110
Cys Thr Gly Asn Gly Lys Phe Pro Gly Ala Tyr Gly Leu Asn Arg Asp
115 120 125
Gly Gly Phe Gln Gln Tyr Leu Leu Val Thr Asp Leu Asn Thr Leu Leu
130 135 140
Pro Leu Pro Asp Gly Leu Ser Tyr Glu Met Ala Ala Val Ser Ser Asp
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Pro Leu His Ala Val His Lys Val Lys Pro Asp Leu
165 170 175
Val Pro Thr Ala Lys Ile Leu Val Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser
180 185 190
Asn Ala Val Gln Ile Ile Lys Asn Tyr Gly Cys His Val Val Ala Cys
195 200 205
Asp Val Lys Pro Glu Leu Glu Glu Phe Ala Arg Gln Cys Gly Ala Asp
210 215 220
Glu Phe Tyr Thr Asp Ile Asn Ser Ser Pro His Lys Pro Glu Ser Phe
225 230 235 240
Asp Val Cys Phe Asp Phe Cys Gly Phe Gln Glu Thr Phe Asp Ser Cys
245 250 255
Gln Lys Tyr Ala Gln Ser Gly Gly Lys Ile Val Val Val Gly Leu Gly
260 265 270
Arg Ser Lys Leu Met Leu Arg Asn Tyr Asp Ser Ala Arg Arg Ser Leu
275 280 285
Gln Val Ile Phe Ser Phe Gly Gly Thr Ala Ser Ser Gln Glu Gln Ser
290 295 300
Leu Gln Trp Val Thr Lys Gly Leu Val Lys Pro Met Val Thr Asn Gly
305 310 315 320
Asp Phe Ala Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Lys Arg Leu Ala Lys Gly Glu
325 330 335
Val Lys Gly Arg Val Val Phe Arg Pro Ser Lys Leu
340 345

Claims (8)

1.一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，通过酮还原酶突变体能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，酮还原酶突变体源于Meyerozyma guilliermondii的野生型酮还原酶，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQ ID NO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：R13K，G77D，N89G，T92A，L97N，F131Y，T138P，L146I，G149N，L150V，M154V，V157A，L166Y，V169I，H170K，L176V，A180S，N200A，Y201F，C203A，C208V，C247V，G248S，L278F，S283L，R285L，G295W，W307L，T309S，Q327E，K330E，R331K，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.4。
2.根据权利要求1所述的一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，该酮还原酶突变体的酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-10倍。
3.一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的编码由序列为SEQ ID NO.4的酮还原酶重组的多肽。
4.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列为SEQ IDNO.3。
5.一种重组质粒，其特征在于，包括表达载体连接序列为SEQ ID NO.3的多核苷。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其包含如权利要求5的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的一种宿主细胞，其特征在于，该细胞是一种大肠杆菌。
8.根据权利要求7所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述重组质粒的密码子已经为在宿主细胞中表达而进行优化了的密码子。
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